之前有提過有個有關阿茲海默症(Alzheimer's disease, AD)的理論是 amyloid-β (Aβ) 是會傳染的，開始的原因是這樣的：
從二十世紀中期開始，生長激素(growth hormone, GH)被用來治療生長激素嚴重不足(growth hormone deficiency, GHD)的孩童，那時候的生長激素來源是從過世者的腦下垂體(pituitary gland)中萃取出來的(cadaveric-derived human growth hormone, c-hGH)，這個方法在北美進行了近三十年，治療了全球共約三萬五千位孩童，直到 1985 年的時候，美國 FDA 收到報告說有四位曾經接受 c-hGH 治療的成人得到 Creutzfeldt–Jakob disease (CJD)[註] 後才停止。之後直到 2012 年全球有約兩百多人因此得到 CJD，經過確認後發現是因為那批 c-hGH 受到 prion 感染。但是除此之外，有八位因為接受 c-hGH 治療的人在過世後解剖時，發現腦部有嚴重的 Aβ 堆積，而這些人都還只是中壯年(36-51 yrs)而已，並且未帶有阿茲海默症的致病突變，那他們的 AD 症狀是怎麼來的呢？
註：prion protein (PrP) 是哺乳類動物本生就有的蛋白(cellular PrP)，但是當它錯誤折疊(misfolded)的時候 -- scrapie PrP，便會引起腦神經性疾病且具傳染性，在人類身上會引起 CJD，在牛身上會引發狂牛症(bovine spongiform encephalopathy, BSE)。
之前也有動物實驗顯示，當把 Aβ 病患的腦部萃取物打入健康老鼠體內後，老鼠腦部也出現 Aβ 堆積。以上種種，於是有學者們認為因為那批 c-hGH 除了受到 prion 感染，同時也有 Aβ 的污染，那八位受過 c-hGH 治療的病患之所以腦部有 Aβ 堆積是因為 Aβ 跟 prion 同樣具傳染性。
前情提要：阿茲海默症是會傳染的嗎？
為了確認這個理論是否正確，這篇研究的作者們找到了當年帶有 prion 的那批生長激素 -- 雖然已過了三十多年。當年準備生長激素的方法有很多種，純化過程有過 size exclusion column (SEC) 的被認為可以降低 prion 的污染，而其中有一種萃取法為 Hartree-modified Wilhelmi procedure (HWP)，是沒經過 SEC 這個步驟的，當初接受治療且得到得到 CJD 的病患用的那批 c-hGH 都是用 HWP 方法萃取出來的。
他們從英國的 Public Health England 那得到了當年的那幾批生長激素，然後檢測裡面是否有 Aβ 和 tau，結果發現所有用 HWP 方法萃取的 c-hGH 都含有 Aβ40 和 tau，另外除了一罐沒有 Aβ42 以外，其他用 HWP 純化的也都有 Aβ42 (他們取得的 HWP 純化的共有五罐)。用其他方法純化的則沒有檢測到任何 Aβ 和 tau。（關於阿茲海默症的致病蛋白和突變基因可點這篇參考）
再來就是檢測這些含有 Aβ 和 tau 的生長激素是否真的能在體內形成 Aβ plaque，他們用的是帶有人類 APP 突變的基轉老鼠，這些老鼠會在六個月大的時候開始出現 Aβ 堆積的徵兆。
實驗是這樣的，他們取得三位 AD 患者的腦部檢體和一位健康者的腦部檢體，分別打入六到八週大的基轉老鼠腦內，腦部檢體是用 PBS 準備的，所以有一個控制組是只打入 PBS，每組有十五隻老鼠，之後在打入後的第 2, 7, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 240, 360 和 480 天的時候檢視老鼠腦部看有沒有阿茲海默症的其中一個病徵：cerebral Aβ−amyloid angiopathy (CAA) -- 腦部血管出現 Aβ 堆積。結果顯示再打入後第二天所有老鼠都沒有 Aβ 堆積，表示起始點是一樣的。在打入腦部檢體 120 天後，被打入 AD 病患腦部檢體的老鼠，牠們的腦部的某些區塊 -- 像是大腦皮質和海馬迴 -- 開始出現惹 CAA，但是只打入健康者腦部的和 PBS 的老鼠都沒有出現 Aβ。然後在 240 天(約七、八個月)後，老鼠的腦血管裡出現 Aβ，堆積情形以小腦最為明顯，但是打入健康者腦部檢體的和打入 PBS 的老鼠幾乎沒有 Aβ 堆積的情形。在打入腦部檢體快一年後(360 dpi)的情況和 240 天後的差不多，只是堆積情況更嚴重些。
再來，他們想確認人類的生長激素本身會不會對老鼠有影響，所以先用 recombinant hGH (rec-hGH) 做測試，他們打入不同濃度的 rec-hGH (1.2, 3.6, 11mg/ml) 到基轉老鼠腦中，然後在打入後的 240 天後檢測，都未發現有什麼影響，只有在打入高濃度的 rec-hGH (20mg/ml) 後老鼠立刻死亡。
接著便是測試放了三十幾年的 c-hGH 是否能在 AD 基轉老鼠腦中引起 Aβ 堆積。因為剩下的 HWP c-hGH 量並不多，為了有效利用，他們選擇直接打入老鼠的腦部（當初的孩童是由皮下打入），他們同時也加入 rec-hGH 當作控制組，確認生長激素本身並不會引起 Aβ 的堆積，打入的 rec-hGH 劑量比 c-hGH 較多。在這個實驗中，他們有加入另一組控制組，就是把人類腦部檢體、PBS 和 c-hGH 也打入六到八週大的野生鼠(只有老鼠本身的 APP，沒有人類的)。他們在打入後的 240 天後解剖檢視，發現所有野生鼠都沒有 Aβ 堆積的情形，被打入 rec-hGH 的 AD 基轉老鼠腦部也沒有出現 Aβ 堆積和 CAA 的情形，但是呢，被打入 HWP c-hGH 的老鼠腦部有明顯的 Aβ 堆積和 CAA，表示 Aβ 本身是個種子，可以在其他動物體內引起 Aβ 堆積，而且即使過了幾十年都還保有這個特性。
這個結果看起來是滿有力的證據，不過我覺得他們如果有用其他非 HWP 純化的 c-hGH 當做控制組會更有力。另外要注意的是外來的(exogenous) Aβ 並沒有在正常老鼠腦內引起堆積，而是在帶有 APP 突變的基轉老鼠裡，表示要個體本身就有得到 AD 的風險，外來的 Aβ 只是加速疾病的發生和進展。（也許加入表現人類正常 APP 的基轉老鼠當控制組會比較好）
References:
SA Purro et al, Transmission of amyloid-β protein pathology from cadaveric pituitary growth hormone. Nature (2018)
Z Jaunmuktane et al, Evidence for human transmission of amyloid-β pathology and cerebral amyloid angiopathy. Nature (2015)
VS Ayyar, History of growth hormone therapy. Indian J Endocrinol Meta (2011)
2018年12月31日 星期一
2018年12月29日 星期六
肥胖會降低免疫細胞殺死癌細胞的能力
最近這篇研究，讓人稍微了解了一下肥胖和癌症的關係。這篇研究顯示肥胖會使脂肪會堆積在自然殺手細胞(natural killer cells, NK cells)，影響它們的代謝、基因表現和功能，使它們無法正常運作。
自然殺手細胞是一種免疫細胞，除了消滅外來的敵人外，它的其中一個攻擊目標是腫瘤細胞，因此可以限制癌細胞的擴散。自然殺手細胞殺死目標物的方法是分泌一種 lytic granules，這種 granules 裡面有醣蛋白 perforin 和酵素 granzymes (顆粒酶)，但是這個對抗機制需要消耗大量的能量，因此它們需要可以生產 ATP 的 glycolysis。
這篇研究發現肥胖會啟動 PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor; PPAR)，使脂肪堆積在 NK cells，導致它的代謝機制無法運轉，因此無法生產 ATP 去對抗癌細胞。
PPAR 是位於細胞核內的賀爾蒙接受器(nuclear receptor)，同時也是轉錄因子(transcription factor)，調控各種相關基因的表現，包括有脂肪的運送和代謝、肝醣生產等等，因此大量表現在肝臟和心臟等脂肪代謝率高的器官和脂肪組織裡。PPAR 像是一個脂肪探測器，它的配位基(ligand)包括自由脂肪酸(fatty acid)和其衍生物(derivatives)，free fatty acid (FFA) 會啟動 PPAR 和它的 signaling pathway，於是細胞接收到訊息後會開始處理細胞內的脂肪。
Figure: KEGG, Kanehisa Laboratories
在這篇研究裡，老鼠們被餵食高脂肪的食物(high-fat diet, HFD)，然後作者們檢視 NK cells 裡有哪些基因的表現量出現改變。沒想到在八週的高脂肪飲食過後，約有三千個基因的表現量和被餵食正常飲食(standard-fat diet, SFD)的老鼠不一樣，有些控制脂肪代謝的基因表現量升高了，主要多是和 PPAR 相關的，而和 cytotoxicity 還有 mTOR 相關的基因表現則下降了，例如受 mTOR 調節的 granzymes。這些變動顯示肥胖會使 NK cells 轉換它的運作，把它禦敵的功能轉換成以代謝脂肪為主。
接著他們比較了肥胖老鼠和瘦老鼠體內 NK cells 的循環狀態，發現肥胖老鼠體內的 NK cells 循環比較慢，而且它們殺死的腫瘤細胞比較少。除此之外，他們也發現肥胖老鼠的 NK cells 裡面有脂肪球堆積，而細胞內用來殺死目標細胞的 perforin granules 卻減少了。他們也用人類的 NK cells 做測試，在培養液中加入 FFA，NK cells 會從培養液中吸收 FFA 進細胞內，他們發現細胞內越多脂肪球堆積的，perforin granules 就越少，有的甚至沒有，而脂肪堆積也讓 NK cells 喪失殺死癌細胞的能力。另外，因為 granzyme 的表現量是受 mTOR 調控的，mTOR pathway 被啟動後會使 NK cells 開始運作 glycolysis 生產能量，所以他們也檢視惹 mTOR pathway 和 NK cells 間的關係。他們發現當 mTOR pathway 被抑制時，NK cells 的殺敵能力大為下降，而在肥胖的情況下，mTOR 是失能的。他們在培養液裡加了脂肪酸後，NK cells 無法啟動 glycolysis 和 OXPHOS，也因此製造出的 ATP 也少很多。在老鼠試驗中，肥胖老鼠的 NK cells 的代謝率和 glycolysis 效率都比正常飲食的老鼠低很多。
以上結果皆顯示，當周遭環境有很多自由脂肪酸的時候（也就是肥胖），NK cells 會把它的禦敵機能(cytotoxicity, mTOR pathway)和生產能量(glycolysis, OXPHOS)的機制轉換到代謝脂肪(lipid metabolism, PPAR pathway)，因而導致它的免疫殺敵的功能下降，殺死癌細胞的效能也降低了。
既然如此，那啟動 PPAR 會抑制 mTOR 的功能嗎？作者們在培養液裡加惹 FFA 和 PPARα/δ agonists 去啟動 PPAR，結果從瘦子體內取得的 NK cells 開始吸收脂肪，glycolysis 效率降低，而且 perforin 和 granzyme B 的表現量也大為下降；但是當含有 FFA 的培養液裡加入惹 PPARα/δ antagonists 之後，脂肪便不再堆積在 NK cells 的細胞內，而且也沒有 perforin 表現降低的現象。除此之外，他們也找尋到底是在哪個地方降低惹 NK cells 的御敵能力，他們發現當 PPAR 被脂肪酸啟動或是 mTOR 被抑制的時候，NK cells 可以找到癌細胞，但無法釋出 lytic granules 去消滅癌細胞，而且也會抑制 NK cells 的繁殖。
這篇研究的結果看起來是在 NK cells 裡，用來生產能量對抗癌細胞的 glycolysis 和代謝脂肪的 PPAR 只能擇其一，作者最後有提到說有研究顯示用 rapamycin 去抑制 glycolysis，使癌細胞沒有養份增生，但是這篇研究顯示如果抑制 glycolysis 的話也會使 NK cells 無法生產能量殺死癌細胞，因此使用 rapamycin 可能也不是個好方法。
不負責任結論：最好的方法就是不要過胖讓體內有過多的脂肪去抑制 NK cells 的功能。XD
Article:
TN / ‘Fat-clogged’ Immune Cells Fail to Fight Tumors
Papers:
X Michelet et al, Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses. Nature Immunology (2018)
D Fanale et al, The Interplay between Metabolism, PPAR Signaling Pathway, and Cancer. PPAR Research (2017)
M Pawlak et al, Molecular mechanism of PPARα action and its impact on lipid metabolism, inflammation and fibrosis in non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatology (2015)
LR de Armas & ER Podack, Chapter Sixteen - Natural killer cytolytic activity. Basic Science & Clinical App (2010)
自然殺手細胞是一種免疫細胞，除了消滅外來的敵人外，它的其中一個攻擊目標是腫瘤細胞，因此可以限制癌細胞的擴散。自然殺手細胞殺死目標物的方法是分泌一種 lytic granules，這種 granules 裡面有醣蛋白 perforin 和酵素 granzymes (顆粒酶)，但是這個對抗機制需要消耗大量的能量，因此它們需要可以生產 ATP 的 glycolysis。
這篇研究發現肥胖會啟動 PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor; PPAR)，使脂肪堆積在 NK cells，導致它的代謝機制無法運轉，因此無法生產 ATP 去對抗癌細胞。
PPAR 是位於細胞核內的賀爾蒙接受器(nuclear receptor)，同時也是轉錄因子(transcription factor)，調控各種相關基因的表現，包括有脂肪的運送和代謝、肝醣生產等等，因此大量表現在肝臟和心臟等脂肪代謝率高的器官和脂肪組織裡。PPAR 像是一個脂肪探測器，它的配位基(ligand)包括自由脂肪酸(fatty acid)和其衍生物(derivatives)，free fatty acid (FFA) 會啟動 PPAR 和它的 signaling pathway，於是細胞接收到訊息後會開始處理細胞內的脂肪。
Figure: KEGG, Kanehisa Laboratories
在這篇研究裡，老鼠們被餵食高脂肪的食物(high-fat diet, HFD)，然後作者們檢視 NK cells 裡有哪些基因的表現量出現改變。沒想到在八週的高脂肪飲食過後，約有三千個基因的表現量和被餵食正常飲食(standard-fat diet, SFD)的老鼠不一樣，有些控制脂肪代謝的基因表現量升高了，主要多是和 PPAR 相關的，而和 cytotoxicity 還有 mTOR 相關的基因表現則下降了，例如受 mTOR 調節的 granzymes。這些變動顯示肥胖會使 NK cells 轉換它的運作，把它禦敵的功能轉換成以代謝脂肪為主。
接著他們比較了肥胖老鼠和瘦老鼠體內 NK cells 的循環狀態，發現肥胖老鼠體內的 NK cells 循環比較慢，而且它們殺死的腫瘤細胞比較少。除此之外，他們也發現肥胖老鼠的 NK cells 裡面有脂肪球堆積，而細胞內用來殺死目標細胞的 perforin granules 卻減少了。他們也用人類的 NK cells 做測試，在培養液中加入 FFA，NK cells 會從培養液中吸收 FFA 進細胞內，他們發現細胞內越多脂肪球堆積的，perforin granules 就越少，有的甚至沒有，而脂肪堆積也讓 NK cells 喪失殺死癌細胞的能力。另外，因為 granzyme 的表現量是受 mTOR 調控的，mTOR pathway 被啟動後會使 NK cells 開始運作 glycolysis 生產能量，所以他們也檢視惹 mTOR pathway 和 NK cells 間的關係。他們發現當 mTOR pathway 被抑制時，NK cells 的殺敵能力大為下降，而在肥胖的情況下，mTOR 是失能的。他們在培養液裡加了脂肪酸後，NK cells 無法啟動 glycolysis 和 OXPHOS，也因此製造出的 ATP 也少很多。在老鼠試驗中，肥胖老鼠的 NK cells 的代謝率和 glycolysis 效率都比正常飲食的老鼠低很多。
以上結果皆顯示，當周遭環境有很多自由脂肪酸的時候（也就是肥胖），NK cells 會把它的禦敵機能(cytotoxicity, mTOR pathway)和生產能量(glycolysis, OXPHOS)的機制轉換到代謝脂肪(lipid metabolism, PPAR pathway)，因而導致它的免疫殺敵的功能下降，殺死癌細胞的效能也降低了。
既然如此，那啟動 PPAR 會抑制 mTOR 的功能嗎？作者們在培養液裡加惹 FFA 和 PPARα/δ agonists 去啟動 PPAR，結果從瘦子體內取得的 NK cells 開始吸收脂肪，glycolysis 效率降低，而且 perforin 和 granzyme B 的表現量也大為下降；但是當含有 FFA 的培養液裡加入惹 PPARα/δ antagonists 之後，脂肪便不再堆積在 NK cells 的細胞內，而且也沒有 perforin 表現降低的現象。除此之外，他們也找尋到底是在哪個地方降低惹 NK cells 的御敵能力，他們發現當 PPAR 被脂肪酸啟動或是 mTOR 被抑制的時候，NK cells 可以找到癌細胞，但無法釋出 lytic granules 去消滅癌細胞，而且也會抑制 NK cells 的繁殖。
這篇研究的結果看起來是在 NK cells 裡，用來生產能量對抗癌細胞的 glycolysis 和代謝脂肪的 PPAR 只能擇其一，作者最後有提到說有研究顯示用 rapamycin 去抑制 glycolysis，使癌細胞沒有養份增生，但是這篇研究顯示如果抑制 glycolysis 的話也會使 NK cells 無法生產能量殺死癌細胞，因此使用 rapamycin 可能也不是個好方法。
不負責任結論：最好的方法就是不要過胖讓體內有過多的脂肪去抑制 NK cells 的功能。XD
Article:
TN / ‘Fat-clogged’ Immune Cells Fail to Fight Tumors
Papers:
X Michelet et al, Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses. Nature Immunology (2018)
D Fanale et al, The Interplay between Metabolism, PPAR Signaling Pathway, and Cancer. PPAR Research (2017)
M Pawlak et al, Molecular mechanism of PPARα action and its impact on lipid metabolism, inflammation and fibrosis in non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatology (2015)
LR de Armas & ER Podack, Chapter Sixteen - Natural killer cytolytic activity. Basic Science & Clinical App (2010)
實驗法｜研究蛋白質功能
不知道大家在研究某個蛋白質的時候都是從哪方面著手呢？除了它的 subcellular localization 之外，我通常都是從 protein-protein interactions 著手，如果已經知道是和哪個蛋白質 interact，就會看它是用哪個 domain 和其他蛋白質 interact。
最常用(?)的方法大概是把它切成幾個片段，然後用這些片段去做 co-IP，看哪個片段和其他蛋白質 interact。那要如何決定要怎麼切蛋白質呢？通常我是把氨基酸序列丟到 PROSITE 去看它有哪些 functional domain，如果已經有其他人發表關於這個蛋白質的研究的話，可以先看一下其他人怎麼切的，如果還沒有其他人做，那就丟進 PROSITE 去看看。不過呢，PROSITE 能做的就是看它的 secondary structure。
上個禮拜學到另一個方法，就是看蛋白質的 tertiary structure，找出和它類似結構的蛋白質。這個方法可以用在純化某個蛋白質的時候，你找不到關於純化這個蛋白質的論文，丟進 PROSITE 後只顯示出它是屬於某個 superfamily，但是沒有特別的 domain，這時候可以丟進 Phyre2 去找有類似結構的蛋白質，它會找出在 Protein Data Bank (PDB) 裡結構和你要找的蛋白相似的蛋白質，當然不可能是整個蛋白質的結構都和你要的相同，可能只是某個片段，他會告訴你那些片段和你要找的蛋白質的相似度是多少，然後你再自己判斷你要以哪個蛋白質結構為依據來研究你的蛋白質。
不知道這樣解釋夠不夠清楚，目前手邊沒有可以做示範的蛋白質，如果有人有想要研究的蛋白質的話，可以留言一下，我再示範出來。
也歡迎大家分享自己的研究方法唷~ 😄
其他有用的網站：
European Bioinformatics Institute: 我常用的是它的 Clustal Omega
ExPASy Bioinformatics Resources Portal: 我常用的是它的 ProtParam
UniProt: 可以找到蛋白的結構資訊
Protein Secondary Structure: 各種線上資源的連結
NCBI COBALT: multiple alignment for protein sequences
Cold Spring Harbor (CSH) Protocols: 免費的各種 protocols
CSH Recipes: 各種 buffers 的配方
SnapGene Viewer: 用來看 DNA sequences 的軟體，有些 vector map 會有人已經標好各種 primers 或是 tag，不用自己找自己標，很方便。（有付費版本，可以自己剪貼，但我都用免費只有觀看和標示功能的。）這個也可以用來看定序圖哦，也可以手動改 ATCG。
最常用(?)的方法大概是把它切成幾個片段，然後用這些片段去做 co-IP，看哪個片段和其他蛋白質 interact。那要如何決定要怎麼切蛋白質呢？通常我是把氨基酸序列丟到 PROSITE 去看它有哪些 functional domain，如果已經有其他人發表關於這個蛋白質的研究的話，可以先看一下其他人怎麼切的，如果還沒有其他人做，那就丟進 PROSITE 去看看。不過呢，PROSITE 能做的就是看它的 secondary structure。
上個禮拜學到另一個方法，就是看蛋白質的 tertiary structure，找出和它類似結構的蛋白質。這個方法可以用在純化某個蛋白質的時候，你找不到關於純化這個蛋白質的論文，丟進 PROSITE 後只顯示出它是屬於某個 superfamily，但是沒有特別的 domain，這時候可以丟進 Phyre2 去找有類似結構的蛋白質，它會找出在 Protein Data Bank (PDB) 裡結構和你要找的蛋白相似的蛋白質，當然不可能是整個蛋白質的結構都和你要的相同，可能只是某個片段，他會告訴你那些片段和你要找的蛋白質的相似度是多少，然後你再自己判斷你要以哪個蛋白質結構為依據來研究你的蛋白質。
不知道這樣解釋夠不夠清楚，目前手邊沒有可以做示範的蛋白質，如果有人有想要研究的蛋白質的話，可以留言一下，我再示範出來。
也歡迎大家分享自己的研究方法唷~ 😄
其他有用的網站：
European Bioinformatics Institute: 我常用的是它的 Clustal Omega
ExPASy Bioinformatics Resources Portal: 我常用的是它的 ProtParam
UniProt: 可以找到蛋白的結構資訊
Protein Secondary Structure: 各種線上資源的連結
NCBI COBALT: multiple alignment for protein sequences
Cold Spring Harbor (CSH) Protocols: 免費的各種 protocols
CSH Recipes: 各種 buffers 的配方
SnapGene Viewer: 用來看 DNA sequences 的軟體，有些 vector map 會有人已經標好各種 primers 或是 tag，不用自己找自己標，很方便。（有付費版本，可以自己剪貼，但我都用免費只有觀看和標示功能的。）這個也可以用來看定序圖哦，也可以手動改 ATCG。
2018年12月21日 星期五
非洲豬瘟 African Swine Fever
這邊整理一下在加拿大官網上關於非洲豬瘟的幾個重點。
ASF (African swine fever) - fact sheet
• ASF 是由病毒 ASFV (African Swine Fever virus) 引起的，感染的豬隻會發燒、內出血，高傳染率，會快速在豬隻間透過直接和間接的方式傳開，並且死亡率極高。
• ASFV 為雙股 DNA 病毒(dsDNA)，比口蹄疫還難纏，耐高低溫和耐高酸鹼。
• 間接傳染包括經由牧場器具、運輸工具、衣服鞋子和飼料，另外接觸到受感染豬隻的糞便和皮膚，還有食用受感染豬隻製成的食物、飼料也會被傳染。
• 以下情況下仍具有感染性：11 天內的糞便、十五週內的冷凍和冷藏豬肉，三到半年內非高溫煮過的火腿。
• 受感染的豬隻初期並沒有症狀並沒有症狀，因此會成為病毒帶原者到處傳染給其他豬隻。
• ASF 的症狀和平常的豬瘟(classical swine fever)相像，症狀有：高燒、沒食慾、身體虛弱、無法站立、皮膚紅腫、內出血、嘔吐和腹瀉、落胎，和突然死亡。
• 病毒的致死率和病毒株(strains)有關，有的病毒株的致死率是 100%。
• 目前沒有 ASF 的疫苗，並且無法治療。
• 目前沒有證據會傳染給人類，但是會經由人類的衣物傳染給動物，因此如果在疫區接觸過動物，回國後十四天內要避免接觸到動物。
疫區 中國：
• 已多處爆發 ASF 感染和擴散
• 爆發的原因有缺乏衛生安檢措施、野生豬隻密度高、牧場違法販售感染豬隻、用受感染的豬肉餵食豬隻。
擴散途徑：
• ASF 持續出現在非洲幾個國家，持續出現在非洲幾個國家，然自 2007 年開始擴散到中亞，2018 年傳到中國和歐洲幾個國家。
• 高危險傳染媒介為來往歐洲的旅客，病毒可能會經由附著在他們的衣物鞋子上進入加拿大。
• 另一個高危險傳染媒介是除了來往中國的旅客外，還有中國來的飼料和偷帶中國豬肉製品進入加拿大的人。
• 目前加拿大病未發現有 ASF 感染。
加拿大的防疫方法：
• 加拿大食品檢驗局(CFIA)和海關 CBSA 合作，任何從「未確認沒有 ASF 的國家」進來的動物和肉類都需受到嚴格管制。
• 任何從疫區來的豬肉都禁止，目前完全禁制任何從中國來的豬隻、豬肉和豬肉製品。（中國水餃除外，因為已煮熟且 CFIA 已確認安全，並且水餃內的豬肉不是從中國來的。）
• 所有進入加拿大的旅客或居民皆須向海關告知他們在其他國家待的時間和是否去過畜牧場，有的話需告知細節。
• 也必須向海關告知待在加拿大的期間內是否會去造訪畜牧場。
