新冠病毒患者的免疫力可維持超過半年

根據感冒冠狀病毒和流感病毒的經驗，大多數人都認為人類體內對抗新冠病毒的免疫保護可能很短，大概感染後半年左右抗體就會降到測不到，尤其是無症狀和輕症的患者可能感染後抗體量本來就不高，不過到底可以維持多久呢？這個資訊可以讓我們預測疫苗提供的免疫保護持久力。從疫情開始至今也一年了，各國的資料也收集得差不多了吧。XD

La Jolla Institute 的研究團隊之前已經發表了兩篇相關研究，他們先是分析健康個體和 COVID-19 康復患者的血清，發現所有康復患者都有可辨識新冠病毒 Spike protein 的 CD4+ (helper) T cells，T cells 的反應程度和 IgG 量成正向相關，七成的康復患者有可對抗新冠病毒的 CD8+ (killer) T cells，而且反應強烈。康復患者除了帶有可辨識 Spike protein 的免疫細胞外，他們也帶有可辨識其他病毒蛋白的 T cells，像是 M protein 和 N protein。另外，他們也分析了疫情前採集到的血清，同樣帶有可辨識新冠病毒的 T cells。

相關文章：新冠病毒感染者體內 T 細胞的免疫反應

「他們檢測了於 2015-2018 年採樣到、沒有感染過新冠病毒的血液檢體，結果發現其中有 40% - 60% 含有可以辨識新冠病毒的 helper T cells，不過和康復患者不同的是他們的 T cells 反應雖然也是以 Spike 為主，但幾乎沒有對 N protein 或 M protein 有反應的 T cells，次主要的是 NSPs (non-structural proteins)。而之所以會有這些 T cells，可能是因為這些人之前感染過其他種類的冠狀病毒，cross-reactivity 使他們體內也有能辨識新冠病毒的 T cells。研究者們認為這是之前感染其他四種引起感冒症狀的冠狀病毒時產生的，因為這些血液檢體裡都有針對至少其中三種常見冠狀病毒的 T cells，血清檢測也顯示全部都有 HCoV-OC43 和 HCoV-NL43 Spike protein 的 IgG 抗體，表示大多數人都感染過常見的四種感冒冠狀病毒，而且至少感染過超過三種，而這也可能是為什麼大部分的人感染到新冠病毒後都只是輕症或無症狀。」

註：常見的四種感冒冠狀病毒為 NL63, 229E, OC43 和 HKU1。

在之後發表在 Science 研究裡，他們則是分析是哪些病毒片段使 CD4+ T cells 有 cross-reactivity，讓未感染個體的免疫系統能夠對新冠病毒有反應。

相關文章：抗新冠病毒的 T cells 和抗感冒冠狀病毒的有 cross-reactivity

在之前的研究裡，他們以分析 CD4+ T cells 的反應為主，而他們這個月發表的研究，三種 adaptive immunity 都分析了 -- CD4+ (helper) T cells, CD8+ (killer) T cells, memory B cells。在他們分析的近兩百位患者包括了無症狀患者、輕症、中度和重症患者，不過大多數(93%)為不需住院的輕症患者，年齡為 19 歲到 81 歲。其中有些患者的提供不同時期的血清檢體，間隔大約幾個月採集一次，其中有 63 個檢體是感染後超過半年後採集的。

他們分析了血清內的抗體後，發現九成患者的 anti-Spike IgG 可以六到八個月都穩定存在著，anti-nucleocapsid IgG 也差不多持續八個月穩定存在著，中和抗體主要為 anti-Spike RBD IgG，90% 患者的中和抗體也是穩定存在六到八個月。產生抗 Spike 抗體的 memory B cells 比症狀出現一個月後更多，倒是 CD4+ (helper) 和 CD8+ (killer) T cells 減少，存活週期(half-life)約為三到五個月。那生產抗體的 memory B cells 呢？他們發現患者體內針對新冠病毒的 memory B cells 在症狀出現後的 120 天內持續增加，之後呈現一個 plateau 的狀態。針對 Spike 的 memory B cells 中有約 10%-30% 是特別針對 Spike RBD。RBD-specific memory B cells 的狀況也差不多，不過可以早在症狀出現後十六天左右就開始持續增加，並且持續增加四到五個月。未感染者體內則幾乎沒有 Spike-specific memory B cells。既然有 anti-N protein 的抗體，當然就會有生產它的 nucleocapsid-specific memory B cells，也同樣是症狀出現後的四到五個月內持續穩定增加。

