根據感冒冠狀病毒和流感病毒的經驗，大多數人都認為人類體內對抗新冠病毒的免疫保護可能很短，大概感染後半年左右抗體就會降到測不到，尤其是無症狀和輕症的患者可能感染後抗體量本來就不高，不過到底可以維持多久呢？這個資訊可以讓我們預測疫苗提供的免疫保護持久力。從疫情開始至今也一年了，各國的資料也收集得差不多了吧。XD
La Jolla Institute 的研究團隊之前已經發表了兩篇相關研究，他們先是分析健康個體和 COVID-19 康復患者的血清，發現所有康復患者都有可辨識新冠病毒 Spike protein 的 CD4+ (helper) T cells，T cells 的反應程度和 IgG 量成正向相關，七成的康復患者有可對抗新冠病毒的 CD8+ (killer) T cells，而且反應強烈。康復患者除了帶有可辨識 Spike protein 的免疫細胞外，他們也帶有可辨識其他病毒蛋白的 T cells，像是 M protein 和 N protein。另外，他們也分析了疫情前採集到的血清，同樣帶有可辨識新冠病毒的 T cells。
相關文章：新冠病毒感染者體內 T 細胞的免疫反應
「他們檢測了於 2015-2018 年採樣到、沒有感染過新冠病毒的血液檢體，結果發現其中有 40% - 60% 含有可以辨識新冠病毒的 helper T cells，不過和康復患者不同的是他們的 T cells 反應雖然也是以 Spike 為主，但幾乎沒有對 N protein 或 M protein 有反應的 T cells，次主要的是 NSPs (non-structural proteins)。而之所以會有這些 T cells，可能是因為這些人之前感染過其他種類的冠狀病毒，cross-reactivity 使他們體內也有能辨識新冠病毒的 T cells。研究者們認為這是之前感染其他四種引起感冒症狀的冠狀病毒時產生的，因為這些血液檢體裡都有針對至少其中三種常見冠狀病毒的 T cells，血清檢測也顯示全部都有 HCoV-OC43 和 HCoV-NL43 Spike protein 的 IgG 抗體，表示大多數人都感染過常見的四種感冒冠狀病毒，而且至少感染過超過三種，而這也可能是為什麼大部分的人感染到新冠病毒後都只是輕症或無症狀。」
註：常見的四種感冒冠狀病毒為 NL63, 229E, OC43 和 HKU1。
在之後發表在 Science 研究裡，他們則是分析是哪些病毒片段使 CD4+ T cells 有 cross-reactivity，讓未感染個體的免疫系統能夠對新冠病毒有反應。
相關文章：抗新冠病毒的 T cells 和抗感冒冠狀病毒的有 cross-reactivity
在之前的研究裡，他們以分析 CD4+ T cells 的反應為主，而他們這個月發表的研究，三種 adaptive immunity 都分析了 -- CD4+ (helper) T cells, CD8+ (killer) T cells, memory B cells。在他們分析的近兩百位患者包括了無症狀患者、輕症、中度和重症患者，不過大多數(93%)為不需住院的輕症患者，年齡為 19 歲到 81 歲。其中有些患者的提供不同時期的血清檢體，間隔大約幾個月採集一次，其中有 63 個檢體是感染後超過半年後採集的。
他們分析了血清內的抗體後，發現九成患者的 anti-Spike IgG 可以六到八個月都穩定存在著，anti-nucleocapsid IgG 也差不多持續八個月穩定存在著，中和抗體主要為 anti-Spike RBD IgG，90% 患者的中和抗體也是穩定存在六到八個月。產生抗 Spike 抗體的 memory B cells 比症狀出現一個月後更多，倒是 CD4+ (helper) 和 CD8+ (killer) T cells 減少，存活週期(half-life)約為三到五個月。那生產抗體的 memory B cells 呢？他們發現患者體內針對新冠病毒的 memory B cells 在症狀出現後的 120 天內持續增加，之後呈現一個 plateau 的狀態。針對 Spike 的 memory B cells 中有約 10%-30% 是特別針對 Spike RBD。RBD-specific memory B cells 的狀況也差不多，不過可以早在症狀出現後十六天左右就開始持續增加，並且持續增加四到五個月。未感染者體內則幾乎沒有 Spike-specific memory B cells。既然有 anti-N protein 的抗體，當然就會有生產它的 nucleocapsid-specific memory B cells，也同樣是症狀出現後的四到五個月內持續穩定增加。