• 如果在進入加拿大境內前有去過他國的畜牧場，在進入加拿大後的五天內不可去任何畜牧場或相關設施。
• 進入加拿大後的五天後，如果衣物、鞋子和儀器設備皆經過消毒兩次後，才可進入加拿大的畜牧場。
CFIA 給加拿大居民和訪客的幾點建議：
• declare at the border if you have been on a farm or are going to a farm (從疫區 — 例如 #中國 — 回來時，如果有去過牧場，需告知海關。)
• declare at the border if you are bringing animal and/or food products (要跟海關申報是否有帶動物或食品)
• avoid contact with animals for at least 14 days after returning to Canada if you have recently travelled to a country where serious diseases exist (including contact with wildlife, farm animals and zoo animals) (如果在疫區有接觸到動物，回國後十四天內要避免接觸動物。)
加拿大的牧場和豬肉製品生產商能做什麼？
• 禁止從他國帶肉類進入加拿大，此為違法行為，熟食和罐頭食品除外。
• 徹底清潔衣物和鞋子
• 不要喂給豬吃人類的廚餘
• 確認牧場工作人員或訪客並未接觸過疫區的動物
Resources:
CFIA / African swine fever - fact sheet
CFIA / Preventing African swine fever from entering Canada
CPC / African swine fever virus and symptoms
CPC / African swine fever in other countries
CPC / Preventing ASF from infecting Canadian pigs
ASF (African swine fever) - fact sheet
• ASF 是由病毒 ASFV (African Swine Fever virus) 引起的，感染的豬隻會發燒、內出血，高傳染率，會快速在豬隻間透過直接和間接的方式傳開，並且死亡率極高。
• ASFV 為雙股 DNA 病毒(dsDNA)，比口蹄疫還難纏，耐高低溫和耐高酸鹼。
• 間接傳染包括經由牧場器具、運輸工具、衣服鞋子和飼料，另外接觸到受感染豬隻的糞便和皮膚，還有食用受感染豬隻製成的食物、飼料也會被傳染。
• 以下情況下仍具有感染性：11 天內的糞便、十五週內的冷凍和冷藏豬肉，三到半年內非高溫煮過的火腿。
• 受感染的豬隻初期並沒有症狀並沒有症狀，因此會成為病毒帶原者到處傳染給其他豬隻。
• ASF 的症狀和平常的豬瘟(classical swine fever)相像，症狀有：高燒、沒食慾、身體虛弱、無法站立、皮膚紅腫、內出血、嘔吐和腹瀉、落胎，和突然死亡。
• 病毒的致死率和病毒株(strains)有關，有的病毒株的致死率是 100%。
• 目前沒有 ASF 的疫苗，並且無法治療。
• 目前沒有證據會傳染給人類，但是會經由人類的衣物傳染給動物，因此如果在疫區接觸過動物，回國後十四天內要避免接觸到動物。
疫區 中國：
• 已多處爆發 ASF 感染和擴散
• 爆發的原因有缺乏衛生安檢措施、野生豬隻密度高、牧場違法販售感染豬隻、用受感染的豬肉餵食豬隻。
擴散途徑：
• ASF 持續出現在非洲幾個國家，持續出現在非洲幾個國家，然自 2007 年開始擴散到中亞，2018 年傳到中國和歐洲幾個國家。
• 高危險傳染媒介為來往歐洲的旅客，病毒可能會經由附著在他們的衣物鞋子上進入加拿大。
• 另一個高危險傳染媒介是除了來往中國的旅客外，還有中國來的飼料和偷帶中國豬肉製品進入加拿大的人。
• 目前加拿大病未發現有 ASF 感染。
加拿大的防疫方法：
• 加拿大食品檢驗局(CFIA)和海關 CBSA 合作，任何從「未確認沒有 ASF 的國家」進來的動物和肉類都需受到嚴格管制。
• 任何從疫區來的豬肉都禁止，目前完全禁制任何從中國來的豬隻、豬肉和豬肉製品。（中國水餃除外，因為已煮熟且 CFIA 已確認安全，並且水餃內的豬肉不是從中國來的。）
• 所有進入加拿大的旅客或居民皆須向海關告知他們在其他國家待的時間和是否去過畜牧場，有的話需告知細節。
• 也必須向海關告知待在加拿大的期間內是否會去造訪畜牧場。
• 如果在進入加拿大境內前有去過他國的畜牧場，在進入加拿大後的五天內不可去任何畜牧場或相關設施。
• 進入加拿大後的五天後，如果衣物、鞋子和儀器設備皆經過消毒兩次後，才可進入加拿大的畜牧場。
CFIA 給加拿大居民和訪客的幾點建議：
• declare at the border if you have been on a farm or are going to a farm (從疫區 — 例如 #中國 — 回來時，如果有去過牧場，需告知海關。)
• declare at the border if you are bringing animal and/or food products (要跟海關申報是否有帶動物或食品)
• avoid contact with animals for at least 14 days after returning to Canada if you have recently travelled to a country where serious diseases exist (including contact with wildlife, farm animals and zoo animals) (如果在疫區有接觸到動物，回國後十四天內要避免接觸動物。)
加拿大的牧場和豬肉製品生產商能做什麼？
• 禁止從他國帶肉類進入加拿大，此為違法行為，熟食和罐頭食品除外。
• 徹底清潔衣物和鞋子
• 不要喂給豬吃人類的廚餘
• 確認牧場工作人員或訪客並未接觸過疫區的動物
Resources:
CFIA / African swine fever - fact sheet
CFIA / Preventing African swine fever from entering Canada
CPC / African swine fever virus and symptoms
CPC / African swine fever in other countries
CPC / Preventing ASF from infecting Canadian pigs
2018年12月14日 星期五
實驗法｜純化蛋白
這篇只是把之前在臉書上寫的整理一下，關於純化帶有 6xHis tag 的蛋白質。
關於真正的純化蛋白，我是今年才學到的，之前做的都只過一個 gravity column，例如 Glutathione column，這篇介紹的是用 Ni-NTA column 來純化 6xHis tag protein，但原理是一樣的。
通常純化蛋白時都會在蛋白的前面加一個 tag，不管是 6xHis, GST 還是 MBP，在 tag 和蛋白中間會有一個 TEV cleavage site (ENLYFQ\S) 是給 TEV protease 切的，它會切在 Q 和 S 中間。
(TEV: Tobacco Etch Virus)
舉例來說，蛋白質可以是這樣：MBP-HHHHHH-ENLYFQ\S-Protein
這邊要注意的是如果要過 His column (也就是 nickel column)，你的蛋白需要帶 6xHis tag。先讓蛋白過 Ni-NTA 把不要的蛋白洗掉，只剩下你的 MBP-6xHis-Protein 會留在 column，然後再用 imidazole 把你的蛋白 elute 出來。
之後加入 TEV protease 把前面的 MBP-6xHis 切掉，然後再過一次 His column 把 MBP-6xHis 挑出來，MBP-6xHis 會留在 column 裡面，而你的蛋白會在出現在 flow-through。
通常蛋白在過了兩次 Ni-NTA 後會乾淨不少，之後想再更乾淨的話可以過 ion exchange column (IEX)，依照蛋白的 pI 質可以過 cation exchange 或是過 anion exchange，通常過到這邊以後已經滿乾淨惹，想再更更更純、更乾淨的話，可以過 size exclusion column (SEC)。
註：之前我都以為 TEV protease 需要用買的，後來到現在的公司後才知道 TEV protease 是可以自己做的呢。把 TEV protease 在 E. coli 裡大量表現後再自己純化，通常只要過一個 His column 後就可以用惹。
上網孤狗也可以找到很多 TEV purification 的 protocol，可以參考 Berkeley University QB3 的步驟，他們是先過一個 Ni-NTA，去鹽後再過 cation exchange column。去鹽的部分可以用 desalting column，也可以用 dialysis，不過我上次純化的時候，在過夜去鹽 dialysis 之後出現 precipitation 的現象，不過我那時也忘了在 dialysis buffer 裡加 BME，不知道跟這有沒有關係。
關於真正的純化蛋白，我是今年才學到的，之前做的都只過一個 gravity column，例如 Glutathione column，這篇介紹的是用 Ni-NTA column 來純化 6xHis tag protein，但原理是一樣的。
通常純化蛋白時都會在蛋白的前面加一個 tag，不管是 6xHis, GST 還是 MBP，在 tag 和蛋白中間會有一個 TEV cleavage site (ENLYFQ\S) 是給 TEV protease 切的，它會切在 Q 和 S 中間。
(TEV: Tobacco Etch Virus)
舉例來說，蛋白質可以是這樣：MBP-HHHHHH-ENLYFQ\S-Protein
這邊要注意的是如果要過 His column (也就是 nickel column)，你的蛋白需要帶 6xHis tag。先讓蛋白過 Ni-NTA 把不要的蛋白洗掉，只剩下你的 MBP-6xHis-Protein 會留在 column，然後再用 imidazole 把你的蛋白 elute 出來。
之後加入 TEV protease 把前面的 MBP-6xHis 切掉，然後再過一次 His column 把 MBP-6xHis 挑出來，MBP-6xHis 會留在 column 裡面，而你的蛋白會在出現在 flow-through。
通常蛋白在過了兩次 Ni-NTA 後會乾淨不少，之後想再更乾淨的話可以過 ion exchange column (IEX)，依照蛋白的 pI 質可以過 cation exchange 或是過 anion exchange，通常過到這邊以後已經滿乾淨惹，想再更更更純、更乾淨的話，可以過 size exclusion column (SEC)。
註：之前我都以為 TEV protease 需要用買的，後來到現在的公司後才知道 TEV protease 是可以自己做的呢。把 TEV protease 在 E. coli 裡大量表現後再自己純化，通常只要過一個 His column 後就可以用惹。
上網孤狗也可以找到很多 TEV purification 的 protocol，可以參考 Berkeley University QB3 的步驟，他們是先過一個 Ni-NTA，去鹽後再過 cation exchange column。去鹽的部分可以用 desalting column，也可以用 dialysis，不過我上次純化的時候，在過夜去鹽 dialysis 之後出現 precipitation 的現象，不過我那時也忘了在 dialysis buffer 裡加 BME，不知道跟這有沒有關係。
2018年12月8日 星期六
利用 peptide 檢測早期阿茲海默症
這是一年前的研究了 XD，我在刷臉書的時候看到有興趣但當下沒時間細讀的會先存起來，然後等有時間再打開來看，寫寫分享，然後不知不覺就積了很多沒看的，剛剛翻到這篇才發現竟然已經默默過了一年惹。（淚）
對阿茲海默症有點小了解的大概都知道治療此病的瓶頸主要有兩個，一是無法及早發現，通常發現時，也就是出現輕微失智症狀時(mild cognition impairment, MCI)，已經太晚了，二是藥物無法通過 BBB (blood-brain barrier)，因此目前除了藥物研發的研究，有的是針對如何在症狀未出現時便可即早發現。
動物腦部有一個蛋白是 CTGF (connective tissue growth factor)，主要功能是免疫反應和組織修復，AD 基轉老鼠腦部的 CTGF 會在 Aβ 堆積前出現上升的現象。這篇刊在 Nature Communications 的研究利用 phage display 釣到了一個目標蛋白是 CTGF，長度為九個氨基酸的環形胜肽(cyclic peptide) ，稱為 DAG。
怎麼用 phage display 釣的呢？他們是用 CX7C library，CX7C 是九個氨基酸長的 peptide，第一個和最後一個(也就是第九個)氨基酸是 cysteine，中間七個氨基酸是隨機的，用的是 degenerate codons NNK [註1]。兩端的 Cys 會形成 disulfide bond，使這小段的 peptide 變成一個環狀，用來標靶癌細胞的 iRGD 就是一個例子 [註2]。（iGRD sequence: CRGDKGPDC)
註 1：K = G or T and S = C or G。
CX7C library 製作細節可參考這篇：Tero AH Järvinen 的這篇：Design of Target-Seeking Antifibrotic Compounds
註 2： 之前有不少研究是用 phage display 釣出各個器官的 homing peptides，就是說這些 peptides 只會出現在某些器官，也就是這些器官有其他器官沒有的標靶蛋白或標靶物，可以用來當作器官的 biomarkers。用來穿過癌細胞 iRGD 就是用這個方法找到的，有興趣的可以參考 T Teesalu et al 的這篇：Mapping of Vascular ZIP Codes by Phage Display
關於噬菌體展示 phage display 可以參考之前這篇：Phage display 和小抗體製造
CX7C library 裡的九個氨基酸長的 peptides 會表現在 T7 phage 的表面，研究者們再把這些 T7 phage 靜脈注射到老鼠體內。T7 phage 進到老鼠體內後會到處遊走，其表面的 peptide 其在遊晃的時候便可找尋和它相結合的蛋白質。他們把 T4 library 分別打入正常老鼠(wildtype)和不同階段的 AD 基轉老鼠裡（三個月、五個月、七個月和九個月大的老鼠），然後再取其海馬迴(hippocampus)做比較，看有哪些 peptides 會大量出現在 AD 基轉老鼠的海馬迴裡，但卻沒出現在正常老鼠裡的，表示它的標靶蛋白是 AD 腦部裡的某個蛋白，可用來做為阿茲海默症的 biomarker，或許也可以用在治療上。比較了之後，他們找到惹 DAG (序列為：CDAGRKQKC，通常以前三個氨基酸為名)。
DAG 出現在所有階段的 AD 基轉老鼠腦內，包括皮質(cortex)和海馬迴(hippocampus)，表示早期的 AD 老鼠腦部就有可以作為 biomarker 的蛋白。接著，他們把 DAG 打入基轉 AD 老鼠裡後做了一連串的螢光染色，試圖找出 DAG 的標靶細胞和標靶蛋白，發現它出現在鄰近有 Aβ 的神經星狀膠質細胞(astrocytes)。另外，DAG 也出現在大腦皮質(cerebrocortex)的血管內皮細胞(biomarker: CD31)，而它標靶蛋白是血管內皮細胞上的 CTGF。這個蛋白質表現在人類和老鼠的腦中，功能是啟動發炎反應和組織修復，腦部受傷後 CTGF 的表現量會上升。他們研究了 CTGF 在腦部的表現，發現和正常老鼠相比，它同樣大量表現在 AD 基轉老鼠的大腦皮質和海馬迴，而且也是出現在 astrocytes，他們也做惹 binding 測試，確認 DAG 的標靶的確是 CTGF。
之後，他們檢測了三、四個月大、Aβ 尚未出現的年輕 AD 基轉老鼠腦部，發現 DAG 大量出現在大腦皮質和海馬迴，主要在其血管內皮細胞，表示 DAG 的標靶是 CTGF 而不是 Aβ。為了確認 DAG 不只作用在老鼠腦部細胞，他們用 AD 患者的幹細胞做 binding 測試，是用 DAG-conjugated Ag-nanoparticle (DAG-AgNP) 去染細胞組織，發現可以看到 DAG。用病患的腦部切片測試的話，DAG-AgNP 則出現在含有大量 Aβ 的海馬迴，用螢光染色的話也可以看到 CTGF 同樣出現在海馬迴，表示 DAG 的標靶蛋白是 CTGF。看到這裡可能會覺得證據不夠有力，不過當他們在 DAG-AgNP 之前先加了 anti-CTGF 的抗體後，DAG-AgNP 的訊號就消失了，表示抗體阻斷惹 DAG-CTGF 的結合。 這裡有一點是我想知道，但是文章裡沒提到的，CTGF 在很多神經性疾病中都被發現表現量升高，而在這篇裡顯示疾病初期就可偵測到大量的 CTGF，我的話會想看到在正常老鼠和 AD 基轉老鼠裡，DAG, CTGF 和 Aβ 在三到九個月大的時候，表現量變化的比較。
最後就是 AD 治療的瓶頸，如何把 DAG 送進腦部？他們把 DAG 和帶有氧化鐵 (iron oxide) 的 nanoparticle 結合後，靜脈注射進九個月大的 AD 基轉老鼠裡，發現它可以進入到老鼠的大腦皮質和海馬迴。文章裡提到，這點可以用來做影像檢測 AD，但是 DAG 如果接了染劑或顯影劑後還能進到腦部嗎？
References:
NNR / Potential Biomarker for Early Detection of Alzheimer's (Nov 2017)
AP Mann et al, Identification of a peptide recognizing cerebrovascular changes in mouse models of Alzheimer’s disease. Nature Communications (2017)
https://www.nature.com/articles/s41467-017-01096-0
Tero AH Järvinen, Chapter 12 - Design of Target-Seeking Antifibrotic Compounds. Methods in Enzymology (2012); doi: 10.1016/B978-0-12-391858-1.00013-7
T Teesalu et al, Chapter 2 - Mapping of Vascular ZIP Codes by Phage Display. Methods in Enzymology (2012)
對阿茲海默症有點小了解的大概都知道治療此病的瓶頸主要有兩個，一是無法及早發現，通常發現時，也就是出現輕微失智症狀時(mild cognition impairment, MCI)，已經太晚了，二是藥物無法通過 BBB (blood-brain barrier)，因此目前除了藥物研發的研究，有的是針對如何在症狀未出現時便可即早發現。
動物腦部有一個蛋白是 CTGF (connective tissue growth factor)，主要功能是免疫反應和組織修復，AD 基轉老鼠腦部的 CTGF 會在 Aβ 堆積前出現上升的現象。這篇刊在 Nature Communications 的研究利用 phage display 釣到了一個目標蛋白是 CTGF，長度為九個氨基酸的環形胜肽(cyclic peptide) ，稱為 DAG。
怎麼用 phage display 釣的呢？他們是用 CX7C library，CX7C 是九個氨基酸長的 peptide，第一個和最後一個(也就是第九個)氨基酸是 cysteine，中間七個氨基酸是隨機的，用的是 degenerate codons NNK [註1]。兩端的 Cys 會形成 disulfide bond，使這小段的 peptide 變成一個環狀，用來標靶癌細胞的 iRGD 就是一個例子 [註2]。（iGRD sequence: CRGDKGPDC)
註 1：K = G or T and S = C or G。
CX7C library 製作細節可參考這篇：Tero AH Järvinen 的這篇：Design of Target-Seeking Antifibrotic Compounds
註 2： 之前有不少研究是用 phage display 釣出各個器官的 homing peptides，就是說這些 peptides 只會出現在某些器官，也就是這些器官有其他器官沒有的標靶蛋白或標靶物，可以用來當作器官的 biomarkers。用來穿過癌細胞 iRGD 就是用這個方法找到的，有興趣的可以參考 T Teesalu et al 的這篇：Mapping of Vascular ZIP Codes by Phage Display
關於噬菌體展示 phage display 可以參考之前這篇：Phage display 和小抗體製造
CX7C library 裡的九個氨基酸長的 peptides 會表現在 T7 phage 的表面，研究者們再把這些 T7 phage 靜脈注射到老鼠體內。T7 phage 進到老鼠體內後會到處遊走，其表面的 peptide 其在遊晃的時候便可找尋和它相結合的蛋白質。他們把 T4 library 分別打入正常老鼠(wildtype)和不同階段的 AD 基轉老鼠裡（三個月、五個月、七個月和九個月大的老鼠），然後再取其海馬迴(hippocampus)做比較，看有哪些 peptides 會大量出現在 AD 基轉老鼠的海馬迴裡，但卻沒出現在正常老鼠裡的，表示它的標靶蛋白是 AD 腦部裡的某個蛋白，可用來做為阿茲海默症的 biomarker，或許也可以用在治療上。比較了之後，他們找到惹 DAG (序列為：CDAGRKQKC，通常以前三個氨基酸為名)。
DAG 出現在所有階段的 AD 基轉老鼠腦內，包括皮質(cortex)和海馬迴(hippocampus)，表示早期的 AD 老鼠腦部就有可以作為 biomarker 的蛋白。接著，他們把 DAG 打入基轉 AD 老鼠裡後做了一連串的螢光染色，試圖找出 DAG 的標靶細胞和標靶蛋白，發現它出現在鄰近有 Aβ 的神經星狀膠質細胞(astrocytes)。另外，DAG 也出現在大腦皮質(cerebrocortex)的血管內皮細胞(biomarker: CD31)，而它標靶蛋白是血管內皮細胞上的 CTGF。這個蛋白質表現在人類和老鼠的腦中，功能是啟動發炎反應和組織修復，腦部受傷後 CTGF 的表現量會上升。他們研究了 CTGF 在腦部的表現，發現和正常老鼠相比，它同樣大量表現在 AD 基轉老鼠的大腦皮質和海馬迴，而且也是出現在 astrocytes，他們也做惹 binding 測試，確認 DAG 的標靶的確是 CTGF。
之後，他們檢測了三、四個月大、Aβ 尚未出現的年輕 AD 基轉老鼠腦部，發現 DAG 大量出現在大腦皮質和海馬迴，主要在其血管內皮細胞，表示 DAG 的標靶是 CTGF 而不是 Aβ。為了確認 DAG 不只作用在老鼠腦部細胞，他們用 AD 患者的幹細胞做 binding 測試，是用 DAG-conjugated Ag-nanoparticle (DAG-AgNP) 去染細胞組織，發現可以看到 DAG。用病患的腦部切片測試的話，DAG-AgNP 則出現在含有大量 Aβ 的海馬迴，用螢光染色的話也可以看到 CTGF 同樣出現在海馬迴，表示 DAG 的標靶蛋白是 CTGF。看到這裡可能會覺得證據不夠有力，不過當他們在 DAG-AgNP 之前先加了 anti-CTGF 的抗體後，DAG-AgNP 的訊號就消失了，表示抗體阻斷惹 DAG-CTGF 的結合。 這裡有一點是我想知道，但是文章裡沒提到的，CTGF 在很多神經性疾病中都被發現表現量升高，而在這篇裡顯示疾病初期就可偵測到大量的 CTGF，我的話會想看到在正常老鼠和 AD 基轉老鼠裡，DAG, CTGF 和 Aβ 在三到九個月大的時候，表現量變化的比較。
最後就是 AD 治療的瓶頸，如何把 DAG 送進腦部？他們把 DAG 和帶有氧化鐵 (iron oxide) 的 nanoparticle 結合後，靜脈注射進九個月大的 AD 基轉老鼠裡，發現它可以進入到老鼠的大腦皮質和海馬迴。文章裡提到，這點可以用來做影像檢測 AD，但是 DAG 如果接了染劑或顯影劑後還能進到腦部嗎？
References:
NNR / Potential Biomarker for Early Detection of Alzheimer's (Nov 2017)
AP Mann et al, Identification of a peptide recognizing cerebrovascular changes in mouse models of Alzheimer’s disease. Nature Communications (2017)
https://www.nature.com/articles/s41467-017-01096-0
Tero AH Järvinen, Chapter 12 - Design of Target-Seeking Antifibrotic Compounds. Methods in Enzymology (2012); doi: 10.1016/B978-0-12-391858-1.00013-7
T Teesalu et al, Chapter 2 - Mapping of Vascular ZIP Codes by Phage Display. Methods in Enzymology (2012)
2018年11月30日 星期五
基因編輯嬰兒 -- 所以 CCR5 到底長怎樣？
關於中國基因編輯嬰兒的新聞大家大概已經看了好幾天了吧。賀建奎改的是 CCR5 (C-C chemokine receptor type 5)，到底是消除這個基因，還是改成它的突變 CCR5 δ32 呢？看了那麼多的資訊，相信很多人都學到 CCR5 和 CXCR4 是免疫 T cells 細胞表面的 co-receptors，HIV 病毒透過其表面的醣蛋白 gp120 和免疫細胞的 CCR5 或 CXCR4（或是兩者）相結合後進入 T 細胞。
CCR5 RefSeq: NP_000570.1
CCR5 UniProtKB: P51681
Figure: CCR5 有七個 TM，三個 ECL (extracellular loop) 和三個 ICL (intracellular loop)，N-terminus 在細胞外，C-terminus 在細胞內。(C Blanpain et al, Blood 2000 [4])
所以 CCR5 δ32 到底是怎樣呢？CCR5 是一個長為 352 個氨基酸的蛋白質，表現在免疫 T 細胞的表面，屬於 GPCR 的一種，有七個 transmembrane (TM) regions。CCR5 δ32 的意思是 CCR5Δ32，Δ 在基因上或蛋白質上的意思就是 deletion 的意思，Δ32 就是有 32 個 bp (base pair) 被 delete 掉了，就是少惹 32 個 bp 的意思(感覺在講廢話 XD)。這會有什麼影響呢？稍微了解 DNA 和 codon 的都知道 condon 是三個 bp 為一組轉成一個氨基酸，所以如果是三的倍數的 bp 被消失的話就是少了幾個氨基酸，但如果是非三的倍數，例如是 32 個 bp 被消失的話則會造成 frame shift，也就是整個氨基酸序列會大挪移。CCR5Δ32 裡被消失的那 32 個 bp 使得 stop codon (TGA) 提早出現了，造成尾端(C-terminal)的 168 個氨基酸消失了，第二個 extracellular loop 只剩一半，連帶著後面的三個 TM regions 不見了 [1]。