再來是 memory T cells。大約 70% 的患者在症狀出現後一個月(20-50 days)開始測得到針對新冠病毒的 memory CD8+ T cells，目標蛋白有 Spike, Membrane (M), Nucleocapsid (N) 和 ORF3a，其中約有 50% 患者體內的 CD8+ T cells 在六個月後仍穩定存在著，在感染後一個月，約有 93% 的患者可以測得到針對新冠病毒的 CD4+ T cells，目標蛋白除了 Spike, M, N, ORF3a 外，還有 nsp3，在六個月後體內 CD4+ T cells 仍穩定存在的患者有 92%。Spike-specific (CD4+ / CD8+) T cells 的穩定存在情況和針對新冠病毒的 T cells 類似，同樣可以穩定存在六個月以上。

最後，他們比較了免疫系統裡的其中五樣指標，看看他們維持多久。他們比較的五樣為 RBD IgG, RBD memory B cells, Spike IgA, total SARS-CoV-2-specific CD8+ T cells 和 total SARS-CoV-2-specific CD4+ T cells，因為這五樣在免疫保護力中扮演著重要角色。他們發現，大多數人(64%)在症狀出現後一到兩個月內，這五樣都穩定存在著，但在五到八個月後，這五樣在體內仍穩定存在的只剩 43%。不過呢，雖然五樣都降的人站了以半以上，但有 95% 的人在五到八個月後，至少有三樣仍穩定存在著，也就是說抗新冠病毒的免疫力並沒有之前以為的短，至少能夠維持半年以上，算是個好消息。

La Jolla 的研究已輕症為主，去年年底英國有個研究則是針對感染後無症狀或輕微症狀的醫護人員。倫敦醫院從去年三月底疫情爆發初期就開始每週驗 PCR 和血清，檢測和分析他們在英國封城後十六到十八週的 T cells 和抗體反應。

他們分析了倫敦醫院醫護人員的 T cells 和抗體，發現他們的 T cells 對新冠病毒 Spike 有反應的比例不高，只有 49%，反而對 N protein (neucleocapsid) 有反應的比例高達 85%。相較之下，疫情前的控制組對 Spike 和 N protein 有反應的比例為 29% 和 12%。不意外的，和 La Jolla 研究團隊的結果類似，未感染者血清也測得到對新冠病毒有反應的 T cells，不過到底是新冠病毒的哪個蛋白片段和感冒冠狀病毒有 cross-reactivity，是否和 La Jolla 研究團隊的結果一樣，則需要進一步的分析。

那抗體呢？有 97% 有抗 S1 IgG 或抗 N protein IgG/IgM，而且有 89% 的抗體是有抑制病毒作用的中和抗體，不過無症狀或輕微症狀患者的抗體量比症狀明顯的患者低。之前有研究顯示，新冠病毒患者的抗體量降的很快，可以在幾週內就降到測不到，不過有的研究卻顯示可以維持幾個月，而在這個研究顯示，是不管是無症狀、輕微症狀還是症狀明顯的患者，他們的中和抗體量在這 16 到 18 週中都維持固定的量，並沒有減低。另外，有趣的是五十歲以上的醫護人員中，有八成的中和抗體量很高(IC50 >200)[註]；相對的，24 歲到 49 歲有高中和抗體量的比例為 58%。