再來是 memory T cells。大約 70% 的患者在症狀出現後一個月(20-50 days)開始測得到針對新冠病毒的 memory CD8+ T cells，目標蛋白有 Spike, Membrane (M), Nucleocapsid (N) 和 ORF3a，其中約有 50% 患者體內的 CD8+ T cells 在六個月後仍穩定存在著，在感染後一個月，約有 93% 的患者可以測得到針對新冠病毒的 CD4+ T cells，目標蛋白除了 Spike, M, N, ORF3a 外，還有 nsp3，在六個月後體內 CD4+ T cells 仍穩定存在的患者有 92%。Spike-specific (CD4+ / CD8+) T cells 的穩定存在情況和針對新冠病毒的 T cells 類似，同樣可以穩定存在六個月以上。
最後，他們比較了免疫系統裡的其中五樣指標，看看他們維持多久。他們比較的五樣為 RBD IgG, RBD memory B cells, Spike IgA, total SARS-CoV-2-specific CD8+ T cells 和 total SARS-CoV-2-specific CD4+ T cells，因為這五樣在免疫保護力中扮演著重要角色。他們發現，大多數人(64%)在症狀出現後一到兩個月內，這五樣都穩定存在著，但在五到八個月後，這五樣在體內仍穩定存在的只剩 43%。不過呢，雖然五樣都降的人站了以半以上，但有 95% 的人在五到八個月後，至少有三樣仍穩定存在著，也就是說抗新冠病毒的免疫力並沒有之前以為的短，至少能夠維持半年以上，算是個好消息。
La Jolla 的研究已輕症為主，去年年底英國有個研究則是針對感染後無症狀或輕微症狀的醫護人員。倫敦醫院從去年三月底疫情爆發初期就開始每週驗 PCR 和血清，檢測和分析他們在英國封城後十六到十八週的 T cells 和抗體反應。
他們分析了倫敦醫院醫護人員的 T cells 和抗體，發現他們的 T cells 對新冠病毒 Spike 有反應的比例不高，只有 49%，反而對 N protein (neucleocapsid) 有反應的比例高達 85%。相較之下，疫情前的控制組對 Spike 和 N protein 有反應的比例為 29% 和 12%。不意外的，和 La Jolla 研究團隊的結果類似，未感染者血清也測得到對新冠病毒有反應的 T cells，不過到底是新冠病毒的哪個蛋白片段和感冒冠狀病毒有 cross-reactivity，是否和 La Jolla 研究團隊的結果一樣，則需要進一步的分析。
那抗體呢？有 97% 有抗 S1 IgG 或抗 N protein IgG/IgM，而且有 89% 的抗體是有抑制病毒作用的中和抗體，不過無症狀或輕微症狀患者的抗體量比症狀明顯的患者低。之前有研究顯示，新冠病毒患者的抗體量降的很快，可以在幾週內就降到測不到，不過有的研究卻顯示可以維持幾個月，而在這個研究顯示，是不管是無症狀、輕微症狀還是症狀明顯的患者，他們的中和抗體量在這 16 到 18 週中都維持固定的量，並沒有減低。另外，有趣的是五十歲以上的醫護人員中，有八成的中和抗體量很高(IC50 >200)[註]；相對的，24 歲到 49 歲有高中和抗體量的比例為 58%。
註：中和抗體量 IC50 = 0-49 為測不到，50-199 為低，200+ 為高。
那抗體和 T cell 反應是否有關聯，是否有抗新冠病毒 T cell 反應的人就有抗體，或是抗體量比較高呢？似乎關沒有絕對的關聯性，而這也和之前的研究結果類似，有不少人沒抗新冠病毒的抗體，但卻帶有對新冠病毒有反應的 T cells。
結論：目前看來，新冠病毒患者體內的抗體、生產抗體的 B cells，和前線對抗感染的 T cells 都可穩定存在五到八個月。
Publications:
CJ Reynolds et al, Discordant neutralizing antibody and T cell responses in asymptomatic and mild SARS-CoV-2 infection. Science (2020)
JM Dan et al, mmunological memory to SARS-CoV-2 assessed for up to 8 months after infection. Science (2021)