Figure: CCR5Δ32 中失去的那 32 個 bp (M Samson et al, Nature 1996 [1])
因為這 32 bp deletion，整個蛋白質只剩一半，無法形成有功能性的 receptor，因此對 HIV 免疫。是說我孤狗了一下，發現 HIV gp120 的 binding site 是 CCR5 的最頭端 N-terminal 細胞外的那一小段 (residue 1-30) [2]，那為什麼帶有 CCR5Δ32 突變的人可以免於 HIV 感染啊？他們的 CCR5 還是有 HIV 的 binding site 啊不是嘛？CCR5 有兩個預測的 disulfide bonds , C20-C269 和 C101-C178，有研究顯示這兩個 disulfide bonds 連結惹 ECL，可以維持 CCR5 的整體結構和功能，C20A, C101A 和 C269A 的突變降低惹 CCR5 的功能和 HIV 感染 [3, 4]。其中的 C269 位於 CCR5Δ32 裡被消失的那一半。另外，CCR5Δ32 在細胞實驗中的表象量也比較低。
>NP_000570.1 MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAARLLPPLYSLVFIFGFVGNMLVILILINCKRLKSMTDIYLLNLAISDLFFLLTVPFWAHYAAAQWDFGNTMCQLLTGLYFIGFFSGIFFIILLTIDRYLAVVHAVFALKARTVTFGVVTSVITWVVAVFASLPGIIFTRSQKEGLHYTCSSHFPYSQYQFWKNFQTLKIVILGLVLPLLVMVICYSGILKTLLRCRNEKKRHRAVRLIFTIMIVYFLFWAPYNIVLLLNTFQEFFGLNNCSSSNRLDQAMQVTETLGMTHCCINPIIYAFVGEKFRNYLLVFFQKHIAKRFCKCCSIFQQEAPERASSVYTRSTGEQEISVGL
>CCR5CCR5-δ32
MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAARLLPPLYSLVFIFGFVGNMLVILILINCKRLKSMTDIYLLNLAISDLFFLLTVPFWAHYAAAQWDFGNTMCQLLTGLYFIGFFSGIFFIILLTIDRYLAVVHAVFALKARTVTFGVVTSVITWVVAVFASLPGIIFTRSQKEGLHYTCSSHFPYIKDSHLGAGPAAACHGHLLLGNPKNSASVSK
（沒有 highlight 的序列是正常和突變不同的地方，紅色 C 是預測會成 disulfide bond。）
然後我剛看了一下賀做的 CRISPR，他是說露露的是 CCR5 K/O，但是他又寫 +1bp/-4bp，是說只有 3bp deletion 嗎？(*) 然後娜娜的是 in-frame 15bp deletion，不知道它的 in-frame 15 bp deletion 是指哪裡到哪裡，所以變成是只少了五個氨基酸的突變種嗎？我覺得這兩個都和天然的 CCR5Δ32 差很多啊。（對了，他展示的定序圖裡，娜娜的訊號也太雜了吧，他竟然能讀出 ATCG 是哪個？是我就會要求重新定序。）
* 後來看了尼安德塔人石器匠的解釋，+1bp/-4bp 是指兩個 alleles，一個是 +1bp，另一個是 -4bp，所以兩個 alleles 都有 frame shift，slides 裡出現的定序圖中那個箭頭不知道是指 +1bp 的還是 +4bp，不知道 frame shift 後整個氨基酸序列變怎樣，真的出現 premature stop codon 而變成 K/O 惹嗎？不管怎樣，我覺得這個情況更糟呀。
然後孤狗的時候，發現在 2016 年的時候中國已經有人做過人類胚胎的 CCR5Δ32，用的是 3PN embryo，發表在 Journal of Assisted Reproduction and Genetics (X Kang et al, 2016)，那個論文裡面編輯成功的胚胎中，其定序結果的確跟天然的 CCR5Δ32 相同，而不是像賀的這樣。那篇是用了兩種，一種是有提供 donor template 的 HDR，一種是沒有的 NHEJ。HDR 的成功率很低，最高只有 15% 的胚胎編輯成功。NHEJ 則滿高的，但是出現其他種類的 mutation 也很高。他們檢測了 28 個他們認為會出現 off-target 的地方，每個出現的 mismatch 大約有 2-4 個，未發現有 indel (insertion & deletion)。這個研究因為用的是 3PN embryo，所以三天後就死了。
Figure: HDR 和 NHEJ 的差別 (JR Guitart Jr. et al, J Inves Derm 2016)
不管賀的基因編輯嬰兒是怎樣，我還是覺得在 off-site target 解決之前不適合用在嬰兒身上，唯一的例外是用在很明顯的基因疾病。另外，就算是 CRISPR 技術很成熟了，我還是反對用在治療以外的地方，例如改善外觀。（雖然我覺得這種非單一基因的很難做到，尤其我們還無法掌握是哪些基因調控這些。）
相關閱讀：關於 CRISPR-Cas9
References:
1. M Samson et al, Resistance to HIV-1 infection in Caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR-5 chemokine receptor gene. Nature (1996)
2. EG Cornier et al, Specific interaction of CCR5 amino-terminal domain peptides containing sulfotyrosines with HIV-1 envelope glycoprotein gp120. PNAS (2000)
3. C Blanpain et al, Extracellular cysteines of CCR5 are required for chemokine binding, but dispensable for HIV-1 coreceptor activity. JBC (1999)
4. C Blanpain et al, Multiple nonfunctional alleles of CCR5 are frequent in various human populations. Blood (2000)
CCR5 RefSeq: NP_000570.1
CCR5 UniProtKB: P51681
Figure: CCR5 有七個 TM，三個 ECL (extracellular loop) 和三個 ICL (intracellular loop)，N-terminus 在細胞外，C-terminus 在細胞內。(C Blanpain et al, Blood 2000 [4])
所以 CCR5 δ32 到底是怎樣呢？CCR5 是一個長為 352 個氨基酸的蛋白質，表現在免疫 T 細胞的表面，屬於 GPCR 的一種，有七個 transmembrane (TM) regions。CCR5 δ32 的意思是 CCR5Δ32，Δ 在基因上或蛋白質上的意思就是 deletion 的意思，Δ32 就是有 32 個 bp (base pair) 被 delete 掉了，就是少惹 32 個 bp 的意思(感覺在講廢話 XD)。這會有什麼影響呢？稍微了解 DNA 和 codon 的都知道 condon 是三個 bp 為一組轉成一個氨基酸，所以如果是三的倍數的 bp 被消失的話就是少了幾個氨基酸，但如果是非三的倍數，例如是 32 個 bp 被消失的話則會造成 frame shift，也就是整個氨基酸序列會大挪移。CCR5Δ32 裡被消失的那 32 個 bp 使得 stop codon (TGA) 提早出現了，造成尾端(C-terminal)的 168 個氨基酸消失了，第二個 extracellular loop 只剩一半，連帶著後面的三個 TM regions 不見了 [1]。
Figure: CCR5Δ32 中失去的那 32 個 bp (M Samson et al, Nature 1996 [1])
因為這 32 bp deletion，整個蛋白質只剩一半，無法形成有功能性的 receptor，因此對 HIV 免疫。是說我孤狗了一下，發現 HIV gp120 的 binding site 是 CCR5 的最頭端 N-terminal 細胞外的那一小段 (residue 1-30) [2]，那為什麼帶有 CCR5Δ32 突變的人可以免於 HIV 感染啊？他們的 CCR5 還是有 HIV 的 binding site 啊不是嘛？CCR5 有兩個預測的 disulfide bonds , C20-C269 和 C101-C178，有研究顯示這兩個 disulfide bonds 連結惹 ECL，可以維持 CCR5 的整體結構和功能，C20A, C101A 和 C269A 的突變降低惹 CCR5 的功能和 HIV 感染 [3, 4]。其中的 C269 位於 CCR5Δ32 裡被消失的那一半。另外，CCR5Δ32 在細胞實驗中的表象量也比較低。
>NP_000570.1 MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAARLLPPLYSLVFIFGFVGNMLVILILINCKRLKSMTDIYLLNLAISDLFFLLTVPFWAHYAAAQWDFGNTMCQLLTGLYFIGFFSGIFFIILLTIDRYLAVVHAVFALKARTVTFGVVTSVITWVVAVFASLPGIIFTRSQKEGLHYTCSSHFPYSQYQFWKNFQTLKIVILGLVLPLLVMVICYSGILKTLLRCRNEKKRHRAVRLIFTIMIVYFLFWAPYNIVLLLNTFQEFFGLNNCSSSNRLDQAMQVTETLGMTHCCINPIIYAFVGEKFRNYLLVFFQKHIAKRFCKCCSIFQQEAPERASSVYTRSTGEQEISVGL
>CCR5CCR5-δ32
MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAARLLPPLYSLVFIFGFVGNMLVILILINCKRLKSMTDIYLLNLAISDLFFLLTVPFWAHYAAAQWDFGNTMCQLLTGLYFIGFFSGIFFIILLTIDRYLAVVHAVFALKARTVTFGVVTSVITWVVAVFASLPGIIFTRSQKEGLHYTCSSHFPYIKDSHLGAGPAAACHGHLLLGNPKNSASVSK
（沒有 highlight 的序列是正常和突變不同的地方，紅色 C 是預測會成 disulfide bond。）
然後我剛看了一下賀做的 CRISPR，他是說露露的是 CCR5 K/O，但是他又寫 +1bp/-4bp，是說只有 3bp deletion 嗎？(*) 然後娜娜的是 in-frame 15bp deletion，不知道它的 in-frame 15 bp deletion 是指哪裡到哪裡，所以變成是只少了五個氨基酸的突變種嗎？我覺得這兩個都和天然的 CCR5Δ32 差很多啊。（對了，他展示的定序圖裡，娜娜的訊號也太雜了吧，他竟然能讀出 ATCG 是哪個？是我就會要求重新定序。）
* 後來看了尼安德塔人石器匠的解釋，+1bp/-4bp 是指兩個 alleles，一個是 +1bp，另一個是 -4bp，所以兩個 alleles 都有 frame shift，slides 裡出現的定序圖中那個箭頭不知道是指 +1bp 的還是 +4bp，不知道 frame shift 後整個氨基酸序列變怎樣，真的出現 premature stop codon 而變成 K/O 惹嗎？不管怎樣，我覺得這個情況更糟呀。
然後孤狗的時候，發現在 2016 年的時候中國已經有人做過人類胚胎的 CCR5Δ32，用的是 3PN embryo，發表在 Journal of Assisted Reproduction and Genetics (X Kang et al, 2016)，那個論文裡面編輯成功的胚胎中，其定序結果的確跟天然的 CCR5Δ32 相同，而不是像賀的這樣。那篇是用了兩種，一種是有提供 donor template 的 HDR，一種是沒有的 NHEJ。HDR 的成功率很低，最高只有 15% 的胚胎編輯成功。NHEJ 則滿高的，但是出現其他種類的 mutation 也很高。他們檢測了 28 個他們認為會出現 off-target 的地方，每個出現的 mismatch 大約有 2-4 個，未發現有 indel (insertion & deletion)。這個研究因為用的是 3PN embryo，所以三天後就死了。
Figure: HDR 和 NHEJ 的差別 (JR Guitart Jr. et al, J Inves Derm 2016)
不管賀的基因編輯嬰兒是怎樣，我還是覺得在 off-site target 解決之前不適合用在嬰兒身上，唯一的例外是用在很明顯的基因疾病。另外，就算是 CRISPR 技術很成熟了，我還是反對用在治療以外的地方，例如改善外觀。（雖然我覺得這種非單一基因的很難做到，尤其我們還無法掌握是哪些基因調控這些。）
相關閱讀：關於 CRISPR-Cas9
References:
1. M Samson et al, Resistance to HIV-1 infection in Caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR-5 chemokine receptor gene. Nature (1996)
2. EG Cornier et al, Specific interaction of CCR5 amino-terminal domain peptides containing sulfotyrosines with HIV-1 envelope glycoprotein gp120. PNAS (2000)
3. C Blanpain et al, Extracellular cysteines of CCR5 are required for chemokine binding, but dispensable for HIV-1 coreceptor activity. JBC (1999)
4. C Blanpain et al, Multiple nonfunctional alleles of CCR5 are frequent in various human populations. Blood (2000)
2018年11月9日 星期五
割掉盲腸可以降低得到帕金森氏症的風險
有意思，割掉盲腸可以降低得到帕金森氏症(Parkinson's Disease; PD)的風險 19-25%。
原因是他們發現盲腸是致病蛋白 α-synuclein 的堆積地。α-synuclein 的基因是 SNCA，有家族遺傳病史的通常是帶有 SNCA 的突變。
α-synuclein 大量表現在神經系統中，佔了細胞內蛋白總量的 1% (of total cytosolic proteins)，有趣的是它除了出現在腦神細胞中，它也出現在紅血球和血小板中。它是很小的蛋白質，長度只有 140 個氨基酸，被認為在自然的情況下是不會摺疊的(natively unfolded protein)，但是當和 lipid 結合時會形成 α-helices，它的 N-terminus 被預測出來是 lipid-binding motif，會和細胞膜中的 lipid 結合。而在一些情況下，它會形成 β-sheet，變成類似造成阿茲罕默症的 Aβ 所形成的 fibrils。
Figure: CM Ritchie & PJ Thomas; doi: 10.4236/health.2012.431175
雖然 α-synuclein 在腦部的功能還不清楚，不過如果摺疊錯誤(misfold)的話會結塊(aggregates)堆積成 Lwey bodies (LB)，造成腦細胞死亡。另外，它也會從神經細胞中釋出，遊走到其他器官，目前機制不清楚。之前有研究發現，PD 病患的腸胃道神經細胞(enteric neurons)裡也有 α-synuclein aggregates，有可能腦部的 α-synuclein aggregates 是經由迷走神經(vagal nerve)由腸胃道進入到腦部的，而割盲腸手術會切斷迷走神經。除此之外，腸胃道問題像是便秘在 PD 病患也滿常見的。
而這篇研究發現，不管是在健康人還是 PD 患者的盲腸裡，不分年紀都有發現有大量 α-synuclein 的堆積。他們分析了兩組資料數據，一組是瑞典 SNPR (Swedish National Patient Registry)，約一百六十萬人，另一組美國的 PPMI (Parkinson’s Progression Markers Initiative)，有 849 位病患。分析結果顯示，是否割盲腸和得到 PD 的風險相關，割掉盲腸二十年以上的比沒割的發病的年紀比沒有的晚 1.6 年，割掉三十年以上的人發病的年紀比沒有的晚 3.6 年，而割掉盲腸的人得到 PD 的風險也比沒割的人少了 19.3%（六十五歲以上沒割盲腸的人得到 PD 的機率大概是 1%）。不過呢，如果在病發之後才割掉盲腸的話，則沒有太大幫助。另外，如果是家族遺傳的話，割盲腸也沒有明顯的幫助。其中一個有趣的發現是他們把瑞典的資料分成都市人口和鄉村人口後再分析，發現割盲腸降低得病的機率只出現在鄉村的人口，因此致病原因可能也和環境有關。
除此之外，他們也檢視了健康人盲腸裡的 α-synuclein，發現健康人盲腸裡的 α-synuclein 和腦中致病的是相同的，都是 α-synuclein aggregates，從盲腸裡抽取出來的 α-synuclein 可以在體外(in vitro)迅速引起正常的 α-synuclein 產生結塊現象。另外一提的是 α-synuclein aggregates 堆積在腦部會造成細胞死亡，但是在盲腸則沒這個情況。至於為什麼大多數健康的人的盲腸都有 α-synuclein，但是並非每個人都得 PD 呢？作者檢視了健康和病患的盲腸，發現病患的盲腸比健康的人要短，這也許是原因，但還需要更多研究證據。
Articles:
NNR / Appendix Removal Lowers Parkinson's Disease Risk by up to 25% (Oct 2018)
Science / Seeds of Parkinson’s disease may hide in the appendix (Oct 2018)
Papers:
BA Killinger et al, The vermiform appendix impacts the risk of developing Parkinson’s disease. Science Translational Medicine (2018)
L Stefanis, α-Synuclein in Parkinson's Disease. Cold Spring Harb Perspect Med (2012)
O Marques & TF Outeiro, Alpha-synuclein: from secretion to dysfunction and death. Cell Death & Disease (2012)
原因是他們發現盲腸是致病蛋白 α-synuclein 的堆積地。α-synuclein 的基因是 SNCA，有家族遺傳病史的通常是帶有 SNCA 的突變。
α-synuclein 大量表現在神經系統中，佔了細胞內蛋白總量的 1% (of total cytosolic proteins)，有趣的是它除了出現在腦神細胞中，它也出現在紅血球和血小板中。它是很小的蛋白質，長度只有 140 個氨基酸，被認為在自然的情況下是不會摺疊的(natively unfolded protein)，但是當和 lipid 結合時會形成 α-helices，它的 N-terminus 被預測出來是 lipid-binding motif，會和細胞膜中的 lipid 結合。而在一些情況下，它會形成 β-sheet，變成類似造成阿茲罕默症的 Aβ 所形成的 fibrils。
Figure: CM Ritchie & PJ Thomas; doi: 10.4236/health.2012.431175
雖然 α-synuclein 在腦部的功能還不清楚，不過如果摺疊錯誤(misfold)的話會結塊(aggregates)堆積成 Lwey bodies (LB)，造成腦細胞死亡。另外，它也會從神經細胞中釋出，遊走到其他器官，目前機制不清楚。之前有研究發現，PD 病患的腸胃道神經細胞(enteric neurons)裡也有 α-synuclein aggregates，有可能腦部的 α-synuclein aggregates 是經由迷走神經(vagal nerve)由腸胃道進入到腦部的，而割盲腸手術會切斷迷走神經。除此之外，腸胃道問題像是便秘在 PD 病患也滿常見的。
而這篇研究發現，不管是在健康人還是 PD 患者的盲腸裡，不分年紀都有發現有大量 α-synuclein 的堆積。他們分析了兩組資料數據，一組是瑞典 SNPR (Swedish National Patient Registry)，約一百六十萬人，另一組美國的 PPMI (Parkinson’s Progression Markers Initiative)，有 849 位病患。分析結果顯示，是否割盲腸和得到 PD 的風險相關，割掉盲腸二十年以上的比沒割的發病的年紀比沒有的晚 1.6 年，割掉三十年以上的人發病的年紀比沒有的晚 3.6 年，而割掉盲腸的人得到 PD 的風險也比沒割的人少了 19.3%（六十五歲以上沒割盲腸的人得到 PD 的機率大概是 1%）。不過呢，如果在病發之後才割掉盲腸的話，則沒有太大幫助。另外，如果是家族遺傳的話，割盲腸也沒有明顯的幫助。其中一個有趣的發現是他們把瑞典的資料分成都市人口和鄉村人口後再分析，發現割盲腸降低得病的機率只出現在鄉村的人口，因此致病原因可能也和環境有關。
除此之外，他們也檢視了健康人盲腸裡的 α-synuclein，發現健康人盲腸裡的 α-synuclein 和腦中致病的是相同的，都是 α-synuclein aggregates，從盲腸裡抽取出來的 α-synuclein 可以在體外(in vitro)迅速引起正常的 α-synuclein 產生結塊現象。另外一提的是 α-synuclein aggregates 堆積在腦部會造成細胞死亡，但是在盲腸則沒這個情況。至於為什麼大多數健康的人的盲腸都有 α-synuclein，但是並非每個人都得 PD 呢？作者檢視了健康和病患的盲腸，發現病患的盲腸比健康的人要短，這也許是原因，但還需要更多研究證據。
Articles:
NNR / Appendix Removal Lowers Parkinson's Disease Risk by up to 25% (Oct 2018)
Science / Seeds of Parkinson’s disease may hide in the appendix (Oct 2018)
Papers:
BA Killinger et al, The vermiform appendix impacts the risk of developing Parkinson’s disease. Science Translational Medicine (2018)
L Stefanis, α-Synuclein in Parkinson's Disease. Cold Spring Harb Perspect Med (2012)
O Marques & TF Outeiro, Alpha-synuclein: from secretion to dysfunction and death. Cell Death & Disease (2012)
2018年10月27日 星期六
2018 諾貝爾生醫獎：免疫系統中的檢測點 PD-1 和 CTLA-4
今年的諾貝爾生醫獎得主是免疫療法，分別為德州大學安德生癌症中心(University of Texas MD Anderson Cancer Center)的 James Allison 和日本京都大學的本庶佑。免疫細胞中有一種是 T -cells [註 1]，它的細胞膜上有接受器(T cell receptors, TCR)和其他輔助蛋白質會辨識非自體蛋白（例如細菌的或病毒的）和傳送訊息。要全面啟動 T cells 需要兩個訊息 ，一個是 T cells 上面的 TCR 和抗原的接合 [註 2]，另一個是 T cells 上面的 CD28 和 APC 表面的 B7 結合，CD28 表現在 naive T cells 上面。
Figure / M Alegre et al, Nature Reviews Immunology (2001)
註 1：T cells 又分成 helper T-cells (Th cells, CD4+ T cells) 和 cytotoxic T-cells (Tc cells, CTLs, CD8+ T cells)
註 2：抗原被 APC (antigen presenting cells) 收進細胞內後會變成小片段，然後再由過 MHC (major histocompatibility complex)呈現在 APC 表面讓 T cells 辨識，準確來說和 TCRs 結合的是 MHC:Ag。
Allison 發現 CTLs 上面的 CTLA-4 有抑制免疫反應的作用。如果說 TCR 和 CD28 是兩把鎖，MHC:Ag 和 B7 是鑰匙，解開後才會全面啟動免疫反應，那 CTLA-4 就像是安全鎖，防止 CD28 那個鎖被解開，因為它接合的對象是 B7，因此大多數人想到的是用 CTLA-4 去治療自體免疫性疾病(autoimmune disease)。不過 Allison 想到的是相反的方向，他發現 CTLA-4 的抗體會抑制 T-cell 的功能功能，並且增加免疫反應。他們把直腸癌腫瘤細胞打入老鼠裡，其中有部分老鼠同時和之後的第三天和第六天又各打入一劑 CTLA-4 抗體，結果發現沒打抗體的老鼠如預期長出腫瘤，並且持續變大，而同時也打入 CTLA-4 抗體的老鼠則是打入腫瘤細胞後的五天內長出小小腫瘤後又漸漸萎縮，然後消失了。他們給這些腫瘤長出後又消失的老鼠二次挑戰，看看之前打入的 CTLA-4 抗體的效果有沒有持續，結果這些老鼠並沒有再長出腫瘤。
CTLA-4 的抗體藥為 Bristol-Myers Squibb 的 Ipilimumab (品牌名為 Yervoy)，用來治療黑色素瘤(melanoma)。
讓京都大學的本庶佑得獎的是 PD-1，他發現這個蛋白質會表現在快死掉的 T-cells 的細胞膜表面，因此稱它為 programmed death 1 (PD-1)。PD-1 是 B7 家族的成員之一，其配位基(ligand)為 PD-L1 和 PD-L2。本庶佑和其團隊發現 PD-L1 和 B7 會一同表現在 APC 表面上外，其包括了被活化了的 blood monocytes。他們也發現，除了被活化的 APC 會表現 PD-L1，非免疫細胞的心臟和肺的組織細胞也會表現 PD-L1，它和 PD-1 結合會抑制淋巴細胞活化和繁衍；PD-L2 表現在正常的 dendritic cells 表面，和 PD-1 結合則會抑制 T cell 活化。
後來，他們和另一組研究團隊發現癌細胞也會表現 PD-L1，並且因此逃過免疫系統的偵測。之後，本庶佑和其團隊發現黑色素癌細胞(melanoma cells)無法在沒有 PD-1 的老鼠(PD-1 -/-)體內擴散，在沒有 PD-1 的情況下，CTLs 聚集在癌細胞，並且其活動力也加強了。他們同時也用了抗 PD-1 的抗體測試，發現 anti-PD1 mAb 抑制了老鼠肝臟裡癌細胞的生長，在大腸和肺的測試也得到同樣效果，阻斷 PD-1 和 PD-L1 之間的 interaction 可以抑制癌細胞生長。