註：中和抗體量 IC50 = 0-49 為測不到，50-199 為低，200+ 為高。

那抗體和 T cell 反應是否有關聯，是否有抗新冠病毒 T cell 反應的人就有抗體，或是抗體量比較高呢？似乎關沒有絕對的關聯性，而這也和之前的研究結果類似，有不少人沒抗新冠病毒的抗體，但卻帶有對新冠病毒有反應的 T cells。

結論：目前看來，新冠病毒患者體內的抗體、生產抗體的 B cells，和前線對抗感染的 T cells 都可穩定存在五到八個月。


Publications:

CJ Reynolds et al, Discordant neutralizing antibody and T cell responses in asymptomatic and mild SARS-CoV-2 infection. Science (2020)

JM Dan et al, mmunological memory to SARS-CoV-2 assessed for up to 8 months after infection. Science (2021)

RJ Cox & KA Brokstad, Not just antibodies: B cells and T cells mediate immunity to COVID-19. Nature Reviews Immunology (2020)

新冠病毒感染者體內 T 細胞的免疫反應

人類體內對抗病菌的免疫機制除了透過抗體外，還有各種免疫細胞，雖然目前關於新冠病毒的研究大多著重在抗體，但免疫 T cells 也扮演著清除病毒的重要角色。康復者到底會不會免於二次感染呢？這可能和感染後產生多少抗體、抗體維持多久，和免疫細胞反應的強度有關，感染後要能產生有效的免疫反應，才表示疫苗的研發是有意義的。最近有篇研究是關於 T cells，發現有些未受 SARS-CoV-2 感染者的體內有對抗此病毒的 T cells，很可能是因為之前感染過其他冠狀病毒產生的。

關於免疫系統裡 T cells 和 B cells 的功能，我很喜歡下面這張圖，覺得畫得很清楚。B cells 是製造抗體的，T cells 是殺死受感染的細胞，但他們兩個都要先從 APC (antigen presenting cells) 那裡取得病毒的資料，才能製造出可以辨識病毒的抗體，或是受到感染的細胞。（就像你想讓狗去找嫌疑犯，要先讓牠聞一下嫌疑犯身上的味道，然後再讓牠去搜尋一樣。）


Figure / Development of immunity (Nature News 2020; doi: 10.1038/d41586-020-01221-y)

La Jolla Institute 的研究團隊想知道病毒的哪個部分可以引發強烈的 T 細胞反應，因為這個病毒蛋白的片段可能可以用來做疫苗。他們先預測了一些可能會引起強烈 T 細胞反應的病毒蛋白片段(peptides)，其中一組是 spike protein 的片段，另一組是除了 spike proteins 之外所有 SARS-CoV-2 蛋白的片段，每個約十個氨基酸長，然後把這些片段測試在 20 位新冠病毒康復患者的血清上。這二十位康復患者都算是輕症的，有症狀但是不需要住院，血清是在症狀出現後 20 - 35 天後，完全沒症狀後採集的，有先用 ELISA 檢測過，確定他們的血清內有抗 Spike protein RBD 的抗體。他們發現所有的康復患者都有可以辨識新冠病毒 Spike protein 的 helper (CD4+) T cells，helper T cells 反應的程度和 anti-Spike IgG 量正向相關，七成的患者有針對新冠病毒的 killer (CD8+) T cells，而且 T cells 的反應非常強烈。目前很多人對患者是否對新冠病毒有免疫力有疑慮，認為病毒不見得會引起免疫反應，加上有報導說有患者再次感染，不過這個研究顯示，大多數的患者的免疫系統是對新冠病毒有反應的。

註：helper T cells 負責幫助 B cells 產生抗體，和抗體 IgG 和 IgA 量有關；killer T cells (又稱 cytotoxic T cells, CTLs) 負責清除病毒。

除此之外，這些血清內也有可以辨識新冠病毒其他蛋白的 T cells，包括 M protein 和 N protein。所有患者的血清都有針對非 Spike protein 的 helper T cells，比例上大概是 50% 的 T cells 是針對 Spike protein，50% 是針對 Spike protein 以外的病毒蛋白。