RJ Cox & KA Brokstad, Not just antibodies: B cells and T cells mediate immunity to COVID-19. Nature Reviews Immunology (2020)
2021年1月9日 星期六
2020年11月20日 星期五
未感染新冠病毒的人也有抗體
之前已有好幾篇研究顯示，未感染者體內有抗新冠病毒的免疫 T cells，有可能是因為和其他的冠狀病毒有 cross-reactivity。這篇研究用 flow cytometry 分析了未感染者和患者抗冠狀病毒 Spike protein 的三種抗體 IgA, IgM 和 IgG，想知道新冠病毒和感冒冠狀病毒之間 cross-reactivity 程度有多少。
相關文章：未感染過新冠病毒或 SARS 的人也有對抗新冠病毒的 T cells
冠狀病毒的 Spike protein 分成 S1 和 S2 兩個 domains，S2 在冠狀病毒間的相似度比較高，叫有可能是 cross-reactivity 的來源。他們的 competitive binding assays 結果顯示，未感染者和患者的血清抗體間的 cross-reactivity 主要在於 S2。跟未感染者的抗體相較，患者血清內的抗體免感度(sensitivity)和專一性(specificity)比較高。
相關文章：抗新冠病毒的 T cells 和抗感冒冠狀病毒的有 cross-reactivity
這種 cross-reactivity 有多普及呢？他們分析了疫情前 2011 年到 2019 年時收集的血清，和新冠病毒患者的血清做比較。結果顯示冠狀病毒間的 cross-reactivity 在年輕族群中比較普遍，2011 年到 2018 年間，十六歲以下的健康個體約有 50% 的血清內有可辨識新冠病毒 Spike 的 IgG，17 - 25 歲之間只有 2%；2019 年採集的中年族群的血清，約有 8% 有低量的、可辨識新冠病毒 Spike 的 IgG。例外，新冠病毒患者血清內同時有可辨識 Spike 的 IgG, IgM 和 IgA，而未感染者的則主要為 IgG，沒有 IgM 和 IgA，重要的是未感染者血清內的抗體具有中和新冠病毒的效力。
Paper:
KW Ng et al, Preexisting and de novo humoral immunity to SARS-CoV-2 in humans. Science (2020)
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Paper:
KW Ng et al, Preexisting and de novo humoral immunity to SARS-CoV-2 in humans. Science (2020)
2020年8月8日 星期六
不需用細胞和病毒的中和抗體檢測
快速抗體檢測，這是之前新加坡大學和 Duke University 合作的那個，他們測的是體內的中和抗體(neutralizing antibodies)，就是可以和病毒結合，使它不能感染細胞，有抑制病毒作用的抗體。
要測體內是否有中和抗體，需要做抗體中和檢測(virus neutralization test, VNT)，簡單來說就是把抗體和病毒先混在一起 incubate，一個小時後再把抗體和病毒的混合物來拿來感染細胞，看看感染率有多少。中和抗體越多，可以抑制的病毒也就愈多，感染的細胞也就越少。通常這種檢測用的是原本的、活的病毒，所以要測新冠病毒的中和抗體的話，用的就是新冠病毒，不過如果要用新冠病毒，就需要 BSL3 的實驗室。在這篇論文裡，他們用的方法是 surrogate VNT (sVNT)，不需要用活的病毒，也不需要細胞，所以在 BSL2 實驗室就可以做，而且論文說他們在新加坡(n=175)和中國(n=50)的患者群身上測試結果，99.93% specificity (準確度) & 95-100% sensitivity (敏感度)。
相關文章：新冠病毒(SARS-CoV-2)的檢測 -- qPCR 和抗體