雖然這兩個蛋白質都被稱為免疫機制裡的 checkpoint，然而目前臨床上的結果顯示 anti-PD-1 抗癌效果比 anti-CTLA-4 還要好。
Articles:
2018 Nobel Prize in Physiology and Medicine
Science / Cancer immunotherapy pioneers win medicine Nobel (Oct 2018)
Technology Networks / James P. Allison & Tasuku Honjo Win 2018 Nobel Prize for Medicine (Oct 2018)
Papers:
DR Leach et al, Enhancement of Antitumor Immunity by CTLA-4 Blockade. Science (1996)
M Alegre et al, T-cell regulation by CD28 and CTLA-4. Nature Reviews Immology (2001)
GJ Freeman et al, Engagement of the PD-1 Immunoinhibitory Receptor by a Novel B7 Family Member Leads to Negative Regulation of Lymphocyte Activation. JEM (2000)
Y Iwai et al, PD-1 blockade inhibits hematogenous spread of poorly immunogenic tumor cells by enhanced recruitment of effector T cells. Int Immunology (2004)
Figure / M Alegre et al, Nature Reviews Immunology (2001)
註 1：T cells 又分成 helper T-cells (Th cells, CD4+ T cells) 和 cytotoxic T-cells (Tc cells, CTLs, CD8+ T cells)
註 2：抗原被 APC (antigen presenting cells) 收進細胞內後會變成小片段，然後再由過 MHC (major histocompatibility complex)呈現在 APC 表面讓 T cells 辨識，準確來說和 TCRs 結合的是 MHC:Ag。
Allison 發現 CTLs 上面的 CTLA-4 有抑制免疫反應的作用。如果說 TCR 和 CD28 是兩把鎖，MHC:Ag 和 B7 是鑰匙，解開後才會全面啟動免疫反應，那 CTLA-4 就像是安全鎖，防止 CD28 那個鎖被解開，因為它接合的對象是 B7，因此大多數人想到的是用 CTLA-4 去治療自體免疫性疾病(autoimmune disease)。不過 Allison 想到的是相反的方向，他發現 CTLA-4 的抗體會抑制 T-cell 的功能功能，並且增加免疫反應。他們把直腸癌腫瘤細胞打入老鼠裡，其中有部分老鼠同時和之後的第三天和第六天又各打入一劑 CTLA-4 抗體，結果發現沒打抗體的老鼠如預期長出腫瘤，並且持續變大，而同時也打入 CTLA-4 抗體的老鼠則是打入腫瘤細胞後的五天內長出小小腫瘤後又漸漸萎縮，然後消失了。他們給這些腫瘤長出後又消失的老鼠二次挑戰，看看之前打入的 CTLA-4 抗體的效果有沒有持續，結果這些老鼠並沒有再長出腫瘤。
CTLA-4 的抗體藥為 Bristol-Myers Squibb 的 Ipilimumab (品牌名為 Yervoy)，用來治療黑色素瘤(melanoma)。
讓京都大學的本庶佑得獎的是 PD-1，他發現這個蛋白質會表現在快死掉的 T-cells 的細胞膜表面，因此稱它為 programmed death 1 (PD-1)。PD-1 是 B7 家族的成員之一，其配位基(ligand)為 PD-L1 和 PD-L2。本庶佑和其團隊發現 PD-L1 和 B7 會一同表現在 APC 表面上外，其包括了被活化了的 blood monocytes。他們也發現，除了被活化的 APC 會表現 PD-L1，非免疫細胞的心臟和肺的組織細胞也會表現 PD-L1，它和 PD-1 結合會抑制淋巴細胞活化和繁衍；PD-L2 表現在正常的 dendritic cells 表面，和 PD-1 結合則會抑制 T cell 活化。
後來，他們和另一組研究團隊發現癌細胞也會表現 PD-L1，並且因此逃過免疫系統的偵測。之後，本庶佑和其團隊發現黑色素癌細胞(melanoma cells)無法在沒有 PD-1 的老鼠(PD-1 -/-)體內擴散，在沒有 PD-1 的情況下，CTLs 聚集在癌細胞，並且其活動力也加強了。他們同時也用了抗 PD-1 的抗體測試，發現 anti-PD1 mAb 抑制了老鼠肝臟裡癌細胞的生長，在大腸和肺的測試也得到同樣效果，阻斷 PD-1 和 PD-L1 之間的 interaction 可以抑制癌細胞生長。
雖然這兩個蛋白質都被稱為免疫機制裡的 checkpoint，然而目前臨床上的結果顯示 anti-PD-1 抗癌效果比 anti-CTLA-4 還要好。
Articles:
2018 Nobel Prize in Physiology and Medicine
Science / Cancer immunotherapy pioneers win medicine Nobel (Oct 2018)
Technology Networks / James P. Allison & Tasuku Honjo Win 2018 Nobel Prize for Medicine (Oct 2018)
Papers:
DR Leach et al, Enhancement of Antitumor Immunity by CTLA-4 Blockade. Science (1996)
M Alegre et al, T-cell regulation by CD28 and CTLA-4. Nature Reviews Immology (2001)
GJ Freeman et al, Engagement of the PD-1 Immunoinhibitory Receptor by a Novel B7 Family Member Leads to Negative Regulation of Lymphocyte Activation. JEM (2000)
Y Iwai et al, PD-1 blockade inhibits hematogenous spread of poorly immunogenic tumor cells by enhanced recruitment of effector T cells. Int Immunology (2004)
餓死癌細胞
據說之前仿間謠傳不吃東西可以餓死癌細胞，不知道最後是人先被餓死，還是癌細胞先被餓死呢？XD
這個研究也是餓死癌細胞(這是四年前的 TED Talk)，不過是靠吃東西餓死癌細胞。血管是體內運送養分和氧氣的交通工具，長多長少是受到調控的，透過釋放出 stimulators 或是 inhibitors，例如受傷可能造成傷處血管變少，這時候就會長出新血管讓它恢復到原本的狀況，血管新生的過程叫做 angiogenesis，過多或不足的血管新生都會造成疾病。
癌細胞要增生變成腫瘤需要很多養份和氧氣，於是它們會釋放出 stimulators 來刺激血管增生，好用來運送養份和氧氣給癌細胞們，於是針對這點，anti-angiogenic therapy (抗血管增生療法)被用來治療癌症，例如當 VEGF (vascular endothelial growth factor)和它的接受器(VEGF receptor)結合後會產生促使血管增生的訊號，於是就有抗體是針對 VEGF 或 VEGFR，用來阻斷下面的訊息傳遞，抑制不正常的血管增生，使癌細胞得不到養分繼續生長。
Dr. William Li 和他的團隊把抗血管增生的抑制劑塗抹在動物的腫瘤處，抑制血管新生，結果腫瘤消掉了。2004 到 2009 年間的 anti-angiogenic drug 有十二個，目前美國 NIH 網站上列的抗血管增生藥物(angiogenesis inhibitors)有十四個。不過，有時候發現癌症的時候已經太晚了，如果可以預防的話不是更好？大多數人認為預防癌症的發生的方法就是不要吃會致癌的食物，但是 Dr. Li 想的相反，他認為可以吃減少血管增生的食物，於是他們測試了有哪些食物裡的成分可以抑制不正常的血管增生，例如他們發現紫葡萄或紅酒裡的 resveratrol 可以抑制血管增生。他有列了哪些食物可以抗血管增生，有興趣的自己看。是說我覺得如果已經確診有癌症了，靠食療實在太慢，直接給 anti-angiogenic drug 比較快，食物大概就是吃一吃用來預防吧。
NIH - Angiogenesis inhibitors
ps. 不過有的癌細胞是可以在無氧的狀態下生長的，所以很難處理，記得我研究所畢業時申請的一個博士後研究就是做 tumor hypoxia，有興趣的可以孤狗 tumor hypoxia，或是看下面連結的 review papers。
Review papers:
A Albini et al, Cancer prevention by targeting angiogenesis. Nature Reviews Clinical Oncology (2012)
V Petrova et al, The hypoxic tumour microenvironment. Oncogenesis (2018)
這個研究也是餓死癌細胞(這是四年前的 TED Talk)，不過是靠吃東西餓死癌細胞。血管是體內運送養分和氧氣的交通工具，長多長少是受到調控的，透過釋放出 stimulators 或是 inhibitors，例如受傷可能造成傷處血管變少，這時候就會長出新血管讓它恢復到原本的狀況，血管新生的過程叫做 angiogenesis，過多或不足的血管新生都會造成疾病。
癌細胞要增生變成腫瘤需要很多養份和氧氣，於是它們會釋放出 stimulators 來刺激血管增生，好用來運送養份和氧氣給癌細胞們，於是針對這點，anti-angiogenic therapy (抗血管增生療法)被用來治療癌症，例如當 VEGF (vascular endothelial growth factor)和它的接受器(VEGF receptor)結合後會產生促使血管增生的訊號，於是就有抗體是針對 VEGF 或 VEGFR，用來阻斷下面的訊息傳遞，抑制不正常的血管增生，使癌細胞得不到養分繼續生長。
Dr. William Li 和他的團隊把抗血管增生的抑制劑塗抹在動物的腫瘤處，抑制血管新生，結果腫瘤消掉了。2004 到 2009 年間的 anti-angiogenic drug 有十二個，目前美國 NIH 網站上列的抗血管增生藥物(angiogenesis inhibitors)有十四個。不過，有時候發現癌症的時候已經太晚了，如果可以預防的話不是更好？大多數人認為預防癌症的發生的方法就是不要吃會致癌的食物，但是 Dr. Li 想的相反，他認為可以吃減少血管增生的食物，於是他們測試了有哪些食物裡的成分可以抑制不正常的血管增生，例如他們發現紫葡萄或紅酒裡的 resveratrol 可以抑制血管增生。他有列了哪些食物可以抗血管增生，有興趣的自己看。是說我覺得如果已經確診有癌症了，靠食療實在太慢，直接給 anti-angiogenic drug 比較快，食物大概就是吃一吃用來預防吧。
NIH - Angiogenesis inhibitors
ps. 不過有的癌細胞是可以在無氧的狀態下生長的，所以很難處理，記得我研究所畢業時申請的一個博士後研究就是做 tumor hypoxia，有興趣的可以孤狗 tumor hypoxia，或是看下面連結的 review papers。
Review papers:
A Albini et al, Cancer prevention by targeting angiogenesis. Nature Reviews Clinical Oncology (2012)
V Petrova et al, The hypoxic tumour microenvironment. Oncogenesis (2018)
2018年10月7日 星期日
Phage display 和小抗體製造
之前聊過抗體的一些知識，這篇來介紹如何用 phage display (噬菌體展示)來製造抗體，這邊說的抗體是奈米抗體 VHH，也就是 nanobodies (Nbs)。如果還記得之前說過的，駱駝除了正常的 IgG 抗體外，還有一種只有 heavy chain 的小抗體(HCAbs)，而 VHH 就是它的 variable region，很小，只有 14kDa 左右。和用老鼠產生抗體的方式類似，只是這是把抗原打到羊駝(llama, alpaca, 屬於駱駝科 Familiy: Camelidae)體內。
整個用 phage display 研發小抗體的步驟大概是：
Figure / Phagemid pMECS. VHH gene is fused to gIII gene of bacteriophage. (Vincke et al 2002)
Phagemid 本身有包含 bacteriophage (噬菌體)的一些東西(e.g., f1 origin)，所以除了會複製外，在 helper phage M13 的加入下 [註1]，會在細菌裡 package 成一個個的 phage particles。把 VHH 的 DNA library subclone 進 phagemid 裡面是為了讓它和 phage 的 gene III 連結在一起 [註2]，gene III 的蛋白質 product 是噬菌體的外層蛋白 g3p (g3 protein)，也就是 coat protein [註3]。把 VHH 的 DNA library 和 gene III 連結在一起的話，那當 phagemid 在複製和 package 成 phage 的時候，就會和 g3p 一起表現在 phage 的表面（下圖 P3 的地方），這就是 phage display (噬菌體展示)，把抗體展示在噬菌體表面。
Figure / Microbiology: Chapter 11 - Molecular Biology of Viruses (W. W. Norton)
註1：f1 和 M13 phage 都屬於 inovirus (ssDNA virus)，M13 有十個 genes，gene I 到 gene X，它們的 protein products 即是 g1p 到 g10p。Phage display 裡常用的 helper phage 是 M13KO7，可以幫助噬菌體把 phagemid 包進 phage particle 裡面。
"M13KO7 is able to replicate in the absence of phagemid DNA. In the presence of a phagemid bearing a wild-type M13 or f1 origin, single-stranded phagemid is packaged preferentially and secreted into the culture medium.This allows easy production of single-stranded phagemid DNA for mutagenesis or sequencing." （摘自 NEB 的產品網頁）
註2：下面提供的 protocol 裡用的 phagemid 是 pMECS，它帶有 f1 origin 和 gene III。
註3：如果對病毒還算熟悉的話，就是類似病毒的 capsid proteins 或是 envelope proteins。M13 的 g3p 是在的尾端，Expasy 的 ViralZone 有不錯的介紹：Inovirus - M13 phage。
要讓噬菌體把 VHH 表現在它的表面，需要把 phagemid 轉入細菌中，這樣它才有辦法在細菌裡面 package 成一個個的 phage，並且在細菌中大量繁殖，而這些會表現 VHH 的 phage 就是 phage library。
因為一隻羊駝裡可以打入好幾種抗原，所以產生的抗體是對抗不同抗原的混合，因此上面做出來的 phage library 其實是各種抗體的混合。例如你在一隻駱駝裡打入 A, B, C 三個抗原，牠體內就會產生 anti-A, anti-B 和 anti-C 的奈米抗體，你的 phage library 也就會是這三種抗體的混合，如果你要從中挑出 anti-A 的 nanobodies，這時候就要做 biopanning 。
那要怎麼挑出來呢？
就是用 A 抗原去挑，把 A 固定在盤子上後，加入 phage library，這時候表現有 anti-A nanobodies 的 phage 就會 bind A，然後把其他不會 bind A 抗原的 phage 都洗掉，再把會 bind A 抗原的 phage 洗出來(elution)，就是你的 anti-A phage library 惹。Anti-B 和 anti-C 的 phage 也可以用同樣方法挑出來，這個步驟就是 biopanning。
Figure / Scheme of phage display (T Schirrmann et al, Molecules 2011; doi: 10.3390/molecules16010412)
上圖中可以看到每個 phage 的尾巴都表現不同的抗體，這些抗體會和它可以辨識的抗原結合，然後其他的抗原的抗體或是 non-specific binding 會被洗掉，而可以和抗原結合的抗體則會被挑出來，在 helper phage 的幫助之下再度感染細菌，使這些帶有能夠辨識抗原的抗體的噬菌體 amplify。經過 amplification 的噬菌體再進入下一輪的 biopanning，把 binding 比較弱的和其他的 non-specific binding 再洗掉，這樣重複個兩三輪。
之後這些各別的 anti-A, anti-B 和 anti-C phage library 可以用 ELISA 的方法(i.e., phage ELISA)挑出 individual phage clones，例如找出 affinity 最高、最 specific，或是最 stable 的 nanobodies。挑出來的 phage clones 可以萃取出它們的 phagemid，定序之後就可以知道這些 nanobodies 的 DNA sequences。
詳細的 protocol 可以參考這篇：
C Vincke et al, Generation of Single Domain Antibody Fragments Derived from Camelids and Generation of Manifold Constructs. Antibody Engineering (2012)
延伸閱讀： 關於抗體和抗體藥的一些小知識
奈米抗體(nanobodies)的開發流程
整個用 phage display 研發小抗體的步驟大概是：
- Purify antigen (純化抗原)
- Immunization (把抗原打到動物體內讓他們產生抗體)
- Library building (製造抗體 library)：整個過程包括抽取動物的免疫細胞(lymphocytes)，從免疫細胞裡抽取 RNA，把 RNA 轉成 cDNA，PCR amplification，clone 到 phagemid 裡面後再 transform 到細菌裡做成細菌的 library。之後用 phage 去感染細菌，轉成 phage library。
- Biopanning & phage amplification: 從含有各種抗體基因的 phage library 裡面把不跟抗原反應的抗體洗掉，抓出和抗原抓出相對應的抗體。
- Phage ELISA: 利用 ELISA 釣出 positive clones，這個步驟是要從 biopanning 出來的一堆 phage 裡一個個挑出真的會和抗原反應的抗體。
- Sequencing of positive clones：定序從 phage library 釣出來的抗體，知道序列後就可以大量生產。
- Cloning into expression vector & purification: 把抗體的基因轉到 expression expression vector 後就可以大量表現和純化抗體。
Figure / Phagemid pMECS. VHH gene is fused to gIII gene of bacteriophage. (Vincke et al 2002)
噬菌體的構造
Phagemid 本身有包含 bacteriophage (噬菌體)的一些東西(e.g., f1 origin)，所以除了會複製外，在 helper phage M13 的加入下 [註1]，會在細菌裡 package 成一個個的 phage particles。把 VHH 的 DNA library subclone 進 phagemid 裡面是為了讓它和 phage 的 gene III 連結在一起 [註2]，gene III 的蛋白質 product 是噬菌體的外層蛋白 g3p (g3 protein)，也就是 coat protein [註3]。把 VHH 的 DNA library 和 gene III 連結在一起的話，那當 phagemid 在複製和 package 成 phage 的時候，就會和 g3p 一起表現在 phage 的表面（下圖 P3 的地方），這就是 phage display (噬菌體展示)，把抗體展示在噬菌體表面。
Figure / Microbiology: Chapter 11 - Molecular Biology of Viruses (W. W. Norton)
註1：f1 和 M13 phage 都屬於 inovirus (ssDNA virus)，M13 有十個 genes，gene I 到 gene X，它們的 protein products 即是 g1p 到 g10p。Phage display 裡常用的 helper phage 是 M13KO7，可以幫助噬菌體把 phagemid 包進 phage particle 裡面。
"M13KO7 is able to replicate in the absence of phagemid DNA. In the presence of a phagemid bearing a wild-type M13 or f1 origin, single-stranded phagemid is packaged preferentially and secreted into the culture medium.This allows easy production of single-stranded phagemid DNA for mutagenesis or sequencing." （摘自 NEB 的產品網頁）
註2：下面提供的 protocol 裡用的 phagemid 是 pMECS，它帶有 f1 origin 和 gene III。
註3：如果對病毒還算熟悉的話，就是類似病毒的 capsid proteins 或是 envelope proteins。M13 的 g3p 是在的尾端，Expasy 的 ViralZone 有不錯的介紹：Inovirus - M13 phage。
要讓噬菌體把 VHH 表現在它的表面，需要把 phagemid 轉入細菌中，這樣它才有辦法在細菌裡面 package 成一個個的 phage，並且在細菌中大量繁殖，而這些會表現 VHH 的 phage 就是 phage library。
怎麼釣出你要的奈米抗體？
因為一隻羊駝裡可以打入好幾種抗原，所以產生的抗體是對抗不同抗原的混合，因此上面做出來的 phage library 其實是各種抗體的混合。例如你在一隻駱駝裡打入 A, B, C 三個抗原，牠體內就會產生 anti-A, anti-B 和 anti-C 的奈米抗體，你的 phage library 也就會是這三種抗體的混合，如果你要從中挑出 anti-A 的 nanobodies，這時候就要做 biopanning 。
那要怎麼挑出來呢？
就是用 A 抗原去挑，把 A 固定在盤子上後，加入 phage library，這時候表現有 anti-A nanobodies 的 phage 就會 bind A，然後把其他不會 bind A 抗原的 phage 都洗掉，再把會 bind A 抗原的 phage 洗出來(elution)，就是你的 anti-A phage library 惹。Anti-B 和 anti-C 的 phage 也可以用同樣方法挑出來，這個步驟就是 biopanning。
Figure / Scheme of phage display (T Schirrmann et al, Molecules 2011; doi: 10.3390/molecules16010412)
上圖中可以看到每個 phage 的尾巴都表現不同的抗體，這些抗體會和它可以辨識的抗原結合，然後其他的抗原的抗體或是 non-specific binding 會被洗掉，而可以和抗原結合的抗體則會被挑出來，在 helper phage 的幫助之下再度感染細菌，使這些帶有能夠辨識抗原的抗體的噬菌體 amplify。經過 amplification 的噬菌體再進入下一輪的 biopanning，把 binding 比較弱的和其他的 non-specific binding 再洗掉，這樣重複個兩三輪。
之後這些各別的 anti-A, anti-B 和 anti-C phage library 可以用 ELISA 的方法(i.e., phage ELISA)挑出 individual phage clones，例如找出 affinity 最高、最 specific，或是最 stable 的 nanobodies。挑出來的 phage clones 可以萃取出它們的 phagemid，定序之後就可以知道這些 nanobodies 的 DNA sequences。
詳細的 protocol 可以參考這篇：
C Vincke et al, Generation of Single Domain Antibody Fragments Derived from Camelids and Generation of Manifold Constructs. Antibody Engineering (2012)
延伸閱讀： 關於抗體和抗體藥的一些小知識
2018年9月22日 星期六
實驗室裡的慣用語
（研究所時的舊文｜Dec 2008）
之前坐公車回家的路上發呆時想到的... 會說是慣用語是因為我也不知道這些稱不稱的上是口頭禪，但似乎每個人都有幾個偏好的用語。
【老闆的】
"We need to talk." (當他覺得需要跟我們討論實驗進度時。)
"Do you have a minute?" (當他想到什麼問題或新點子時。)
"That sucks." (當實驗出現問題時。)
".... so it's cooking now?" (當他確認實驗有在進行時。我們老闆很喜歡用 cooking 這個字，他用這個字的時候通常有兩種情形，一是用來表示「事情進行中」，另外一種就是天氣很熱的時候，如果房間很悶他就會說 "It's cooking in this room.")
"Anything exciting?" (當他詢問有沒有新進展的時候，有時會和 "Anything interesting?" 互換著用。最近還滿常被問這兩句話的說，每次看到他用期待的眼神對著我問這句話時，都只能很愧疚的說 "No"，我也很鬱卒的不想這樣阿，被問之後腦中都會浮現 "No findings = No progress" 這個等式，唉。)
【實驗助理 H 的】
"Crap!" (需要解釋這個嘛？)
"That sucks."