由以上結果看，我們也許不用對疫苗研發太過悲觀，新冠病毒是可以引起免疫反應的，接下來要知道的是這個免疫反應是否能使人體對病毒產生保護作用，如果可以的話，研發出成功的疫苗是有希望的。

不過，這篇研究裡的患者是有症狀的，那無症狀患者是否也有可以辨識新冠病毒的 T cells，並能產生強烈的免疫反應呢？這篇研究裡沒有檢測無症狀患者的 T cells responses，但是檢測了未受感染者的 T cell responses。

他們檢測了於 2015-2018 年採樣到、沒有感染過新冠病毒的血液檢體，結果發現其中有 40% - 60% 含有可以辨識新冠病毒的 helper T cells，不過和康復患者不同的是他們的 T cells 反應雖然也是以 Spike 為主，但幾乎沒有對 N protein 或 M protein 有反應的 T cells，次主要的是 NSPs (non-structural proteins)。而之所以會有這些 T cells，可能是因為這些人之前感染過其他種類的冠狀病毒，cross-reactivity 使他們體內也有能辨識新冠病毒的 T cells。研究者們認為這是之前感染其他四種引起感冒症狀的冠狀病毒時產生的，因為這些血液檢體裡都有針對至少其中三種常見冠狀病毒的 T cells，血清檢測也顯示全部都有 HCoV-OC43 和 HCoV-NL43 Spike protein 的 IgG 抗體，表示大多數人都感染過常見的四種感冒冠狀病毒，而且至少感染過超過三種，而這也可能是為什麼大部分的人感染到新冠病毒後都只是輕症或無症狀。

註：四種常見的冠狀病毒為 HCoV-OC43, HCoV-HKU1, HCoV-NL63 和 HCoV-229E ，前兩者為 betacoronaviruses，後兩者為 alphacoronaviruses。

相關文章：感染過冠狀病毒是否就免疫了呢？

另外，上個月有篇發表在 medRxiv 也有類似的結果，他們除了從新冠病毒康復病患的體內發現有能夠辨認 Spike protein 的 helper T cells，也從沒感染過的個體裡發現可以辨識 SARS-CoV-2 的 helper T cells。



Articles:

Science / T cells found in COVID-19 patients ‘bode well’ for long-term immunity (May 2020)

TN / Analysis of SARS-CoV-2 Immune Response Bodes Well for Vaccine Development (May 2020)


Papers:

A Grifoni et al, Targets of T cell responses to SARS-CoV-2 coronavirus in humans with COVID-19 disease and unexposed individuals. Cell (2020)

J Braun et al, Presence of SARS-CoV-2 reactive T cells in COVID-19 patients and healthy donors. medRxiv (2020)

第一型糖尿病患的新型免疫細胞

對免疫系統稍有了解的，大概都知道免疫 T 細胞(T cells)和 B 細胞(B cells)，兩者的產地不同。T 細胞由胸腺(thymus)生產，又分為兩種，殺手 T 細胞(CTLs; cytotoxic T cells)和 helper T cells)，主要是用來殺死外來物，例如病毒和細菌。B 細胞則是產於骨髓(bone marrow)和淋巴結(lymph nodes)，功能是記住外來物的樣子，然後在相同外來物再度入侵時，可以生產抗體抵禦。