不用病毒，也不用細胞，要怎麼測試呢？因為我們已經知道新冠病毒感染是透過它的 spike protein RBD (receptor-binding domain) 和人類細胞表面的接受器 ACE2 結合而進入細胞的，所以他們認為只要在 ELISA plate 上測試就可以了，看了論文裡的圖示，其實就是普通的 ELISA，把 ACE2 coat 在 ELISA 上面，當作是細胞表面，然後把患者血清和 RBD 混合，RBD 已經是 HRP-conjugate，之後再把混合後的 Ab/RBD-HRP 加到 ACE2-coated ELISA plate，最後測訊號看看有多少 RBD 和 ACE2 結合，訊號越低的就表示血清裡中和抗體的含量越高。
他們還和兔子、老鼠、駱馬和人類的其他十五個 mAb 做比較，看看他們的 sVNP 是否能分別出普通抗體和有中和作用的抗體，結果顯示那些 mAb 在他們的 sVNP 檢測裡只有微弱的中和病毒的效用，有的甚至沒有，表示 sVNP 測到的是中和抗體的含量，而不是所有抗新冠病毒的抗體 [註]。
註：並不是所有抗新冠病毒的抗體都是中和抗體，有抑制病毒的效用，之前有研究顯示只有 anti-Spike S1 和 anti-Spike RBD 的抗體有抑制病毒的效用。
相關文章：近期和新冠病毒抗體相關的研究
除此之外，論文裡說他們的 sVNT 測的是所有中和病毒的 isotypes，也就是包括 IgG 和 IgM，不像其他大多數的抗體檢測，只有測 IgG 或 IgM。他們用了不同濃度的 IgM 和 IgG 抗體去測，都可以測到中和抗體，即便 IgG 和 IgM 量都很低，也可以測出中和抗體 70-90% 的抑制功效，表示他們的 sVNT 的敏感度很高。另外，他們也試了不同動物的中和抗體和普通抗體，也就是把 RBD 或整顆病毒打入動物體內，被打入 RBD 的動物體內產生的抗體便都會是有抑制效用的中和抗體，打入整顆病毒的可能只有部分是中和抗體，結果顯示皆可測到中和抗體，不過被打入 RBD 的動物血清抑制病毒的效力比較高。
最後，就是測試準確度了，看看 sVNT 是否可分別出 SARS, 新冠病毒和其他的冠狀病毒。實驗結果顯示感冒冠狀病毒(229E, NL63 or OC43)患者的血清裡並沒有測到可抑制新冠病毒的抗體，而 SARS 康復患者的血清內則有一點點，顯示有一點 cross-reactivity。不過當把 SARS sVNT 和 SARS-CoV-2 sVNT 放在一起比較的話，是可以看出分別的，SARS 康復患者的血清對 SARS RBD 的抑制效果比 SARS-CoV-2 要好。
雖然他們在 sVNT 裡 SARS 患者的血清和新冠病毒是有 cross-reactivity，但其他研究團隊用病毒和細胞系統的中和檢測(conventional VNT, cVNT)中是沒有的，所以這表示 sVNT 的敏感度比較高嗎？我覺得有意思的是 SARS 康復患者的血清裡仍測得到中和抗體，大家都知道 SARS 已經過去十七年了，這表示感染過 SARS 後，體內的抗體能維持十七年，而不是之前認為的只有三年嗎？他們有跟 2003 年時，感染不到一年後採的血清相比，十七年後血清內的中和抗體量是比感染不到一年時低，但也沒有說低很多。
他們也和普通的 cVNT 做比較，看結果是否一樣，sVNT 的結果是否可以轉譯成 cVNT，看起來結果是一樣的，表示 sVNT 應該可以取代 cVNT。剛需要花上兩三天的 cVNT 相比，sVNT 花的時間是要短得多，一天內可以搞定，不過論文中說只要一、兩個小時也 .... incubation 就兩個小時惹，再加處理血清和做 ELISA 本身的時間，總共也要花個三、四個小時吧，雖然他們用 RBD-HRP 就可以少一個小時的 incubation time, but still.... 不過它的好處是普通實驗室就可以做惹。
原論文：
CW Tan et al, A SARS-CoV-2 surrogate virus neutralization test based on antibody-mediated blockage of ACE2–spike protein–protein interaction. Nature Biotech (2020)
要測體內是否有中和抗體，需要做抗體中和檢測(virus neutralization test, VNT)，簡單來說就是把抗體和病毒先混在一起 incubate，一個小時後再把抗體和病毒的混合物來拿來感染細胞，看看感染率有多少。中和抗體越多，可以抑制的病毒也就愈多，感染的細胞也就越少。通常這種檢測用的是原本的、活的病毒，所以要測新冠病毒的中和抗體的話，用的就是新冠病毒，不過如果要用新冠病毒，就需要 BSL3 的實驗室。在這篇論文裡，他們用的方法是 surrogate VNT (sVNT)，不需要用活的病毒，也不需要細胞，所以在 BSL2 實驗室就可以做，而且論文說他們在新加坡(n=175)和中國(n=50)的患者群身上測試結果，99.93% specificity (準確度) & 95-100% sensitivity (敏感度)。