"That's hilarious." (聽到或講到好笑的事情時。這也是韓國女生的口頭禪，他們喜歡用 hilarious 這個字來表示某件事情很有趣或好笑，等你會用這個字而不是用 funny 或 interesting 之類的應該就表示你的英文進階到某個程度了。XD)
"That's awesome." (這應該不需要解釋了吧。)
"Anything interesting?" (對我說的，通常在下午四、五點老闆離開後，大家開始放鬆的時候，我在看 RSS 訂閱的文章，然後 H 在偷看我在看什麼網頁的時候。他會常對我說這句話是因為我要是看到什麼有趣的東西都講給他們聽或叫他們過來看。)
【韓國女生的】
"Perfect!"
"That's hilarious."
"That's adorable." (當她看到可愛的東西時，尤其當她在動物領養中心的網站又發現有新進的可愛小貓或小狗的時候。)
【我的】
"Shoot!" (實驗做錯的時候。)
"What the hell...." (通常出現在聊天的時候。)
我好像沒什麼慣用的字眼，不過最近實驗超不順的，於是 "Shoot" 這個字常常出現在我嘴邊，之前某天我還連叫了五次，結果現在 H 每次聽到我叫這個字都會笑(=.=)。
說到 "suck" 這個字，之前學校有 poster sale 的時候看到一張海報是加菲貓鬱悶的表情，下面寫的 "Mondays Suck"，超想把這張貼在實驗室門口的，尤其我們系上每個禮拜一早上九點就有 seminar，只是我們很沒種所以最後還是沒買那張海報。
之前坐公車回家的路上發呆時想到的... 會說是慣用語是因為我也不知道這些稱不稱的上是口頭禪，但似乎每個人都有幾個偏好的用語。
【老闆的】
"We need to talk." (當他覺得需要跟我們討論實驗進度時。)
"Do you have a minute?" (當他想到什麼問題或新點子時。)
"That sucks." (當實驗出現問題時。)
".... so it's cooking now?" (當他確認實驗有在進行時。我們老闆很喜歡用 cooking 這個字，他用這個字的時候通常有兩種情形，一是用來表示「事情進行中」，另外一種就是天氣很熱的時候，如果房間很悶他就會說 "It's cooking in this room.")
"Anything exciting?" (當他詢問有沒有新進展的時候，有時會和 "Anything interesting?" 互換著用。最近還滿常被問這兩句話的說，每次看到他用期待的眼神對著我問這句話時，都只能很愧疚的說 "No"，我也很鬱卒的不想這樣阿，被問之後腦中都會浮現 "No findings = No progress" 這個等式，唉。)
【實驗助理 H 的】
"Crap!" (需要解釋這個嘛？)
"That sucks."
"That's hilarious." (聽到或講到好笑的事情時。這也是韓國女生的口頭禪，他們喜歡用 hilarious 這個字來表示某件事情很有趣或好笑，等你會用這個字而不是用 funny 或 interesting 之類的應該就表示你的英文進階到某個程度了。XD)
"That's awesome." (這應該不需要解釋了吧。)
"Anything interesting?" (對我說的，通常在下午四、五點老闆離開後，大家開始放鬆的時候，我在看 RSS 訂閱的文章，然後 H 在偷看我在看什麼網頁的時候。他會常對我說這句話是因為我要是看到什麼有趣的東西都講給他們聽或叫他們過來看。)
【韓國女生的】
"Perfect!"
"That's hilarious."
"That's adorable." (當她看到可愛的東西時，尤其當她在動物領養中心的網站又發現有新進的可愛小貓或小狗的時候。)
【我的】
"Shoot!" (實驗做錯的時候。)
"What the hell...." (通常出現在聊天的時候。)
我好像沒什麼慣用的字眼，不過最近實驗超不順的，於是 "Shoot" 這個字常常出現在我嘴邊，之前某天我還連叫了五次，結果現在 H 每次聽到我叫這個字都會笑(=.=)。
說到 "suck" 這個字，之前學校有 poster sale 的時候看到一張海報是加菲貓鬱悶的表情，下面寫的 "Mondays Suck"，超想把這張貼在實驗室門口的，尤其我們系上每個禮拜一早上九點就有 seminar，只是我們很沒種所以最後還是沒買那張海報。
2018年9月21日 星期五
關於皰疹病毒 Herpesvirus
（研究所時的舊文 / Dec 2008）
會想寫這個是因為前幾天對面實驗室的 J 嘴角長疹子之類的東西，跑來我們實驗室的閒晃時候和 H 討論說是不是 herpes。
皰疹病毒的英文是 herpesvirus，在進到現在的實驗室之前我連 herpes 是什麼都不知道，我媽問我中文是什麼我也是查了之後才知道是皰疹。再慚愧一點，其實之前我對病毒的了解很少，大概大學之前連細菌(bacteria)和病毒(virus)有什麼不同都分不清楚，也是大學時上了課之後才知道兩者是不同的東西，病毒可以感染(infect)細菌，而且感染細菌的病毒和感染動物的病毒不一樣，感染細菌的叫 phage，完整名稱叫 bacteriophage，構造和動物病毒不一樣。細菌基本上來講是沒有細胞核的單細胞生物(prokaryotic)，而病毒並不屬於五大王國(Five Kingdoms)中的任何一個，連它是不是生物(living organism)都有爭議，目前大部分的教科書應該都不把病毒歸為生物吧。
【註】我都差不多忘了五大王國是哪五個，還查了一下：動物(Animalia), 植物(Plantae), 霉菌(Fungi), 原生生物(Protista)和無核原蟲類(Monera)，前面四個是有細胞核的(eukaryotic)，最後一個是沒有細胞核的(prokaryotic)，細菌就屬於此類。
Herpes 是希臘文，有爬行的意思，herpesvirus 下面包含三個次家族(subfamily)：alpha-, beta- 和 gamma-herpesvirinae，整個 herpesvirus 家族(herpesviridae)裡面會感染人類的有八個，其中最為人知曉的大概就是 HSV (herpes simplex virus) 和 VZV (varicella zoster virus)，HSV 有兩種：HSV-1 & HSV-2。 HSV-1 通常在口腔或皮膚造成皰疹，HSV-2 則是在生殖器官，也就是說會透過性行為傳染。VZV 應該很多人小時候都得過，會造成水痘(chicken pox)和帶狀疹(shingles)，這兩種病毒都屬於 alphaherpesvirus。除此之外，最近研究發現皰疹病毒家族中的 gammaherpesvirus 與癌症相關，此次家族裡的病毒都有造成癌症的可能性，例如 Epstein-Barr virus (EBV) 和 Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (HHV-8)。皰疹病毒主要是感染神經細胞，從皮膚細胞受感染後會經由感官神經(sensory neurons)往內進入到週邊神經系統(peripheral nervous system; PNS)，然後潛伏在神經細胞裡，平常時候對人體無害，但免疫系統低落時病毒就會活動起來，例如壓力大身體虛、老年時期或免疫不全(immunocompromised)患者(如AIDS病患)，在神經細胞裡複製新病毒，新的病毒再從神經細胞蔓延回到皮膚造成皰疹感染其他宿主，在很罕見的情況下會侵入中樞神經(CNS)造成死亡。
大多數的人都感染過皰疹病毒，但因為身體健康的人通常都不會有任何症狀，所以很多人會不知道自己得到過皰疹病毒。小時候得過水痘的就不用說了，還記得以前人家說得過水痘的就不用怕了，因為不會再得水痘，這樣說是沒錯啦！不過真要講倒也不是這麼回事，現在研究皰疹病毒而比較了解後就有種受騙的感覺，因為得過水痘後病毒就終身潛伏在你的身體裡了，當你以後哪天免疫力降低的時候病毒就會再活動起來，這時候長的就不是水痘，而是帶狀皰疹(就是人家說在腰部長一圈的話就會死掉的那種)，因為是從神經蔓延出來的，所以皰疹會沿著神經網，也就是脊神經(spinal cord)那附近長，通常要三、四個禮拜才會好，現在也有藥物可以治療。
心血來潮隨便寫寫我目前在研究的病毒，大家就隨便看看吧。
最後想說的是可能被大家誤解過的天花(smallpox)和牛痘疫苗(vaccinia)，曾經以為天花和牛痘是同一種病毒，所以用牛痘來做天花的疫苗，其實兩個是屬於同一個家族(poxvirus)的不同病毒，天花是由 variola virus 所造成的，牛痘疫苗是用牛痘病毒(vaccinia virus)所做成的。
以上。
會想寫這個是因為前幾天對面實驗室的 J 嘴角長疹子之類的東西，跑來我們實驗室的閒晃時候和 H 討論說是不是 herpes。
皰疹病毒的英文是 herpesvirus，在進到現在的實驗室之前我連 herpes 是什麼都不知道，我媽問我中文是什麼我也是查了之後才知道是皰疹。再慚愧一點，其實之前我對病毒的了解很少，大概大學之前連細菌(bacteria)和病毒(virus)有什麼不同都分不清楚，也是大學時上了課之後才知道兩者是不同的東西，病毒可以感染(infect)細菌，而且感染細菌的病毒和感染動物的病毒不一樣，感染細菌的叫 phage，完整名稱叫 bacteriophage，構造和動物病毒不一樣。細菌基本上來講是沒有細胞核的單細胞生物(prokaryotic)，而病毒並不屬於五大王國(Five Kingdoms)中的任何一個，連它是不是生物(living organism)都有爭議，目前大部分的教科書應該都不把病毒歸為生物吧。
【註】我都差不多忘了五大王國是哪五個，還查了一下：動物(Animalia), 植物(Plantae), 霉菌(Fungi), 原生生物(Protista)和無核原蟲類(Monera)，前面四個是有細胞核的(eukaryotic)，最後一個是沒有細胞核的(prokaryotic)，細菌就屬於此類。
Herpes 是希臘文，有爬行的意思，herpesvirus 下面包含三個次家族(subfamily)：alpha-, beta- 和 gamma-herpesvirinae，整個 herpesvirus 家族(herpesviridae)裡面會感染人類的有八個，其中最為人知曉的大概就是 HSV (herpes simplex virus) 和 VZV (varicella zoster virus)，HSV 有兩種：HSV-1 & HSV-2。 HSV-1 通常在口腔或皮膚造成皰疹，HSV-2 則是在生殖器官，也就是說會透過性行為傳染。VZV 應該很多人小時候都得過，會造成水痘(chicken pox)和帶狀疹(shingles)，這兩種病毒都屬於 alphaherpesvirus。除此之外，最近研究發現皰疹病毒家族中的 gammaherpesvirus 與癌症相關，此次家族裡的病毒都有造成癌症的可能性，例如 Epstein-Barr virus (EBV) 和 Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (HHV-8)。皰疹病毒主要是感染神經細胞，從皮膚細胞受感染後會經由感官神經(sensory neurons)往內進入到週邊神經系統(peripheral nervous system; PNS)，然後潛伏在神經細胞裡，平常時候對人體無害，但免疫系統低落時病毒就會活動起來，例如壓力大身體虛、老年時期或免疫不全(immunocompromised)患者(如AIDS病患)，在神經細胞裡複製新病毒，新的病毒再從神經細胞蔓延回到皮膚造成皰疹感染其他宿主，在很罕見的情況下會侵入中樞神經(CNS)造成死亡。
大多數的人都感染過皰疹病毒，但因為身體健康的人通常都不會有任何症狀，所以很多人會不知道自己得到過皰疹病毒。小時候得過水痘的就不用說了，還記得以前人家說得過水痘的就不用怕了，因為不會再得水痘，這樣說是沒錯啦！不過真要講倒也不是這麼回事，現在研究皰疹病毒而比較了解後就有種受騙的感覺，因為得過水痘後病毒就終身潛伏在你的身體裡了，當你以後哪天免疫力降低的時候病毒就會再活動起來，這時候長的就不是水痘，而是帶狀皰疹(就是人家說在腰部長一圈的話就會死掉的那種)，因為是從神經蔓延出來的，所以皰疹會沿著神經網，也就是脊神經(spinal cord)那附近長，通常要三、四個禮拜才會好，現在也有藥物可以治療。
心血來潮隨便寫寫我目前在研究的病毒，大家就隨便看看吧。
最後想說的是可能被大家誤解過的天花(smallpox)和牛痘疫苗(vaccinia)，曾經以為天花和牛痘是同一種病毒，所以用牛痘來做天花的疫苗，其實兩個是屬於同一個家族(poxvirus)的不同病毒，天花是由 variola virus 所造成的，牛痘疫苗是用牛痘病毒(vaccinia virus)所做成的。
以上。
2018年8月26日 星期日
阿茲海默症和 epigenetics
目前知道造成阿茲海默症的可能基因有 APP (Amyloid precursor protein), PS-1 (Presenilin-1), PS-2 和 APOE4，APP 被 γ-secretase 剪後會變成 β-amyloid (Aβ)，而 PS1 或 PS2 則是 γ-secretase 的其中一個 subunit，這幾個基因的突變會造成 Aβ 在腦部堆積。除了這些已知的基因突變造成的病症，有的基因是在沒有突變的情形下，它的表現因為一些(外在)因素改變了，例如 methylation (甲基化)，這類相關研究也就是近幾年常聽到的 epigenetics (表觀遺傳學)。
這篇研究用 EWAS (epigenome-wide association studies) 比較了健康者和 AD 患者的的檢體資料，發現了有個基因的 promoter 在 AD 患者中是處於 hypermethylation 的狀態，也就是他的表現是被抑制住的，這個基因是 N-fatty-acyl-amino acid synthase/hydrolase PM20D1 (aka Peptidase M20 Domain Containing 1)。在細胞實驗中，當細胞受到 ROS (reactive oxygen species) 或是 Aβ 破壞後，PM20D1 的表現量顯著增加。另外，PM20D1 的表現量在 AD (已出現症狀)基轉老鼠大腦額葉皮質(frontal cortex)裡的也比在 AD 症狀出現前或是比同年齡控制組的老鼠來得高。
另外，當他們增加細胞裡 PM20D1 的的表現量時，ROS 引起的細胞死亡減少了，而在 AD 基轉老鼠的海馬迴培養細胞裡，靠病毒轉進而大量表現的 PM20D1 則減少了細胞裡的 Aβ 堆積。在老鼠實驗中，他們用病毒轉進 PM20D1 到 AD 基轉老鼠的海馬迴裡使其大量表現，發現三個月後老鼠腦部的 Aβ 變少了，並且牠們認知也改善了。相反的，當他們用 ASO (antisense oligonucleotides) 使老鼠腦中的 PM20D1 表現量降低時，牠們的 Aβ 的量則增加，認知功能下降。
大概是因為 PM20D1 的表現量在阿茲海默症裡不是受突變的影響，而是在 epigenetics 上的，所以作者們認為可以靠飲食改變 PM20D1 的表現而減少得到阿茲海默症的機率，只是吃什麼可以增加 PM20D1 的表現還未可知。XD
Articles:
NNR / Brain Food: Changing our diet could prevent Alzheimer's
Papers:
JV Sanchez-Mut et al, PM20D1 is a quantitative trait locus associated with Alzheimer’s disease. Nature Medicine (2018)
這篇研究用 EWAS (epigenome-wide association studies) 比較了健康者和 AD 患者的的檢體資料，發現了有個基因的 promoter 在 AD 患者中是處於 hypermethylation 的狀態，也就是他的表現是被抑制住的，這個基因是 N-fatty-acyl-amino acid synthase/hydrolase PM20D1 (aka Peptidase M20 Domain Containing 1)。在細胞實驗中，當細胞受到 ROS (reactive oxygen species) 或是 Aβ 破壞後，PM20D1 的表現量顯著增加。另外，PM20D1 的表現量在 AD (已出現症狀)基轉老鼠大腦額葉皮質(frontal cortex)裡的也比在 AD 症狀出現前或是比同年齡控制組的老鼠來得高。
另外，當他們增加細胞裡 PM20D1 的的表現量時，ROS 引起的細胞死亡減少了，而在 AD 基轉老鼠的海馬迴培養細胞裡，靠病毒轉進而大量表現的 PM20D1 則減少了細胞裡的 Aβ 堆積。在老鼠實驗中，他們用病毒轉進 PM20D1 到 AD 基轉老鼠的海馬迴裡使其大量表現，發現三個月後老鼠腦部的 Aβ 變少了，並且牠們認知也改善了。相反的，當他們用 ASO (antisense oligonucleotides) 使老鼠腦中的 PM20D1 表現量降低時，牠們的 Aβ 的量則增加，認知功能下降。
大概是因為 PM20D1 的表現量在阿茲海默症裡不是受突變的影響，而是在 epigenetics 上的，所以作者們認為可以靠飲食改變 PM20D1 的表現而減少得到阿茲海默症的機率，只是吃什麼可以增加 PM20D1 的表現還未可知。XD
Articles:
NNR / Brain Food: Changing our diet could prevent Alzheimer's
Papers:
JV Sanchez-Mut et al, PM20D1 is a quantitative trait locus associated with Alzheimer’s disease. Nature Medicine (2018)
2018年8月11日 星期六
細菌在大城市裡的流動
大眾交通工具裡的把手每天被數不清的人握過，可以從上面的微生物觀察到什麼？
人類手上的菌落叢樣貌會受到生活習慣的影響而改變，例如自己住或和其他人住、住哪裡或是有無寵物，還有搭乘的交通工具，都會影響身上帶有菌落生態。大眾交通系統因為搭乘的人多，又來自不同的區域，可以說是不同微生物種類的交會和交換場所。香港鐵路系統(Mass Transit Railway, MTR)每天的載客量約四百七十萬人，可以想見能在上面收集到各式各樣來自不同地方的細菌，我們可以從這些不同的微生物上觀察到它們的往來流動嗎？
香港大學由 Gianni Panagiotou 帶領的研究團隊在香港的八個捷運線上各採集了六個把手上的細菌，採集時間包括早上和傍晚的尖峰時段，採集者會握著把手或接觸其表面三十分鐘。這八條路線走的區不一樣，其中一條是連接到中國深圳的。
分析了不同時段和不同路線的細菌後，發現主要的細菌為這四種：Actinobacteria (51.3%), Proteobacteria (26.6%), Firmicutes (11.4%) 和 Bacteroidetes (2.3%)，其餘的 8.4% 為少數其他種類。這些採集到的細菌種類中，最主要的菌種為 P. acnes (29.1%)。另外，有趣的發現是 -- 早上的細菌最為多樣化，和那個路線走的區域有關聯性，可以從細菌看出那區的特徵，例如某個路線會出現比較多的土壤類或海洋累細菌。越孤立的鐵路線，其細菌的區域性越明顯。不過到了傍晚的時候，當人口在城市間大量流動之後，手把上的細菌會變成以人類相關的細菌為主，每條路線上的帶有區域性特徵的細菌減少了，而帶有抗藥性(antibiotic resistance genes, ARGs)、臨床上最為廣見的細菌增加了， 其中以往來深圳的那條線為最。來往深圳的那條線帶來大量具有抗藥性的細菌，並且越靠近深圳的路線，其抗藥性細菌的量也越多。另外，抗藥性細菌的多寡和搭乘人口的多寡沒帶太大相關性，而是和其路線來往的地區有關。
(ps. 他們測試的抗生素為 tetracycline 和 vancomycin。)
Article:
Nature Highlights / Transport network’s handrails teem with a mix of microbes during evening rush hour
Paper:
Kang et al, The Environmental Exposures and Inner- and Intercity Traffic Flows of the Metro System May Contribute to the Skin Microbiome and Resistome. Cell Reports (2018)
人類手上的菌落叢樣貌會受到生活習慣的影響而改變，例如自己住或和其他人住、住哪裡或是有無寵物，還有搭乘的交通工具，都會影響身上帶有菌落生態。大眾交通系統因為搭乘的人多，又來自不同的區域，可以說是不同微生物種類的交會和交換場所。香港鐵路系統(Mass Transit Railway, MTR)每天的載客量約四百七十萬人，可以想見能在上面收集到各式各樣來自不同地方的細菌，我們可以從這些不同的微生物上觀察到它們的往來流動嗎？
香港大學由 Gianni Panagiotou 帶領的研究團隊在香港的八個捷運線上各採集了六個把手上的細菌，採集時間包括早上和傍晚的尖峰時段，採集者會握著把手或接觸其表面三十分鐘。這八條路線走的區不一樣，其中一條是連接到中國深圳的。
分析了不同時段和不同路線的細菌後，發現主要的細菌為這四種：Actinobacteria (51.3%), Proteobacteria (26.6%), Firmicutes (11.4%) 和 Bacteroidetes (2.3%)，其餘的 8.4% 為少數其他種類。這些採集到的細菌種類中，最主要的菌種為 P. acnes (29.1%)。另外，有趣的發現是 -- 早上的細菌最為多樣化，和那個路線走的區域有關聯性，可以從細菌看出那區的特徵，例如某個路線會出現比較多的土壤類或海洋累細菌。越孤立的鐵路線，其細菌的區域性越明顯。不過到了傍晚的時候，當人口在城市間大量流動之後，手把上的細菌會變成以人類相關的細菌為主，每條路線上的帶有區域性特徵的細菌減少了，而帶有抗藥性(antibiotic resistance genes, ARGs)、臨床上最為廣見的細菌增加了， 其中以往來深圳的那條線為最。來往深圳的那條線帶來大量具有抗藥性的細菌，並且越靠近深圳的路線，其抗藥性細菌的量也越多。另外，抗藥性細菌的多寡和搭乘人口的多寡沒帶太大相關性，而是和其路線來往的地區有關。
(ps. 他們測試的抗生素為 tetracycline 和 vancomycin。)
Article:
Nature Highlights / Transport network’s handrails teem with a mix of microbes during evening rush hour
Paper:
Kang et al, The Environmental Exposures and Inner- and Intercity Traffic Flows of the Metro System May Contribute to the Skin Microbiome and Resistome. Cell Reports (2018)
2018年8月5日 星期日
皰疹病毒和阿茲海默症的關係
之前有提過，關於阿茲海默症，有一派的學說認為腦中的 Aβ (amyloid-β) 和 tau 堆積可能是因為病毒或細菌感染所引起的，而最近有兩個發表在 Neuron 的研究顯示了皰疹病毒(herpesviruses)和阿茲海默症的關聯。其中一個研究分析了過世的病患的大腦後，發現患者的腦裡有兩種皰疹病毒的蹤跡，分別為 HHV-6A 和 HHV-7。Mount Sinai 的研究團隊定序了病患腦部的 DNA 和 RNA 想找到可以作為藥物標靶的東西，在分析了超過一千四百位過世病患腦部不同部位 -- 包括有 superior temporal gyrus (STG), anterior prefrontal cortex (APFC) 和 dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC) -- 的檢體後，在腦部的 AFPC 和 STC 發現了皰疹病毒 HHV-6A 的基因 U3/U4 (相似於 HHV-5 的 US22) 和 HHV-7 的 DR1，而且這些病毒似乎會影響人類的基因表現。他們發現 HHV-6A 會抑制 microRNA miR-155 的表現，當他們把老鼠 表現 miR-155 的基因拿掉後，其腦中的 Aβ 堆積會比正常老鼠的多。
他們也比較了阿茲海默症病患和其他患有神經性疾病的病患做比較，發現只有 AD 病患腦中的 HHV-6A 和 HHV-6 比較高。
HCMV: human cytomegalovirus, aka HHV-5
HHV-6 和 HHV-7 皆屬於皰疹病毒下的 roseoloviruses。HHV-6 有兩種：HHV-6A 和 HHV-6B。HHV-6A 會引發玫瑰疹 (roseola, aka exanthem subitum)，通常發生在幼兒身上，症狀是連續幾日的高燒，身上出現大塊紅疹。HHV-7 也會引發玫瑰疹，這兩種病毒很常見，大概有 90% 的成人都有。感染後病毒會潛伏在體內，HHV-6 會潛伏在免疫細胞 monocytes 和骨髓細胞(bone marrow progenitor cells)，HHV-7 會潛伏在 T cells。
另一個由哈佛醫學院和 MGH 合作的研究則是測試 Aβ 對皰疹病毒 HSV-1, HHV-6A 和 HHV-6B 的反應，他們認為 Aβ 是免疫系統的一環。在這篇研究中 Aβ oligomers 會結合皰疹病毒的表層膜中的醣蛋白(glycoprotein)，使病毒無法繼續活動或感染其他細胞。在神經細胞的實驗中，HHV-1, HHV-6A 和 HHV-6B 會加速 Aβ 的堆積，在感染後的 24 小時內便可觀察到 Aβ 堆積和纖維化(fibrilization)，而且 Aβ 可以抵抗 HSV-1 的感染。在老鼠實驗中也出現類似的結果，阿茲海默的基轉鼠 5XFAD 會在十到十二週大的時候腦中才出現 Aβ 堆積，但是卻在感染 HSV-1 的二十四小時後出現堆積。另外，HSV-1 會使老鼠出現腦炎(encephalitis)的病症，但是感染了 HSV-1 的 5XFAD 老鼠的存活率比感染後的野生鼠高，Aβ 會和 HSV-1 結合避免腦炎發生。HSV-1 的醣蛋白 glycoprotein B (gB) 會和 Aβ 結合，引起 Aβ 的纖維化，使病毒無法進入細胞，不過同時也會增加 Aβ 的堆積。
台灣的一個研究分析健保資料庫裡 2001 年間超過 33000 的病例，比較有無感染到 HSV-1 和得到失智症的比例，和得到 HSV-1 後有無用藥和得到失智症的比例後，發現 HSV-1 的感染使失智的機率增高 2.5 倍。（沒想到這篇文章會找到台灣的研究阿，但我覺得這只是表示兩者間有某種程度上的關聯，並不足以證明 HSV-1 感染會增加失智症的風險。）