不過最近研究發現，第一型糖尿病患(Type I diabetes, T1D)有種特別的免疫細胞，是 B cell 和 T cell 的混合體，同時表現 TCR (T-cell receptors)和 BCR (B-cell receptors)，例如大多數的 DE cells 會表現 IgD 和 IgM [註 1]。另外，他們也同時表現 B cell 和 T cell 獨有的基因，目前暫稱為 dual expresser (DE) cells。普通的健康個體也有 DE cells，但是 T1D 患者比較多。除此之外，他們的 BCR CDR3 帶有一段特別的 amino acid sequence，只有第一型糖尿病患者的 BCR 才有，健康個體的沒有。第一型糖尿病主要是因為 T cells 跑去殺死製造胰島素(insulin)的胰臟 β cells，使其無法生產胰島素。目前認為 T 細胞會殺死 β cells 是因為胰島素的一個氨基酸片段 B:9-23 (SHLVEALYLVCGERG) 被 HLA (human leukocyte antigen)呈現給惹 T cells [註 2]，使它誤以為胰島素是入侵者需要被消滅，而表現胰島素的 HLA 則是 HLA-DQ8，一種大量出現在第一型糖尿病患裡的 HLA。B:9-23 片段對普通的 HLA-DQ8 的 affinity 是很低的，但是 T1D 患者的 DQ8 binding pocket 裡和胰島素接觸的兩個氨基酸(A14, R22)如果突變為 A14E 和 R22E 的話，affinity 會增加百倍以上。

註 1：BCR 簡單來說就是黏在 B cells 表面的抗體，所以也同樣有三個辨識抗原的 CDRs (complementarity-determining regions)。抗體有五種 -- IgA, IgD, IgE, IgG & IgM，BCRs 則主要為 IgD 和 IgM。

註 2：HLA 屬於 Class II MHC (MHCII)，表現在 APC (antigen-presenting cells) 表面，有個 binding pocket 會結合抗原(antigen)，然後把它呈現給 T cells，告訴 T cells 這是入侵物，快去殺死它。



作者們認為第一型糖尿病的 T 細胞會攻擊 β cells 是因為這段特別的氨基酸片段 DE peptide 可能會和 HLA-DQ8 結合，進而引發 T cells 的攻擊，他們用電腦模擬的結果發現 DE peptide 和 HLA-DQ8 的結合力非常強，比胰島素的片段還大到上萬倍，因此很可能引發強大的 T 細胞反應。而實際實驗結果也顯示 DE peptide 的確會和 HLA-DQ8 結合，並且會刺激第一型糖尿病患的 T helper cells 產生免疫反應，指示 CTLs 去攻擊胰臟的 β cells。不過，雖然目前看來第一型糖尿病患的 DE peptide 是引發 CTLs 去攻擊生產胰島素的 β cells 的原因，但是胰島素在這中間扮演了什麼角色呢？如果 HLA-DQ8 結合的目標物是 DE peptide，為什麼 CTLs 攻擊的會是 β cells 呢？目前原因還不清楚，需要更多的研究。



Article:

The Scientist / Novel Type of Immune Cell Discovered in Type 1 Diabetes Patients


Paper:

R Ahmed et al, A Public BCR Present in a Unique Dual-Receptor-Expressing Lymphocyte from Type 1 Diabetes Patients Encodes a Potent T Cell Autoantigen. Cell (2019)


Book: B Cells and Antibodies, Molecular Biology of the Cell (4th ed.)

2018 諾貝爾生醫獎：免疫系統中的檢測點 PD-1 和 CTLA-4

今年的諾貝爾生醫獎得主是免疫療法，分別為德州大學安德生癌症中心(University of Texas MD Anderson Cancer Center)的 James Allison 和日本京都大學的本庶佑。免疫細胞中有一種是 T -cells [註 1]，它的細胞膜上有接受器(T cell receptors, TCR)和其他輔助蛋白質會辨識非自體蛋白（例如細菌的或病毒的）和傳送訊息。要全面啟動 T cells 需要兩個訊息 ，一個是 T cells 上面的 TCR 和抗原的接合 [註 2]，另一個是 T cells 上面的 CD28 和 APC 表面的 B7 結合，CD28 表現在 naive T cells 上面。



Figure / M Alegre et al, Nature Reviews Immunology (2001)

註 1：T cells 又分成 helper T-cells (Th cells, CD4+ T cells) 和 cytotoxic T-cells (Tc cells, CTLs, CD8+ T cells)

註 2：抗原被 APC (antigen presenting cells) 收進細胞內後會變成小片段，然後再由過 MHC (major histocompatibility complex)呈現在 APC 表面讓 T cells 辨識，準確來說和 TCRs 結合的是 MHC:Ag。