Articles:
The Scientist / Herpes Viruses Implicated in Alzheimer’s Disease (June 2018)
NNR / How Herpes and Alzheimer's Disease are Linked (June 2018)
MGH / Amyloid beta protein protects brain from herpes infection by binding to, entrapping viral particles (July 2018)
Papers:
B. Readhead et al., Multi-scale analysis of independent Alzheimer’s cohorts finds disruption of molecular, genetic, and clinical networks by human herpesvirus. Neuron (2018)
W.A. Eimer et al, Alzheimer’s disease-associated β-amyloid is rapidly seeded by herpesviridae to protect against brain infection. Neuron (2018); Corrections: 10.1016/j.neuron.2018.11.043
NS Tzeng et al, Anti-herpetic Medications and Reduced Risk of Dementia in Patients with Herpes Simplex Virus Infections-a Nationwide, Population-Based Cohort Study in Taiwan. Neurotherapeutics (2018)
他們也比較了阿茲海默症病患和其他患有神經性疾病的病患做比較，發現只有 AD 病患腦中的 HHV-6A 和 HHV-6 比較高。
HCMV: human cytomegalovirus, aka HHV-5
HHV-6 和 HHV-7 皆屬於皰疹病毒下的 roseoloviruses。HHV-6 有兩種：HHV-6A 和 HHV-6B。HHV-6A 會引發玫瑰疹 (roseola, aka exanthem subitum)，通常發生在幼兒身上，症狀是連續幾日的高燒，身上出現大塊紅疹。HHV-7 也會引發玫瑰疹，這兩種病毒很常見，大概有 90% 的成人都有。感染後病毒會潛伏在體內，HHV-6 會潛伏在免疫細胞 monocytes 和骨髓細胞(bone marrow progenitor cells)，HHV-7 會潛伏在 T cells。
另一個由哈佛醫學院和 MGH 合作的研究則是測試 Aβ 對皰疹病毒 HSV-1, HHV-6A 和 HHV-6B 的反應，他們認為 Aβ 是免疫系統的一環。在這篇研究中 Aβ oligomers 會結合皰疹病毒的表層膜中的醣蛋白(glycoprotein)，使病毒無法繼續活動或感染其他細胞。在神經細胞的實驗中，HHV-1, HHV-6A 和 HHV-6B 會加速 Aβ 的堆積，在感染後的 24 小時內便可觀察到 Aβ 堆積和纖維化(fibrilization)，而且 Aβ 可以抵抗 HSV-1 的感染。在老鼠實驗中也出現類似的結果，阿茲海默的基轉鼠 5XFAD 會在十到十二週大的時候腦中才出現 Aβ 堆積，但是卻在感染 HSV-1 的二十四小時後出現堆積。另外，HSV-1 會使老鼠出現腦炎(encephalitis)的病症，但是感染了 HSV-1 的 5XFAD 老鼠的存活率比感染後的野生鼠高，Aβ 會和 HSV-1 結合避免腦炎發生。HSV-1 的醣蛋白 glycoprotein B (gB) 會和 Aβ 結合，引起 Aβ 的纖維化，使病毒無法進入細胞，不過同時也會增加 Aβ 的堆積。
台灣的一個研究分析健保資料庫裡 2001 年間超過 33000 的病例，比較有無感染到 HSV-1 和得到失智症的比例，和得到 HSV-1 後有無用藥和得到失智症的比例後，發現 HSV-1 的感染使失智的機率增高 2.5 倍。（沒想到這篇文章會找到台灣的研究阿，但我覺得這只是表示兩者間有某種程度上的關聯，並不足以證明 HSV-1 感染會增加失智症的風險。）
Articles:
The Scientist / Herpes Viruses Implicated in Alzheimer’s Disease (June 2018)
NNR / How Herpes and Alzheimer's Disease are Linked (June 2018)
MGH / Amyloid beta protein protects brain from herpes infection by binding to, entrapping viral particles (July 2018)
Papers:
B. Readhead et al., Multi-scale analysis of independent Alzheimer’s cohorts finds disruption of molecular, genetic, and clinical networks by human herpesvirus. Neuron (2018)
W.A. Eimer et al, Alzheimer’s disease-associated β-amyloid is rapidly seeded by herpesviridae to protect against brain infection. Neuron (2018); Corrections: 10.1016/j.neuron.2018.11.043
NS Tzeng et al, Anti-herpetic Medications and Reduced Risk of Dementia in Patients with Herpes Simplex Virus Infections-a Nationwide, Population-Based Cohort Study in Taiwan. Neurotherapeutics (2018)
2018年7月14日 星期六
Omega-3 和視網膜的關係
對人體有功能的不飽和脂肪酸 omega-3 有三種，分別為植物裡的 ALA (α-linolenic acid)，以及動物裡 EPA (eicosapentaenoic acid) 和 DHA (docosahexaenoic acid)。EPA 和 DHA 通常在魚裡，大家應該都知道或是聽過，尤其之前有個廣告好像是「魚肝油加蓋，保護眼睛，鞏固牙齒」的就有出現 DHA 的樣子。（咦，是否不小心洩漏的年紀？那個童星現在都是大人了吧？XD）之前有研究顯示，如果老鼠少了運送 DHA 跨過 BBB (blood-brain barrier) 進入腦部的蛋白質 Mfsd2a，就會引起嚴重的腦部和視網膜問題。
脂肪酸有不少功能，其中一個就是建構細胞膜，細胞膜的構造就是兩層尾對尾的脂肪酸(lipid bilayers)，除此之外，它還參與了訊息傳遞(signalling)的功能。DHA 很容易被氧化，氧化後會產生調節訊息傳遞的物質 epoxide。epoxide 會被酵素 sEH (soluble expoide hydrolase) 降解變成 19,20-DHDP (19,20-dihydroxydocosapentaenoic acid)，是視網膜裡 DHA 的主要代謝物。
之前的研究顯示，視網膜病變的要角是 VEGF (vascular emdothelial growth factor)，這個蛋白質會在低氧的情況下表現，作用在血管內皮細胞(vascular endothelial cells)的接收器上(VEGF receptor)，使血管變得脆弱易出血，用抑制 VEGF 的藥物可以使視網膜病變不再惡化，但並非對每個病患都有用，這表示 VEGF 可能並非唯一的致病因子。而這篇研究顯示，sEH 也參與了糖尿病引起的視網膜病變(diabetic retinopathy) [註 1]。
註 1：糖尿病視網膜病變的特徵有周皮細胞(pericytes)減少，無細胞微血管(acellular capillary)增生等等。）
DHA --> epoxide --> 19,20-DHDP
在這個研究裡，科學家讓其中一種神經細胞 Müller glia cells 能夠大量表現 sEH，結果出現了視網膜病變開始的徵兆，包括了 pericytes 的衰變，acellular capillary 增生造成不正常血液運送，血清滲漏出血管到週邊的細網膜組織，最終造成視網膜的血液循環不正常，細網膜出血等等。但是，當用藥物抑制 sEH 的表現或功能的話，可以預防這些症狀的發生，表示 sEH 是造成視網膜病變的因子。研究作者表示，造成病症的原因可能並非是 DHA 或 epoxide 不足，而是因為其代謝物 19,20-DHDP 所造成的。他們接著發現另外有三個蛋白質和病症有關：presenilin 1 (PSEN1) [註 2], vascular endothelial-cadherin (VE-cadherin) 和 neural-cadherin (N-cadherin)。這三個蛋白質皆位於細胞膜中，PSEN1 和 cadherins 會和膽固醇(cholesterol)組合在一起成為細胞膜中的 lipid rafts，cadherins 的功用是把兩個細胞緊密結合。但是當 19,20-DHDP 增加的話，這些蛋白和膽固醇的相互結合會被影響，cadherins 會被內收進細胞中(endocytosed)，使得細胞和細胞之間不再密合，並且內皮細胞的滲透度也增加了。
註 2： PSEN1 較為人知的可能是它的突變會導致阿茲罕默症
在老鼠實驗中，他們用了會在四個禮拜後出現高血糖(hyperglycaemia)症狀的糖尿病鼠。他們發現這些老鼠在三個月大的時候，視網膜內的 sEH 量會顯著增加。在六個月大的時候，視網膜裡的 sEH 活動會增加，並且出現視網膜病變的症狀。在一歲大的時候，sEH 的活動更為增加，並且老鼠眼內的 19,20-DHDP 也增加了。如果正常老鼠被餵食高醣、高脂肪連續二十週，出現了高血糖的症狀，但還沒有視網膜病變的情況，其 sEH 的表現量也有增高的現象。不過，在給老鼠 sEH inhibitor t-AUCB 後，19,20-DHDP 的生產量顯著降低了，視網膜病變的症狀也停止了。
重點整理：
- 糖尿病鼠的視網膜裡的 sEH 和 19,20-DHDP 量增加
- sEH 的過量表現會使正常老鼠的視網膜出現糖尿病鼠有的視網膜病變症狀。
- 19,20-DHDP 會影響細胞膜中膽固醇和 PSEN1, N-cadherin 和 VE-cadherin 的結合，造成細胞之間無法密合。
- sEH 的抑制劑可以預防周細胞的衰亡和血管滲透等視網膜病變的症狀。
Article:
Nature / A dark side to omega-3 fatty acids (Dec 2017)
Paper:
Hu et al, Inhibition of soluble epoxide hydrolase prevents diabetic retinopathy. Nature (2017)
Other resources:
NIH / Omega-3 fatty acids
脂肪酸有不少功能，其中一個就是建構細胞膜，細胞膜的構造就是兩層尾對尾的脂肪酸(lipid bilayers)，除此之外，它還參與了訊息傳遞(signalling)的功能。DHA 很容易被氧化，氧化後會產生調節訊息傳遞的物質 epoxide。epoxide 會被酵素 sEH (soluble expoide hydrolase) 降解變成 19,20-DHDP (19,20-dihydroxydocosapentaenoic acid)，是視網膜裡 DHA 的主要代謝物。
之前的研究顯示，視網膜病變的要角是 VEGF (vascular emdothelial growth factor)，這個蛋白質會在低氧的情況下表現，作用在血管內皮細胞(vascular endothelial cells)的接收器上(VEGF receptor)，使血管變得脆弱易出血，用抑制 VEGF 的藥物可以使視網膜病變不再惡化，但並非對每個病患都有用，這表示 VEGF 可能並非唯一的致病因子。而這篇研究顯示，sEH 也參與了糖尿病引起的視網膜病變(diabetic retinopathy) [註 1]。
註 1：糖尿病視網膜病變的特徵有周皮細胞(pericytes)減少，無細胞微血管(acellular capillary)增生等等。）
DHA --> epoxide --> 19,20-DHDP
在這個研究裡，科學家讓其中一種神經細胞 Müller glia cells 能夠大量表現 sEH，結果出現了視網膜病變開始的徵兆，包括了 pericytes 的衰變，acellular capillary 增生造成不正常血液運送，血清滲漏出血管到週邊的細網膜組織，最終造成視網膜的血液循環不正常，細網膜出血等等。但是，當用藥物抑制 sEH 的表現或功能的話，可以預防這些症狀的發生，表示 sEH 是造成視網膜病變的因子。研究作者表示，造成病症的原因可能並非是 DHA 或 epoxide 不足，而是因為其代謝物 19,20-DHDP 所造成的。他們接著發現另外有三個蛋白質和病症有關：presenilin 1 (PSEN1) [註 2], vascular endothelial-cadherin (VE-cadherin) 和 neural-cadherin (N-cadherin)。這三個蛋白質皆位於細胞膜中，PSEN1 和 cadherins 會和膽固醇(cholesterol)組合在一起成為細胞膜中的 lipid rafts，cadherins 的功用是把兩個細胞緊密結合。但是當 19,20-DHDP 增加的話，這些蛋白和膽固醇的相互結合會被影響，cadherins 會被內收進細胞中(endocytosed)，使得細胞和細胞之間不再密合，並且內皮細胞的滲透度也增加了。
註 2： PSEN1 較為人知的可能是它的突變會導致阿茲罕默症
在老鼠實驗中，他們用了會在四個禮拜後出現高血糖(hyperglycaemia)症狀的糖尿病鼠。他們發現這些老鼠在三個月大的時候，視網膜內的 sEH 量會顯著增加。在六個月大的時候，視網膜裡的 sEH 活動會增加，並且出現視網膜病變的症狀。在一歲大的時候，sEH 的活動更為增加，並且老鼠眼內的 19,20-DHDP 也增加了。如果正常老鼠被餵食高醣、高脂肪連續二十週，出現了高血糖的症狀，但還沒有視網膜病變的情況，其 sEH 的表現量也有增高的現象。不過，在給老鼠 sEH inhibitor t-AUCB 後，19,20-DHDP 的生產量顯著降低了，視網膜病變的症狀也停止了。
重點整理：
- 糖尿病鼠的視網膜裡的 sEH 和 19,20-DHDP 量增加
- sEH 的過量表現會使正常老鼠的視網膜出現糖尿病鼠有的視網膜病變症狀。
- 19,20-DHDP 會影響細胞膜中膽固醇和 PSEN1, N-cadherin 和 VE-cadherin 的結合，造成細胞之間無法密合。
- sEH 的抑制劑可以預防周細胞的衰亡和血管滲透等視網膜病變的症狀。
Article:
Nature / A dark side to omega-3 fatty acids (Dec 2017)
Paper:
Hu et al, Inhibition of soluble epoxide hydrolase prevents diabetic retinopathy. Nature (2017)
Other resources:
NIH / Omega-3 fatty acids
2018年7月7日 星期六
用沙門氏菌來治療癌症
癌細胞可以生存的一個點，就是它們突變後一直增生，而且不會被免疫系統攻擊，因為是自體細胞，而這個研究就是用沙門氏菌去感染癌細胞，讓它能被免疫系統認證，然後攻擊。
要怎麼引發免疫系統去攻擊癌細胞呢？韓國全南大學的學者發現一種水產細菌 Vibrio vulnificus (創傷弧菌) 會引起劇烈的免疫反應。創傷弧菌生存在水中，主要是 18C 以上的海洋，會被甲殼類生物（例如牡蠣或蝦子）吃進去，以此為傳播的媒介，人類吃進帶有創傷弧菌的海產會出現嘔吐或腹瀉等症狀。這個研究改造了對人體較無害的沙門氏菌株 Salmonella typhimurium，讓它能夠製造和分泌 vibrio 的一種蛋白質 FlaB。癌細胞被感染了改造過後的沙門桿菌後，分泌的 FlaB (flagellin B) 會引起免疫系統來攻擊它。他們發現 FlaB 引起的免疫反應是透過 TLR4 (toll-like receptor 4) signaling 來引發免疫細胞 -- 像是 monocytes, macrocyotes 和 neutrophils -- 來消滅癌細胞。他們把改造過後的沙門桿菌打到二十隻長有人類大腸癌(colon cancer)腫瘤的老鼠裡，發現三天後雖然老鼠肝臟、肺和脾臟裡的細菌都被免疫細胞清除了，但是帶有沙門氏菌的腫瘤細胞還在，不過在一百二十天之後，有十一隻老鼠的腫瘤消失了。有趣的是，直接把純化的 FlaB 打入腫瘤並沒有治療的效果，但是如果和無法分泌 FlaB 的沙門氏菌一起打入腫瘤，八隻老鼠中有三隻的腫瘤變小了。
之後，他們把轉移中(metastasizing)的人類大腸癌細胞移植到老鼠身上，然後在給牠們打入改造過後會分泌和不會分泌 FlaB 的沙門氏菌，發現被打入不會分泌 FlaB 沙門氏菌的老鼠在 27 天後，身上的癌細胞已大量轉移到各處了(只打入 PBS 的老鼠有 91 處轉移，打入不會分泌 FlaB 沙門氏菌的則有 26 處出現轉移腫瘤)，但是被打入會分泌 FlaB 沙門氏菌的老鼠只有四個轉移後的腫瘤。
他們利用 TLR4 K/O 和 TLR5 K/O 老鼠研究，發現如果沒有 TLR4 的話，帶有 FlaB 的沙門氏菌便沒有療效，表示其引起的免疫反應是透過 TLR4 signaling pathway，細菌無法啟動 monocytoes, macrophages 和 neutrophils 前來攻擊癌細胞，而之後 TLR5 signalling 則會增強免疫細胞抑制腫瘤的反應。
雖說用細菌引起免疫細胞來消滅癌細胞看起來頗有療效，但我覺得只有 55% 的話感覺有點低，另外那 45% 無法消滅腫瘤的原因是什麼呢？
Article:
Science / Scientists turn food poisoning microbe into powerful cancer fighter (2018)
Paper:
JH Zheng et al, Two-step enhanced cancer immunotherapy with engineered Salmonella typhimurium secreting heterologous flagellin. Science Translational Medicine (2017)
要怎麼引發免疫系統去攻擊癌細胞呢？韓國全南大學的學者發現一種水產細菌 Vibrio vulnificus (創傷弧菌) 會引起劇烈的免疫反應。創傷弧菌生存在水中，主要是 18C 以上的海洋，會被甲殼類生物（例如牡蠣或蝦子）吃進去，以此為傳播的媒介，人類吃進帶有創傷弧菌的海產會出現嘔吐或腹瀉等症狀。這個研究改造了對人體較無害的沙門氏菌株 Salmonella typhimurium，讓它能夠製造和分泌 vibrio 的一種蛋白質 FlaB。癌細胞被感染了改造過後的沙門桿菌後，分泌的 FlaB (flagellin B) 會引起免疫系統來攻擊它。他們發現 FlaB 引起的免疫反應是透過 TLR4 (toll-like receptor 4) signaling 來引發免疫細胞 -- 像是 monocytes, macrocyotes 和 neutrophils -- 來消滅癌細胞。他們把改造過後的沙門桿菌打到二十隻長有人類大腸癌(colon cancer)腫瘤的老鼠裡，發現三天後雖然老鼠肝臟、肺和脾臟裡的細菌都被免疫細胞清除了，但是帶有沙門氏菌的腫瘤細胞還在，不過在一百二十天之後，有十一隻老鼠的腫瘤消失了。有趣的是，直接把純化的 FlaB 打入腫瘤並沒有治療的效果，但是如果和無法分泌 FlaB 的沙門氏菌一起打入腫瘤，八隻老鼠中有三隻的腫瘤變小了。
之後，他們把轉移中(metastasizing)的人類大腸癌細胞移植到老鼠身上，然後在給牠們打入改造過後會分泌和不會分泌 FlaB 的沙門氏菌，發現被打入不會分泌 FlaB 沙門氏菌的老鼠在 27 天後，身上的癌細胞已大量轉移到各處了(只打入 PBS 的老鼠有 91 處轉移，打入不會分泌 FlaB 沙門氏菌的則有 26 處出現轉移腫瘤)，但是被打入會分泌 FlaB 沙門氏菌的老鼠只有四個轉移後的腫瘤。
他們利用 TLR4 K/O 和 TLR5 K/O 老鼠研究，發現如果沒有 TLR4 的話，帶有 FlaB 的沙門氏菌便沒有療效，表示其引起的免疫反應是透過 TLR4 signaling pathway，細菌無法啟動 monocytoes, macrophages 和 neutrophils 前來攻擊癌細胞，而之後 TLR5 signalling 則會增強免疫細胞抑制腫瘤的反應。
雖說用細菌引起免疫細胞來消滅癌細胞看起來頗有療效，但我覺得只有 55% 的話感覺有點低，另外那 45% 無法消滅腫瘤的原因是什麼呢？
Article:
Science / Scientists turn food poisoning microbe into powerful cancer fighter (2018)
Paper:
JH Zheng et al, Two-step enhanced cancer immunotherapy with engineered Salmonella typhimurium secreting heterologous flagellin. Science Translational Medicine (2017)
2018年6月10日 星期日
降解蛋白質的密碼
不知道大家對 degron 的了解有多少。細胞內的蛋白質經過一段時間後會被降解(degradation)，降解的方式有兩種：proteasomal 和 lysosomal。顧名思義，proteasomal 就是被 proteasome 降解，lysosomal 就是被 lysosome 降解。（廢話 XD）
大家可能已經知道的蛋白質被送到 proteasome 降解前，會被 E3 ligase 加一個標籤，就是 ubiquitin。E3 ligase 的輔助蛋白(adaptors)會幫它找到要降解蛋白質，怎麼找呢？就是辨識蛋白質尾端(C-terminus)的幾個氨基酸，那幾個氨基酸就是 degron。而不同的 adaptors 辨識的氨基酸也不同。我會知道 degron 是因為之前的研究，當你在蛋白質後面加上 degron，它就會被降解。如果說你知道 A 蛋白和 B 蛋白的某個片段 interact，你可以在 B 蛋白的那個片段後面加上 degron，利用加惹 degron 的片段去 knock down 蛋白 A。（想了解如何應用 degron 的話可以參考我前實驗室老闆發表的這篇： X Fan et al, Nature Neuroscience 2014; doi: 10.1038/nn.3637）
這篇研究做了一些分析，找出當蛋白質尾端是哪幾個氨基酸時，會被 adaptors 辨識出來，然後讓 E3 ligase 幫它標籤後送去降解。他們分析了兩種 E3 ligase：CRL2 和 CRL4。
CRL2 的其中一個 adaptor KLHDC3 辨識的是最尾端(-1 position)是否為 glycine，還有倒數第二(-2 position)是否為鹼性(basic)氨基酸，像是 arginine (R) 和 lysine (K)，也就是說 KLHDC3 辨識的最後兩氨基酸主要為 -RG 和 -KG。另一個 adaptor KLHDC2 辨識的則是 -GG，而 LKHDC10 辨識的是 -WG, -PG 和 -AG。另外，APPBP2 辨識的 -RxxG 不需要在最後，比較常見的是 RxxGx 和 RxxGxx。
他們分析的另一個 E3 ligase Cul4 (CRL4)，其 adaptors 辨識的氨基酸又不同。它的 DCAF12 辨識的是 -EE，而它的 TRPC4AP 辨識的是倒數第三個的 arginine (R-3 motif)。
除了以上的規則外，當最後一個氨基酸是 glycine 的時候會被送去降解，但是當倒數第二(-2 position)和第三個(-3 position)氨基酸是酸性(acidic)或是避水性(hydrophobic)的時候，像是 aspartic acid (D), glutamic acid (E), isoleucine (I) 或是 valine (V) 的時候，則會使蛋白質避免掉降解，例如當尾端是 -DG 或是 -EG 的時候。另外，當酸性氨基酸配上 lysine 的時候，也就是 -DK 和 -EK 的時候，也會使蛋白質穩定，避免被降解。
看到這裡，可能會有個疑問，那這樣不是會有一堆蛋白質被降解掉嗎？有趣的是他們分析後發現，大多數的蛋白質尾端都不是 glycine，而且這個現象只出現在 eukaryotic 和病毒的蛋白，細菌的蛋白質尾端是 glycine 明顯多很多，可能是因為細菌並沒有 proteasome。
Degron 的應用有其優缺點，優點是你只要知道 interaction site，就可以 knock down (K/D) 任何蛋白，而且它很短，所以容易製作。缺點則是並非所有的 interaction site 都可以拿來用，需要 affinity 夠強，有些 papers 雖說用 co-IP 找到和確認 binding motifs，但是裝上 degron 後發現它不夠強到可以 K/D 蛋白質，另外就是它不夠 stable。
原論文：
I Koren et al, The Eukaryotic Proteome Is Shaped by E3 Ubiquitin Ligases Targeting C-Terminal Degrons. Cell (2018)
大家可能已經知道的蛋白質被送到 proteasome 降解前，會被 E3 ligase 加一個標籤，就是 ubiquitin。E3 ligase 的輔助蛋白(adaptors)會幫它找到要降解蛋白質，怎麼找呢？就是辨識蛋白質尾端(C-terminus)的幾個氨基酸，那幾個氨基酸就是 degron。而不同的 adaptors 辨識的氨基酸也不同。我會知道 degron 是因為之前的研究，當你在蛋白質後面加上 degron，它就會被降解。如果說你知道 A 蛋白和 B 蛋白的某個片段 interact，你可以在 B 蛋白的那個片段後面加上 degron，利用加惹 degron 的片段去 knock down 蛋白 A。（想了解如何應用 degron 的話可以參考我前實驗室老闆發表的這篇： X Fan et al, Nature Neuroscience 2014; doi: 10.1038/nn.3637）
這篇研究做了一些分析，找出當蛋白質尾端是哪幾個氨基酸時，會被 adaptors 辨識出來，然後讓 E3 ligase 幫它標籤後送去降解。他們分析了兩種 E3 ligase：CRL2 和 CRL4。
CRL2 的其中一個 adaptor KLHDC3 辨識的是最尾端(-1 position)是否為 glycine，還有倒數第二(-2 position)是否為鹼性(basic)氨基酸，像是 arginine (R) 和 lysine (K)，也就是說 KLHDC3 辨識的最後兩氨基酸主要為 -RG 和 -KG。另一個 adaptor KLHDC2 辨識的則是 -GG，而 LKHDC10 辨識的是 -WG, -PG 和 -AG。另外，APPBP2 辨識的 -RxxG 不需要在最後，比較常見的是 RxxGx 和 RxxGxx。
他們分析的另一個 E3 ligase Cul4 (CRL4)，其 adaptors 辨識的氨基酸又不同。它的 DCAF12 辨識的是 -EE，而它的 TRPC4AP 辨識的是倒數第三個的 arginine (R-3 motif)。
除了以上的規則外，當最後一個氨基酸是 glycine 的時候會被送去降解，但是當倒數第二(-2 position)和第三個(-3 position)氨基酸是酸性(acidic)或是避水性(hydrophobic)的時候，像是 aspartic acid (D), glutamic acid (E), isoleucine (I) 或是 valine (V) 的時候，則會使蛋白質避免掉降解，例如當尾端是 -DG 或是 -EG 的時候。另外，當酸性氨基酸配上 lysine 的時候，也就是 -DK 和 -EK 的時候，也會使蛋白質穩定，避免被降解。
看到這裡，可能會有個疑問，那這樣不是會有一堆蛋白質被降解掉嗎？有趣的是他們分析後發現，大多數的蛋白質尾端都不是 glycine，而且這個現象只出現在 eukaryotic 和病毒的蛋白，細菌的蛋白質尾端是 glycine 明顯多很多，可能是因為細菌並沒有 proteasome。
Degron 的應用有其優缺點，優點是你只要知道 interaction site，就可以 knock down (K/D) 任何蛋白，而且它很短，所以容易製作。缺點則是並非所有的 interaction site 都可以拿來用，需要 affinity 夠強，有些 papers 雖說用 co-IP 找到和確認 binding motifs，但是裝上 degron 後發現它不夠強到可以 K/D 蛋白質，另外就是它不夠 stable。
原論文：
I Koren et al, The Eukaryotic Proteome Is Shaped by E3 Ubiquitin Ligases Targeting C-Terminal Degrons. Cell (2018)
2018年5月28日 星期一
偏頭痛的藥物研發
你有偏頭痛嗎？全世界有約 12% 的人年發生一次偏頭痛，女性發生的機率是男性的三倍，美國的 Migraine Research Foundation 估計美國員工每年因為偏頭痛請的病假共約 113 百萬天。
很久以前偏頭痛被認為是因為血管擴張(dilated)造成血流不正常，因此那時候給的藥都是收縮血管的藥，例如 ergotamine。不過 ergotamine 可能會使血管過度收縮，所以後來改用 triptans，其抑制偏頭痛的效果還可以，吃的人約有五、六成有改善，只是它並非對每個人都有用，且有的人是吃得越多，頭痛反而越頻繁。後來，一連串的 fMRI 研究發現，不正常的血流和偏頭痛似乎沒有關係 XD。之後，科學家試著找其他引發偏頭痛的原因，發現腦神經的電流傳遞如果被阻斷，造成的 cortical spreading depression (CSD) 可能也扮演著重要的角色，因為它會攪亂三叉神經(trigeminal nerve)和三叉血管系統(trigeminovascular system)。
接著，UCSD 的神經學家在研究一個控制體內鈉和鈣的甲狀腺賀爾蒙 calcitonin 的時候，發現同樣的 calcitonin 基因在腦中會製造出不太一樣的蛋白，也就是 alternative gene slicing，這個研究後來發表在 1982 年的 Nature。之後，CGRP (calcitonin gene-related peptide)被發現，其參與了痛覺，也控制血流。後來，瑞典的神經學家發現當偏頭痛發生時，三叉血管系統裡的神經(trigeminovascular nerves)會釋放出 CGRP，使血管擴張，並且會傳導痛覺。這些發現引起藥廠的興趣，德國的 Boehringer Ingelheim 和美國的 Merch 相繼研發抑制 CGRP receptor 的小分子藥物，可惜不是有不好的副作用，就是對肝臟有害。
2004 年開始，有些藥廠試著研發針對 CGRP 的抗體藥，不過後來因為 FDA 對止痛藥在安全上的要求越來越嚴苛，加上市場價值難以估計，範圍廣到從約為二十億美金到五百億美金，於是很多藥廠紛紛退縮。接著來到 2013，之前生技公司 Rinat 研發的抗體藥經過幾番轉手到了另一間生技公司 Teva 手中，此藥被命名為 TEV-38125，目前在臨床二期階段，顯示出來的效果不錯。除了 Teva 之外，另外有 Alder Biopharmaceuticals, Eli Lilly 和 Amgen 研發的抗體藥也在 Phase II，且效果也都不錯，這四間公司在爭第一個拿到 FDA 許可。
目前的臨床沒發現有什麼嚴重的副作用，不過也有科學家擔心，因為它會抑制血管擴張，如果用在有心血管疾病的患者身上，會不會使病情加重還未可知。
[2019-10-20 update] Amagen 研發的治療偏頭痛的新藥 Aimovig (erenumab) 已於去年通過 FDA 許可。
延伸閱讀：關於偏頭痛
Article:
Science / FDA just approved the first drug to prevent migraines. Here’s the story of its discovery—and its limitations
SG Amara et al, Alternative RNA processing in calcitonin gene expression generates mRNAs encoding different polypeptide products. Nature (1982)
很久以前偏頭痛被認為是因為血管擴張(dilated)造成血流不正常，因此那時候給的藥都是收縮血管的藥，例如 ergotamine。不過 ergotamine 可能會使血管過度收縮，所以後來改用 triptans，其抑制偏頭痛的效果還可以，吃的人約有五、六成有改善，只是它並非對每個人都有用，且有的人是吃得越多，頭痛反而越頻繁。後來，一連串的 fMRI 研究發現，不正常的血流和偏頭痛似乎沒有關係 XD。之後，科學家試著找其他引發偏頭痛的原因，發現腦神經的電流傳遞如果被阻斷，造成的 cortical spreading depression (CSD) 可能也扮演著重要的角色，因為它會攪亂三叉神經(trigeminal nerve)和三叉血管系統(trigeminovascular system)。
接著，UCSD 的神經學家在研究一個控制體內鈉和鈣的甲狀腺賀爾蒙 calcitonin 的時候，發現同樣的 calcitonin 基因在腦中會製造出不太一樣的蛋白，也就是 alternative gene slicing，這個研究後來發表在 1982 年的 Nature。之後，CGRP (calcitonin gene-related peptide)被發現，其參與了痛覺，也控制血流。後來，瑞典的神經學家發現當偏頭痛發生時，三叉血管系統裡的神經(trigeminovascular nerves)會釋放出 CGRP，使血管擴張，並且會傳導痛覺。這些發現引起藥廠的興趣，德國的 Boehringer Ingelheim 和美國的 Merch 相繼研發抑制 CGRP receptor 的小分子藥物，可惜不是有不好的副作用，就是對肝臟有害。
2004 年開始，有些藥廠試著研發針對 CGRP 的抗體藥，不過後來因為 FDA 對止痛藥在安全上的要求越來越嚴苛，加上市場價值難以估計，範圍廣到從約為二十億美金到五百億美金，於是很多藥廠紛紛退縮。接著來到 2013，之前生技公司 Rinat 研發的抗體藥經過幾番轉手到了另一間生技公司 Teva 手中，此藥被命名為 TEV-38125，目前在臨床二期階段，顯示出來的效果不錯。除了 Teva 之外，另外有 Alder Biopharmaceuticals, Eli Lilly 和 Amgen 研發的抗體藥也在 Phase II，且效果也都不錯，這四間公司在爭第一個拿到 FDA 許可。
目前的臨床沒發現有什麼嚴重的副作用，不過也有科學家擔心，因為它會抑制血管擴張，如果用在有心血管疾病的患者身上，會不會使病情加重還未可知。
[2019-10-20 update] Amagen 研發的治療偏頭痛的新藥 Aimovig (erenumab) 已於去年通過 FDA 許可。
延伸閱讀：關於偏頭痛
Article:
Science / FDA just approved the first drug to prevent migraines. Here’s the story of its discovery—and its limitations
SG Amara et al, Alternative RNA processing in calcitonin gene expression generates mRNAs encoding different polypeptide products. Nature (1982)
2018年5月5日 星期六
Python | 用線上 repl.it 寫程式和一些基礎語言
Python 除了可以用之前介紹的 jupyter notebook 外，也可以線上直接寫：repl.it
repl.it 除了可以讓你線上寫 code 之外，也可以自學。先申請一個帳號，登入後在右上角會出現功能列：learn/teach, student, my repls
點入 learn/teach 後下面就會出現很多線上課程，像是 Python, Javascript 等等，我目前是在試 Auto-Graded Course with Solutions 這個課，主要是教你怎麼寫程式，如果你之前有學過 C++ 之類的可能會比較容易上手。
（點圖可以放大）
如果直接連上上面那個網址，就會出現下面這個 coding 的頁面，最左欄是檔案夾，你可以登入後把你寫的東西存入。中間那欄是寫 code 的地方，寫好後點上面的 "run"，就會在最右邊那欄跑出來。
例如你在中間欄打入：
input() 這個功能是接受使用者輸入的東西，下面會解釋。
int() 的功能跟 R 的一樣，是指 integer，把輸入的東西變成數字的整數。str() 則是可以把數字變成 string。
print() 就是顯示出 () 裡面的結果
之前關於 Python 的那篇有簡單介紹一下，有興趣的可以先看那篇。（注意，這兩篇教的都是 Python 3.xx 以上的版本，Python 2.xx 的語法會有點不同。例如在 Python 2.xx 的版本裡，input() 的預設是 integer，但是在 Python 3.xx 裡則是 string，所以在上面的例子裡，a 和 b 需要用 int(input()) 把輸入的東西變成 integer，而在 Python 2.xx 的版本裡的話則不用，直接用 input() 讀出來的就是數字。）
上面寫好的 code 在跑了之後就會呈現在右欄，也就是你輸入的第一個數字會是 a，第二個數字會是 b，然後它會算出 a + b。所以當我輸入 3 和 5 後，它會算出 8，變成下面這樣：
上面的 3 和 5 是我輸入的數字，8 是它算出來的。
之前那篇有提過，Python 讀取的資料型態分為三種：string (字), integer (整數), float (有小數點的)。在數字外加 str() 就會把它變成 string。另外，在 print() 的功能裡，在字的外面加上 " " 或是 ' ' 的話，就會把它變成 string。用 int() 功能就會把獨到的東西變成 integer。
上面的程式簡單介紹了 integer，接下來介紹一下 string 會在哪裡用到。如果你想要在使用者輸入自己的名字後，出現歡迎詞 "Hello, xxx!"，那要怎麼寫呢？我們來拆解一下句子。
Hello, xxx! 這個句子可以拆成三部分：
"Hello, " 是 string。
"xxx" 是使用者輸入的名字，也就是 input()。
"!" 是 string。
要如何把這三個東西結合在一起變成一個句子顯示出來呢？有兩個方法，一個是用 +，另一個是用 , 。
在 Python 裡面，+ 除了有數學的功能，在 print() 裡面還有結合顯示的功能。
所以這個句子要讓它呈現，需要這樣寫：
Hello, 和 ! 因為是 string，所以要用 " " 括起來。注意，"Hello, " 的後面有個空格，它也是 string 的一部份，所以要放進去，如果沒有放進去，逗號的後面就會直接連名字，變成：
如果是用 , 的話，就是在每組字後面加 , ，而且每組之間會出現空白， 也就是說上面用 + 時需要自己加空格的部分，用 , 的話就不需要。例如上面的句子用 , 寫的話，就是這樣：
不過，因為每組字中間會出現空格，所以你輸入名字後，出現的會是：
你也可以把使用者輸入的名字指定為一個 variable，例如 name，指令寫成這樣：name = input()
於是，中間欄的程式碼可以這樣寫：
跑了程式之後，當你在右邊輸入名字，它就會出現：
Peter 是你輸入的名字，"Hello, Peter!" 和 "Hello, Peter !" 是程式讀取後顯示出來的 greetings，看出用 + 和用 , 的不同了嗎？
另外，+ 和 , 除了空格這個部分不一樣外，還有一個就是 + 不同種類的不能相加在一起，也就是說 interger 和 string 不能相加在一起顯示，需要把它們變成同類。用 , 的話則沒有這個限制。
例如我想要讓使用者輸入自己的名字和年齡後，出現這樣的句子：xxx is ??? years old
我們可以把句子拆成這樣：
"xxx" 是使用者輸入的名字，所以是 input()。
"is" 是 string
"???" 是使用者輸入的年齡，所以是 input()。
"years old" 是 string
跟上面一樣，可以把名字指定為 name，年齡指定為 age。
然後用 + 來寫的話就是：（注意要自己空格和把數字改為 string）
用 , 來寫的話則是：
除了讓使用者輸入，Python 跟 R 一樣也可以指定 variable，例如我們可以指定 year 為 1990，birthmonth 為 Feb。
Feb 是 string 所以要加 " "。上面的程式碼跑出來就會在右欄顯示出：
把上面的程式碼混在一起，比較完整的打在中間那欄：
把程式碼跑完後，在右欄輸入名字和年齡：Peter, 28
就會出現：
看出用 + 和用 , 的不同呢嗎？
最後，+ 用在數字是把兩個數字加在一起，但是用在 string 是把兩個字連在一起。咦，這不是上面講過了嗎？下面用數字做例子，解釋一下為什麼要再次提出來讓大家注意。
例如我想要顯示：The sum of a and b is (a + b)
把句子拆開來看就是：（記得要把句子中的空格算進 string 裡面）
"The sum of " 是 string
a 是 input()，是數字。
" and " 是 string
b 是 input()，是數字。
" is " 是 string
a + b 是算出來的結果，是 integer。
因為句子是 string，所以要用 + 的話，需要把裡面數字的部分在 print() 裡面設為 string，於是就會變成這樣：
如果用 , 的話就不需要，可以寫成這樣：
前面說過，Python 3.xx 裡的 input() 預設是 string，所以要把 a 和 b 設為 integer。
a = int(input())
b = int(input())
另外加 c 和 d 沒有設 int() 的做比較：
c = input()
d = input()
跟 R 一樣，可以查 variable 的格式是什麼。在 R 裡面是用 class() 的功能，在 Python 裡是用 type() 。查詢 a, b, c, d 的格式：
算算看 a + b 和 c + d 不同在哪：
用 + 和 , 的功能顯示：The sum of a and b is ....
把上面的程式碼整合，打在中間欄完整的 code 是：
跑程式碼後，在右邊輸入 a, b, c, d 四個數字，例如 3, 4, 5, 6，就會出現：
3, 4, 5, 6 是你輸入的數字，後面幾行是程式算出來的。可以看到 3 和 4 是 integer，5 和 6 是 string，所以 3 + 4 算出來是 7，但是 5 + 6 算出來是 56，因為是兩個 string 連在一起，而不是兩個數字加在一起。
以上，這篇的 Python 介紹就先到這吧。
repl.it 除了可以讓你線上寫 code 之外，也可以自學。先申請一個帳號，登入後在右上角會出現功能列：learn/teach, student, my repls
點入 learn/teach 後下面就會出現很多線上課程，像是 Python, Javascript 等等，我目前是在試 Auto-Graded Course with Solutions 這個課，主要是教你怎麼寫程式，如果你之前有學過 C++ 之類的可能會比較容易上手。
（點圖可以放大）
如果直接連上上面那個網址，就會出現下面這個 coding 的頁面，最左欄是檔案夾，你可以登入後把你寫的東西存入。中間那欄是寫 code 的地方，寫好後點上面的 "run"，就會在最右邊那欄跑出來。
例如你在中間欄打入：
|
a = int(input()) b = int(input()) print(a + b) |
input() 這個功能是接受使用者輸入的東西，下面會解釋。
int() 的功能跟 R 的一樣，是指 integer，把輸入的東西變成數字的整數。str() 則是可以把數字變成 string。
print() 就是顯示出 () 裡面的結果
之前關於 Python 的那篇有簡單介紹一下，有興趣的可以先看那篇。（注意，這兩篇教的都是 Python 3.xx 以上的版本，Python 2.xx 的語法會有點不同。例如在 Python 2.xx 的版本裡，input() 的預設是 integer，但是在 Python 3.xx 裡則是 string，所以在上面的例子裡，a 和 b 需要用 int(input()) 把輸入的東西變成 integer，而在 Python 2.xx 的版本裡的話則不用，直接用 input() 讀出來的就是數字。）
上面寫好的 code 在跑了之後就會呈現在右欄，也就是你輸入的第一個數字會是 a，第二個數字會是 b，然後它會算出 a + b。所以當我輸入 3 和 5 後，它會算出 8，變成下面這樣：
|
3 5 8 |
上面的 3 和 5 是我輸入的數字，8 是它算出來的。
|
在 R 裡面設定一個 variable 是用 <-，例如上面的例子，在 R 裡面可以寫成這樣： a <- 3 b <- 5 print(a + b) |
之前那篇有提過，Python 讀取的資料型態分為三種：string (字), integer (整數), float (有小數點的)。在數字外加 str() 就會把它變成 string。另外，在 print() 的功能裡，在字的外面加上 " " 或是 ' ' 的話，就會把它變成 string。用 int() 功能就會把獨到的東西變成 integer。
上面的程式簡單介紹了 integer，接下來介紹一下 string 會在哪裡用到。如果你想要在使用者輸入自己的名字後，出現歡迎詞 "Hello, xxx!"，那要怎麼寫呢？我們來拆解一下句子。
Hello, xxx! 這個句子可以拆成三部分：
"Hello, " 是 string。
"xxx" 是使用者輸入的名字，也就是 input()。
"!" 是 string。
要如何把這三個東西結合在一起變成一個句子顯示出來呢？有兩個方法，一個是用 +，另一個是用 , 。
在 Python 裡面，+ 除了有數學的功能，在 print() 裡面還有結合顯示的功能。
所以這個句子要讓它呈現，需要這樣寫：
| print("Hello, " + input() + "!") |
Hello, 和 ! 因為是 string，所以要用 " " 括起來。注意，"Hello, " 的後面有個空格，它也是 string 的一部份，所以要放進去，如果沒有放進去，逗號的後面就會直接連名字，變成：
| Hello,xxx! |
如果是用 , 的話，就是在每組字後面加 , ，而且每組之間會出現空白， 也就是說上面用 + 時需要自己加空格的部分，用 , 的話就不需要。例如上面的句子用 , 寫的話，就是這樣：
| print("Hello,", input(), "!") |
不過，因為每組字中間會出現空格，所以你輸入名字後，出現的會是：
| Hello, xxx ! |
你也可以把使用者輸入的名字指定為一個 variable，例如 name，指令寫成這樣：name = input()
於是，中間欄的程式碼可以這樣寫：
|
name = input() print("Hello, " + name + "!") print("Hello,", name, "!") |
跑了程式之後，當你在右邊輸入名字，它就會出現：
|
Peter Hello, Peter! Hello, Peter ! |
Peter 是你輸入的名字，"Hello, Peter!" 和 "Hello, Peter !" 是程式讀取後顯示出來的 greetings，看出用 + 和用 , 的不同了嗎？
另外，+ 和 , 除了空格這個部分不一樣外，還有一個就是 + 不同種類的不能相加在一起，也就是說 interger 和 string 不能相加在一起顯示，需要把它們變成同類。用 , 的話則沒有這個限制。
例如我想要讓使用者輸入自己的名字和年齡後，出現這樣的句子：xxx is ??? years old
我們可以把句子拆成這樣：
"xxx" 是使用者輸入的名字，所以是 input()。
"is" 是 string
"???" 是使用者輸入的年齡，所以是 input()。
"years old" 是 string
跟上面一樣，可以把名字指定為 name，年齡指定為 age。
|
name = input() age = input() |
然後用 + 來寫的話就是：（注意要自己空格和把數字改為 string）
| print(name + " is " + str(age) + " years old") |
用 , 來寫的話則是：
| print(name, "is", age, "years old") |
除了讓使用者輸入，Python 跟 R 一樣也可以指定 variable，例如我們可以指定 year 為 1990，birthmonth 為 Feb。
|
year = 1990 birthmonth = "Feb" print(birthmonth, year) |
Feb 是 string 所以要加 " "。上面的程式碼跑出來就會在右欄顯示出：
| Feb 1990 |
把上面的程式碼混在一起，比較完整的打在中間那欄：
|
name = input() age = input() birthmonth = "Feb" year = 1990 print(name, "was born in", birthmonth, year) print(name, "is", age, "years old") print(name + " was born in " + birthmonth + str(year)) print(name + " is " + str(age) + " years old") |
把程式碼跑完後，在右欄輸入名字和年齡：Peter, 28
就會出現：
|
Peter 28 Peter is 28 years old Peter was born in Feb 1990 Peter is 28 years old Peter was born in Feb1990 |
看出用 + 和用 , 的不同呢嗎？
最後，+ 用在數字是把兩個數字加在一起，但是用在 string 是把兩個字連在一起。咦，這不是上面講過了嗎？下面用數字做例子，解釋一下為什麼要再次提出來讓大家注意。
例如我想要顯示：The sum of a and b is (a + b)
把句子拆開來看就是：（記得要把句子中的空格算進 string 裡面）
"The sum of " 是 string
a 是 input()，是數字。
" and " 是 string
b 是 input()，是數字。
" is " 是 string
a + b 是算出來的結果，是 integer。
因為句子是 string，所以要用 + 的話，需要把裡面數字的部分在 print() 裡面設為 string，於是就會變成這樣：
| print("The sum of " + str(a) + " and " + str(b) + " is " + str(a + b)) |
如果用 , 的話就不需要，可以寫成這樣：
| print('The sum of', a, 'and', b, 'is', a+b) |
前面說過，Python 3.xx 裡的 input() 預設是 string，所以要把 a 和 b 設為 integer。
a = int(input())
b = int(input())
另外加 c 和 d 沒有設 int() 的做比較：
c = input()
d = input()
跟 R 一樣，可以查 variable 的格式是什麼。在 R 裡面是用 class() 的功能，在 Python 裡是用 type() 。查詢 a, b, c, d 的格式：
| print(type(a), type(b), type(c), type(d)) |
算算看 a + b 和 c + d 不同在哪：
|
print(a + b) print(c + d) |
用 + 和 , 的功能顯示：The sum of a and b is ....