Allison 發現 CTLs 上面的 CTLA-4 有抑制免疫反應的作用。如果說 TCR 和 CD28 是兩把鎖，MHC:Ag 和 B7 是鑰匙，解開後才會全面啟動免疫反應，那 CTLA-4 就像是安全鎖，防止 CD28 那個鎖被解開，因為它接合的對象是 B7，因此大多數人想到的是用 CTLA-4 去治療自體免疫性疾病(autoimmune disease)。不過 Allison 想到的是相反的方向，他發現 CTLA-4 的抗體會抑制 T-cell 的功能功能，並且增加免疫反應。他們把直腸癌腫瘤細胞打入老鼠裡，其中有部分老鼠同時和之後的第三天和第六天又各打入一劑 CTLA-4 抗體，結果發現沒打抗體的老鼠如預期長出腫瘤，並且持續變大，而同時也打入 CTLA-4 抗體的老鼠則是打入腫瘤細胞後的五天內長出小小腫瘤後又漸漸萎縮，然後消失了。他們給這些腫瘤長出後又消失的老鼠二次挑戰，看看之前打入的 CTLA-4 抗體的效果有沒有持續，結果這些老鼠並沒有再長出腫瘤。

CTLA-4 的抗體藥為 Bristol-Myers Squibb 的 Ipilimumab (品牌名為 Yervoy)，用來治療黑色素瘤(melanoma)。

讓京都大學的本庶佑得獎的是 PD-1，他發現這個蛋白質會表現在快死掉的 T-cells 的細胞膜表面，因此稱它為 programmed death 1 (PD-1)。PD-1 是 B7 家族的成員之一，其配位基(ligand)為 PD-L1 和 PD-L2。本庶佑和其團隊發現 PD-L1 和 B7 會一同表現在 APC 表面上外，其包括了被活化了的 blood monocytes。他們也發現，除了被活化的 APC 會表現 PD-L1，非免疫細胞的心臟和肺的組織細胞也會表現 PD-L1，它和 PD-1 結合會抑制淋巴細胞活化和繁衍；PD-L2 表現在正常的 dendritic cells 表面，和 PD-1 結合則會抑制 T cell 活化。

後來，他們和另一組研究團隊發現癌細胞也會表現 PD-L1，並且因此逃過免疫系統的偵測。之後，本庶佑和其團隊發現黑色素癌細胞(melanoma cells)無法在沒有 PD-1 的老鼠(PD-1 -/-)體內擴散，在沒有 PD-1 的情況下，CTLs 聚集在癌細胞，並且其活動力也加強了。他們同時也用了抗 PD-1 的抗體測試，發現 anti-PD1 mAb 抑制了老鼠肝臟裡癌細胞的生長，在大腸和肺的測試也得到同樣效果，阻斷 PD-1 和 PD-L1 之間的 interaction 可以抑制癌細胞生長。

雖然這兩個蛋白質都被稱為免疫機制裡的 checkpoint，然而目前臨床上的結果顯示 anti-PD-1 抗癌效果比 anti-CTLA-4 還要好。



Articles:

2018 Nobel Prize in Physiology and Medicine

Science / Cancer immunotherapy pioneers win medicine Nobel (Oct 2018)

Technology Networks / James P. Allison & Tasuku Honjo Win 2018 Nobel Prize for Medicine (Oct 2018)


Papers:

DR Leach et al, Enhancement of Antitumor Immunity by CTLA-4 Blockade. Science (1996)

M Alegre et al, T-cell regulation by CD28 and CTLA-4. Nature Reviews Immology (2001)

GJ Freeman et al, Engagement of the PD-1 Immunoinhibitory Receptor by a Novel B7 Family Member Leads to Negative Regulation of Lymphocyte Activation. JEM (2000)

Y Iwai et al, PD-1 blockade inhibits hematogenous spread of poorly immunogenic tumor cells by enhanced recruitment of effector T cells. Int Immunology (2004)