|
print("The sum of " + str(a) + " and " + str(b) + " is " + str(a + b)) print('The sum of', a, 'and', b, 'is', a+b) |
把上面的程式碼整合，打在中間欄完整的 code 是：
|
a = int(input()) b = int(input()) c = input() d = input() print(type(a), type(b), type(c), type(d)) print(a + b) print(c + d) print("The sum of " + str(a) + " and " + str(b) + " is " + str(a + b)) print('The sum of', a, 'and', b, 'is', a+b) print('The sum of', c, 'and', d, 'is', c+d) |
跑程式碼後，在右邊輸入 a, b, c, d 四個數字，例如 3, 4, 5, 6，就會出現：
|
3 4 5 6 <class int=""> <class int=""> <class str=""> <class str=""> 7 56 The sum of 3 and 4 is 7 The sum of 3 and 4 is 7 The sum of 5 and 6 is 56 |
3, 4, 5, 6 是你輸入的數字，後面幾行是程式算出來的。可以看到 3 和 4 是 integer，5 和 6 是 string，所以 3 + 4 算出來是 7，但是 5 + 6 算出來是 56，因為是兩個 string 連在一起，而不是兩個數字加在一起。
以上，這篇的 Python 介紹就先到這吧。
2018年4月8日 星期日
抗發炎藥物似可預防阿茲海默症
如果阿茲海默症的預防可以這麼簡單，那真是好事。
關於阿茲海默症的一些知識可以先看這篇：阿茲海默症新藥 新進度 Aducanumab
或這篇：利用 ASO 治療阿茲海默症
這個研究是 UBC 的教授做的，重點有兩個：
1. Aβ42 不只出現在腦部，全身上下的器官中都有，包括口水中也有，口水中的是由頷下腺(submandibular glands)產生的。口水中的 Aβ42 可以用 ELISA 就測出來，所以其實可以早期發現早期治療，而不是像現在這樣要等到輕微失憶(mild cognitive impairment, MCI)的症狀出來 [註]。在他們的控制組中沒有 AD 症狀的案例)裡，測出的 Aβ42 可以分成兩組，一組是口水中 Aβ42 量較低的(19-25pg/ml)，一組是較高的(41-60pg/ml)。低的那組是沒有 AD 風險的 ，他們口水中的 Aβ42 量為約 20pg/ml。
註：AD 進展分為六個階段，一期五年，每五年會惡化一倍。通常症狀會在 65+ 歲顯現出來，倒推回去大概是在 55+ 歲左右開始。第二個階段(第二個五年開始)和第三個階段(第三個五年)可以用 PET scan 測出來。第四個階段會開始出現輕微失智(MCI)，海馬迴(hippocampus)的萎縮也可以用 MRI 看出來，這個階段開始，AD 便無法被預防。
AD 的鑑定方法目前有三種：
- CSF (cerebrospinal fluid)裡的 Aβ 和 tau 量是否降低，但因為 CSF 是流動的，這個方法有限制。
- 用 PET scan 看腦中是否有 Aβ 堆積
- 用 MRI 看腦部(尤其是海馬迴的部分)是否有萎縮
2. 普拿疼(Ibuprofen)等的非類固醇抗發炎藥物(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)可以預防阿茲海默症。
相關文章：治療阿茲海默症的另一種可能？
後發性(也就是非基因造成)的阿茲海默症病因一直以來都是個問號，目前皆認同的是因為 Aβ (β-amyloid)和 p-tau 堆積造成腦細胞死亡，進而造成失智。但近來發炎這個現象也被考慮為病因之一，只是還不清楚是因為 Aβ 和 p-tau 堆積才造成發炎，加速惡化，還是因為發炎了才引發堆積。總之，抗發炎這個路徑也在研究治療的範圍之中。
之前就有臨床研究發現，類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)的病患得 AD 的比例較低，但不知道原因。在過去的 25 年間，有很多研究顯示有服用抗發炎藥物的 RA 病患人口，其中有得到 AD 的比例比較低。另外，類風濕性關節炎發作時間比 AD 較早，RA 病患通常在早期就開始吃抗發炎藥物。他們發現服用 NSAIDs 需要在 AD 之前就開始吃，至少吃了半年，最好是已吃了五年以上。
Articles:
NNR / Ibuprofen Can Prevent Alzheimer's Disease -Apparently
Papers:
PL McGeer et al, Alzheimer’s Disease Can Be Spared by Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs. J Alzheimers Disease (2018)
M Lee et al, A Method for Diagnosing Alzheimer’s Disease Based on Salivary Amyloid- Protein 42 Levels. J Alzheimers Disease (2017)
McGeer et al, Inflammation, Antiinflammatory Agents, and Alzheimer’s Disease: The Last 22 Years. J Alzheimers Disease (2016)
關於阿茲海默症的一些知識可以先看這篇：阿茲海默症新藥 新進度 Aducanumab
或這篇：利用 ASO 治療阿茲海默症
這個研究是 UBC 的教授做的，重點有兩個：
1. Aβ42 不只出現在腦部，全身上下的器官中都有，包括口水中也有，口水中的是由頷下腺(submandibular glands)產生的。口水中的 Aβ42 可以用 ELISA 就測出來，所以其實可以早期發現早期治療，而不是像現在這樣要等到輕微失憶(mild cognitive impairment, MCI)的症狀出來 [註]。在他們的控制組中沒有 AD 症狀的案例)裡，測出的 Aβ42 可以分成兩組，一組是口水中 Aβ42 量較低的(19-25pg/ml)，一組是較高的(41-60pg/ml)。低的那組是沒有 AD 風險的 ，他們口水中的 Aβ42 量為約 20pg/ml。
註：AD 進展分為六個階段，一期五年，每五年會惡化一倍。通常症狀會在 65+ 歲顯現出來，倒推回去大概是在 55+ 歲左右開始。第二個階段(第二個五年開始)和第三個階段(第三個五年)可以用 PET scan 測出來。第四個階段會開始出現輕微失智(MCI)，海馬迴(hippocampus)的萎縮也可以用 MRI 看出來，這個階段開始，AD 便無法被預防。
AD 的鑑定方法目前有三種：
- CSF (cerebrospinal fluid)裡的 Aβ 和 tau 量是否降低，但因為 CSF 是流動的，這個方法有限制。
- 用 PET scan 看腦中是否有 Aβ 堆積
- 用 MRI 看腦部(尤其是海馬迴的部分)是否有萎縮
2. 普拿疼(Ibuprofen)等的非類固醇抗發炎藥物(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)可以預防阿茲海默症。
相關文章：治療阿茲海默症的另一種可能？
後發性(也就是非基因造成)的阿茲海默症病因一直以來都是個問號，目前皆認同的是因為 Aβ (β-amyloid)和 p-tau 堆積造成腦細胞死亡，進而造成失智。但近來發炎這個現象也被考慮為病因之一，只是還不清楚是因為 Aβ 和 p-tau 堆積才造成發炎，加速惡化，還是因為發炎了才引發堆積。總之，抗發炎這個路徑也在研究治療的範圍之中。
之前就有臨床研究發現，類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)的病患得 AD 的比例較低，但不知道原因。在過去的 25 年間，有很多研究顯示有服用抗發炎藥物的 RA 病患人口，其中有得到 AD 的比例比較低。另外，類風濕性關節炎發作時間比 AD 較早，RA 病患通常在早期就開始吃抗發炎藥物。他們發現服用 NSAIDs 需要在 AD 之前就開始吃，至少吃了半年，最好是已吃了五年以上。
Articles:
NNR / Ibuprofen Can Prevent Alzheimer's Disease -Apparently
Papers:
PL McGeer et al, Alzheimer’s Disease Can Be Spared by Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs. J Alzheimers Disease (2018)
M Lee et al, A Method for Diagnosing Alzheimer’s Disease Based on Salivary Amyloid- Protein 42 Levels. J Alzheimers Disease (2017)
McGeer et al, Inflammation, Antiinflammatory Agents, and Alzheimer’s Disease: The Last 22 Years. J Alzheimers Disease (2016)
2018年3月31日 星期六
R | ggplot: 整理圖的外觀 - scale, legend
會畫一些基本的圖了以後，這篇要介紹怎麼整理圖的外觀，例如改變兩軸的 scales 或是加標示(legend)等等，讓圖看起來比較清楚又簡單易懂。
關於這篇的課堂講義請看這：R Graphics with Ggplot2 - Day 2
這邊同要需要先跑下面這些 library。
同樣是用檔案資料 mpg，下面之前設好的 p1。（解說看這篇）
可以改變兩軸的名稱，只要在後面加這個：scale_x_continuous(" ") 和 scale_y_continuous(" ")，然後在 " " 裡面打入你想要的軸名就好了。
或是也可以簡單點用：xlab(' ') 和 ylab(' ')，然後在 ' ' 裡面打你要的軸名。
如果要加上圖的名稱或標題，則是在加上：ggtitle(' ')
也可以全部寫在一起：labs(x = ' ', y = ' ', title = ' ')
我們也可以設定 variable 裡面各個觀察的顏色，例如在這個例子裡，我們加入 year 這個變項，然後用顏色區分。
若要加入年份這個 variable，需要在 geom_point 裡面加入：aes(colour = factor(year)
這個指令也可以加在 p1 那層裡面，在這邊為求方便和易理解，所以加在後面。（細節解釋請看這篇和這篇）
如果想指定這個年份的顏色，可以用下面的語法設定你要的顏色，也可以設定旁邊圖標(figure legend)的名稱，例如把 factor(year) 改為 Year。
scale_colour_manual(name = " ", values = c(" ", " "))
在名字的地方打入你想要的名稱，在 values = c(" ", " ") 的地方打入你要的顏色。
除此之外，你也可以讓圖標只顯示出你要的觀察，例如說只顯示 2008 年的，並且把它改名為 To Date。
只想顯示某個觀察用：bearks =
把那個觀察改名用：labels = " "
也可以改變圖標的位置，用 theme() 功能裡的 legend.position。
語法是：theme(legend.position = )
如果不要圖標，就寫 none：theme(legend.position="none")
如果要更細部的挑整圖標，可以用 guides() 的功能。
對應前面的 colour = factor(year)，guides() 功能裡面用的是 colour = guide_legend()。可以在 guide_legend() 裡面設定圖標的標題、位置和格式。
設定標題的話就是直接在 guide_legend() 裡面輸入 "title" (title = 你想要的標題)。
設定位置則是用：label.position =
也可以把圖標設成兩欄的格式：ncol =
有從上面的圖中看出哪個語法是對應到哪個變化嗎？
接下來，我們用檔案資料 diamonds 來做其他改變。
在之前這一篇有畫過這個圖：
可以在其中加入另一個變項 cut，用顏色區分。
因為點太多，我們可以隨機挑出兩百個點做試驗，並把圖設為 d1。
隨機挑數的語法是：sample_n(dataframe, #)
上面的圖的 Y-axis 間隔都是相同的，我們可以把它改成倍數，也就是用 log 或是 log10。
要改軸的格式可以用上面介紹的 scale_x_continuous() 和 scale_y_continuous()。
在這兩個功能裡面可以設軸名、軸的格式、最大值和最小值，還有顯示哪幾個值。
設軸名：name = " "
設軸上各點的名字：label = c(" ", " ", " ", ...)
例如 X-axis 的標示是 2, 4, 6 的話，可以用 label = c("two", "four", "six") 這個語法改成 two, four, six。
軸的格式可以設成倍數，也就是從原本的 1, 2, 3, .... etc. 轉換成 1, 2, 4, 8, 16, ... etc，用的語法為：trans = "log" 或是 trans = "log10"
最大值和最小值：limits = c(min, max)
也可以用之前介紹過的：xlim(min, max)
只顯示某幾個值：breaks = c(x, y, z, ....)
顯示副軸(minor scale)：minor_breaks = （如果沒設的話就是 default 會出現，如果不想要就設 minor_breaks = NULL。）
接下來直接用上面的圖做變化，為了清楚表現以上幾個功能，先從最少的語法開始。下面是
跟上面的比較，可以看出軸名改了，成為：Price 和 Carat。圖的橫軸變成從 0.2 到 4，軸的點為指定的那四點，各點間依比例設距離，因此畫出來會是 log 的圖。圖的直軸也只顯示設的那幾個點，數字間的距離也是依比例畫的。兩軸皆沒有副軸。
再來加入副軸，也就是把 minor_breaks = NULL 拿掉。然後讓顯示的點都為等距，也就是用 trans = "log" 的功能來畫 log 的圖。
再來，我們可以改變圖標的名稱，用的語法是：scale_colour_discrete()
可以看到右邊圖標的名稱改了，如果想要改裡面各個小標的名稱的話，就在功能裡面加：labels = c(" ", " ", " ", ...)
最後，我們用檔案 msleep 來做個練習吧。
Exercise
1. Using the msleep data frame, plot the length of the sleep cycle versus the total amount of sleep. Indicate the animal’s diet by colour. Add appropriate labels to the axes and colour legend, and make the colour key labels more reader-friendly.
2. Using the msleep data frame, plot the body weight vs. the brain weight. Indicate the animal’s diet by colour. Add appropriate labels to the axes and colour legend. (Use a log axis if warranted.)
這邊我們會用另一個顏色的功能嘗試：scale_colour_brewer()
用法跟上面的很像，一樣是可以在裡面設定圖標名稱，另外就是這個是調色盤，也可以設定不同的色調，用的語法是：palette = " "
另外，上面介紹的 scale_x_continuous(trans = "log10") 和 scale_y_continuous(trans = "log10") 也可以用較短的 scale_x_log10() 和 scale_y_log10() 代替。
如果沒有設定色調的話，預設是藍色。如果想用其他色調的話，可以參考這裡，下面用的是 "Set2"。
3. Same as Exercise 2, but use the species name instead of a point. Add appropriate labels to the axes and colour legend. (Use a log axis if warranted.)
這邊要把點改成動物名稱，也就是用字去顯示每個點，用的功能是：geom_text()
因為我們要用動物名稱去標示每個點，所以要加入這個指令：label = name
好了，主要的幾個功能大概都介紹了，這篇就先到這邊吧。（總算把這篇打完惹）
關於這篇的課堂講義請看這：R Graphics with Ggplot2 - Day 2
這邊同要需要先跑下面這些 library。
|
library(ggplot2) library(dplyr) data(mpg) data(diamonds) |
同樣是用檔案資料 mpg，下面之前設好的 p1。（解說看這篇）
|
p1 <- ggplot(mpg, aes(displ, hwy)) p1 + geom_point(alpha = 1/5) |
可以改變兩軸的名稱，只要在後面加這個：scale_x_continuous(" ") 和 scale_y_continuous(" ")，然後在 " " 裡面打入你想要的軸名就好了。
|
p1 + geom_point(alpha = 1/5) + scale_x_continuous("Engine displacement (L)") + scale_y_continuous("Highway mileage (miles/gallon)") |
或是也可以簡單點用：xlab(' ') 和 ylab(' ')，然後在 ' ' 裡面打你要的軸名。
如果要加上圖的名稱或標題，則是在加上：ggtitle(' ')
|
p1 + geom_point(alpha = 1/5) + xlab('Engine displacement (L)') + ylab('Highway mileage (miles/gallon)') + ggtitle('How engine size relates its highway mileage') |
也可以全部寫在一起：labs(x = ' ', y = ' ', title = ' ')
|
p1 + geom_point(alpha = 1/5) + labs(x = 'Engine displacement (L)', y = 'Highway mileage (miles/gallon)', title = 'How engine size relates its highway mileage') |
我們也可以設定 variable 裡面各個觀察的顏色，例如在這個例子裡，我們加入 year 這個變項，然後用顏色區分。
若要加入年份這個 variable，需要在 geom_point 裡面加入：aes(colour = factor(year)
這個指令也可以加在 p1 那層裡面，在這邊為求方便和易理解，所以加在後面。（細節解釋請看這篇和這篇）
|
p1 + geom_point(aes(colour = factor(year))) + labs(x = 'Engine displacement (L)', y = 'Highway mileage (miles/gallon)', title = 'How engine size relates its highway mileage') |
如果想指定這個年份的顏色，可以用下面的語法設定你要的顏色，也可以設定旁邊圖標(figure legend)的名稱，例如把 factor(year) 改為 Year。
scale_colour_manual(name = " ", values = c(" ", " "))
在名字的地方打入你想要的名稱，在 values = c(" ", " ") 的地方打入你要的顏色。
|
p1 + geom_point(aes(colour = factor(year))) + labs(x = 'Engine displacement (L)', y = 'Highway mileage (miles/gallon)', title = 'How engine size relates its highway mileage') + scale_colour_manual(name = "Year", values = c("light green", "skyblue")) |
除此之外，你也可以讓圖標只顯示出你要的觀察，例如說只顯示 2008 年的，並且把它改名為 To Date。
只想顯示某個觀察用：bearks =
把那個觀察改名用：labels = " "
|
ggplot(mpg, aes(hwy, cty, colour = factor(year))) + geom_point() + scale_colour_manual(name = "Year", values = c("light green", "skyblue"), breaks = 2008, labels = "To Date")) |
也可以改變圖標的位置，用 theme() 功能裡的 legend.position。
語法是：theme(legend.position = )
| p1 + geom_point(aes(colour = factor(year))) + labs(x = 'Engine displacement (L)', y = 'Highway mileage (miles/gallon)', title = 'How engine size relates its highway mileage') + scale_colour_manual(name = "Year", values = c("light green", "skyblue")) + theme(legend.position = 'top') |
如果不要圖標，就寫 none：theme(legend.position="none")
如果要更細部的挑整圖標，可以用 guides() 的功能。
對應前面的 colour = factor(year)，guides() 功能裡面用的是 colour = guide_legend()。可以在 guide_legend() 裡面設定圖標的標題、位置和格式。
設定標題的話就是直接在 guide_legend() 裡面輸入 "title" (title = 你想要的標題)。
設定位置則是用：label.position =
也可以把圖標設成兩欄的格式：ncol =
|
p1 + geom_point(aes(colour = factor(year))) + labs(x = 'Engine displacement (L)', y = 'Highway mileage (miles/gallon)', title = 'How engine size relates its highway mileage') + guides(colour = guide_legend("Year", label.position = "bottom", ncol = 2)) |
有從上面的圖中看出哪個語法是對應到哪個變化嗎？
接下來，我們用檔案資料 diamonds 來做其他改變。
在之前這一篇有畫過這個圖：
|
ggplot(diamonds, aes(carat, price)) + geom_point(alpha = 1/15) |
可以在其中加入另一個變項 cut，用顏色區分。
|
ggplot(diamonds, aes(carat, price, colour = cut)) + geom_point(alpha = 1/15) |
因為點太多，我們可以隨機挑出兩百個點做試驗，並把圖設為 d1。
隨機挑數的語法是：sample_n(dataframe, #)
|
d1 <- ggplot(sample_n(diamonds, 200), aes(carat, price, colour = cut)) + geom_point() |
上面的圖的 Y-axis 間隔都是相同的，我們可以把它改成倍數，也就是用 log 或是 log10。
要改軸的格式可以用上面介紹的 scale_x_continuous() 和 scale_y_continuous()。
在這兩個功能裡面可以設軸名、軸的格式、最大值和最小值，還有顯示哪幾個值。
設軸名：name = " "
設軸上各點的名字：label = c(" ", " ", " ", ...)
例如 X-axis 的標示是 2, 4, 6 的話，可以用 label = c("two", "four", "six") 這個語法改成 two, four, six。
軸的格式可以設成倍數，也就是從原本的 1, 2, 3, .... etc. 轉換成 1, 2, 4, 8, 16, ... etc，用的語法為：trans = "log" 或是 trans = "log10"
最大值和最小值：limits = c(min, max)
也可以用之前介紹過的：xlim(min, max)
只顯示某幾個值：breaks = c(x, y, z, ....)
顯示副軸(minor scale)：minor_breaks = （如果沒設的話就是 default 會出現，如果不想要就設 minor_breaks = NULL。）
接下來直接用上面的圖做變化，為了清楚表現以上幾個功能，先從最少的語法開始。下面是
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d1 + scale_x_continuous(name = "Carat", limits = c(0.2, 4), breaks = c(0.25, 0.5, 1, 2, 4), minor_breaks = NULL) + scale_y_continuous(name = "Price", breaks = 1000 * c(0.5, 1, 2, 4, 8, 16), minor_breaks = NULL) |
跟上面的比較，可以看出軸名改了，成為：Price 和 Carat。圖的橫軸變成從 0.2 到 4，軸的點為指定的那四點，各點間依比例設距離，因此畫出來會是 log 的圖。圖的直軸也只顯示設的那幾個點，數字間的距離也是依比例畫的。兩軸皆沒有副軸。
再來加入副軸，也就是把 minor_breaks = NULL 拿掉。然後讓顯示的點都為等距，也就是用 trans = "log" 的功能來畫 log 的圖。
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d1 + scale_x_continuous(name = "Carat", limits = c(0.2, 4), trans = "log", breaks = c(0.25, 0.5, 1, 2, 4)) + scale_y_continuous(name = "Price", trans = "log10", breaks = 1000 * c(0.5, 1, 2, 4, 8, 16) |
再來，我們可以改變圖標的名稱，用的語法是：scale_colour_discrete()
| d1 + scale_x_continuous(name = "Carat", limits = c(0.2, 4), trans = "log", breaks = c(0.25, 0.5, 1, 2, 4)) + scale_y_continuous(name = "Price", trans = "log10", breaks = 1000 * c(0.5, 1, 2, 4, 8, 16) scale_colour_discrete("Cut") |
可以看到右邊圖標的名稱改了，如果想要改裡面各個小標的名稱的話，就在功能裡面加：labels = c(" ", " ", " ", ...)
最後，我們用檔案 msleep 來做個練習吧。
Exercise
1. Using the msleep data frame, plot the length of the sleep cycle versus the total amount of sleep. Indicate the animal’s diet by colour. Add appropriate labels to the axes and colour legend, and make the colour key labels more reader-friendly.
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ggplot(msleep, aes(sleep_total, sleep_cycle, colour = vore)) + geom_point() + labs(x = "Total sleep (h)", y = "Length of sleep cycle", title = "Animal Sleep") + scale_colour_discrete("Animal Diet", labels = c("carnivore", "herbivore", "insectivore", "omnivore", "N/A")) |
2. Using the msleep data frame, plot the body weight vs. the brain weight. Indicate the animal’s diet by colour. Add appropriate labels to the axes and colour legend. (Use a log axis if warranted.)
這邊我們會用另一個顏色的功能嘗試：scale_colour_brewer()
用法跟上面的很像，一樣是可以在裡面設定圖標名稱，另外就是這個是調色盤，也可以設定不同的色調，用的語法是：palette = " "
另外，上面介紹的 scale_x_continuous(trans = "log10") 和 scale_y_continuous(trans = "log10") 也可以用較短的 scale_x_log10() 和 scale_y_log10() 代替。
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ggplot(msleep, aes(brainwt, bodywt, colour = vore)) + geom_point() + labs(x = "Brain Weight (kg)", y = "Body Weight (kg)", title = "Animal Weight") + scale_x_log10() + scale_y_log10() + scale_colour_brewer("Diet") |
如果沒有設定色調的話，預設是藍色。如果想用其他色調的話，可以參考這裡，下面用的是 "Set2"。
| ggplot(msleep, aes(brainwt, bodywt, colour = vore)) + geom_point() + labs(x = "Brain Weight (kg)", y = "Body Weight (kg)", title = "Animal Weight") + scale_x_log10() + scale_y_log10() + scale_colour_brewer("Diet", palette = "Set2") |
3. Same as Exercise 2, but use the species name instead of a point. Add appropriate labels to the axes and colour legend. (Use a log axis if warranted.)
這邊要把點改成動物名稱，也就是用字去顯示每個點，用的功能是：geom_text()
因為我們要用動物名稱去標示每個點，所以要加入這個指令：label = name
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ggplot(msleep, aes(brainwt, bodywt, colour = vore)) + geom_text(aes(label = name)) + labs(x = "Brain Weight (kg)", y = "Body Weight (kg)", title = "Animal Weight") + scale_x_log10() + scale_y_log10() + scale_color_discrete("Diet") |
好了，主要的幾個功能大概都介紹了，這篇就先到這邊吧。（總算把這篇打完惹）
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