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不用病毒，也不用細胞，要怎麼測試呢？因為我們已經知道新冠病毒感染是透過它的 spike protein RBD (receptor-binding domain) 和人類細胞表面的接受器 ACE2 結合而進入細胞的，所以他們認為只要在 ELISA plate 上測試就可以了，看了論文裡的圖示，其實就是普通的 ELISA，把 ACE2 coat 在 ELISA 上面，當作是細胞表面，然後把患者血清和 RBD 混合，RBD 已經是 HRP-conjugate，之後再把混合後的 Ab/RBD-HRP 加到 ACE2-coated ELISA plate，最後測訊號看看有多少 RBD 和 ACE2 結合，訊號越低的就表示血清裡中和抗體的含量越高。
他們還和兔子、老鼠、駱馬和人類的其他十五個 mAb 做比較，看看他們的 sVNP 是否能分別出普通抗體和有中和作用的抗體，結果顯示那些 mAb 在他們的 sVNP 檢測裡只有微弱的中和病毒的效用，有的甚至沒有，表示 sVNP 測到的是中和抗體的含量，而不是所有抗新冠病毒的抗體 [註]。
註：並不是所有抗新冠病毒的抗體都是中和抗體，有抑制病毒的效用，之前有研究顯示只有 anti-Spike S1 和 anti-Spike RBD 的抗體有抑制病毒的效用。
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除此之外，論文裡說他們的 sVNT 測的是所有中和病毒的 isotypes，也就是包括 IgG 和 IgM，不像其他大多數的抗體檢測，只有測 IgG 或 IgM。他們用了不同濃度的 IgM 和 IgG 抗體去測，都可以測到中和抗體，即便 IgG 和 IgM 量都很低，也可以測出中和抗體 70-90% 的抑制功效，表示他們的 sVNT 的敏感度很高。另外，他們也試了不同動物的中和抗體和普通抗體，也就是把 RBD 或整顆病毒打入動物體內，被打入 RBD 的動物體內產生的抗體便都會是有抑制效用的中和抗體，打入整顆病毒的可能只有部分是中和抗體，結果顯示皆可測到中和抗體，不過被打入 RBD 的動物血清抑制病毒的效力比較高。
最後，就是測試準確度了，看看 sVNT 是否可分別出 SARS, 新冠病毒和其他的冠狀病毒。實驗結果顯示感冒冠狀病毒(229E, NL63 or OC43)患者的血清裡並沒有測到可抑制新冠病毒的抗體，而 SARS 康復患者的血清內則有一點點，顯示有一點 cross-reactivity。不過當把 SARS sVNT 和 SARS-CoV-2 sVNT 放在一起比較的話，是可以看出分別的，SARS 康復患者的血清對 SARS RBD 的抑制效果比 SARS-CoV-2 要好。
雖然他們在 sVNT 裡 SARS 患者的血清和新冠病毒是有 cross-reactivity，但其他研究團隊用病毒和細胞系統的中和檢測(conventional VNT, cVNT)中是沒有的，所以這表示 sVNT 的敏感度比較高嗎？我覺得有意思的是 SARS 康復患者的血清裡仍測得到中和抗體，大家都知道 SARS 已經過去十七年了，這表示感染過 SARS 後，體內的抗體能維持十七年，而不是之前認為的只有三年嗎？他們有跟 2003 年時，感染不到一年後採的血清相比，十七年後血清內的中和抗體量是比感染不到一年時低，但也沒有說低很多。
他們也和普通的 cVNT 做比較，看結果是否一樣，sVNT 的結果是否可以轉譯成 cVNT，看起來結果是一樣的，表示 sVNT 應該可以取代 cVNT。剛需要花上兩三天的 cVNT 相比，sVNT 花的時間是要短得多，一天內可以搞定，不過論文中說只要一、兩個小時也 .... incubation 就兩個小時惹，再加處理血清和做 ELISA 本身的時間，總共也要花個三、四個小時吧，雖然他們用 RBD-HRP 就可以少一個小時的 incubation time, but still.... 不過它的好處是普通實驗室就可以做惹。
原論文：
CW Tan et al, A SARS-CoV-2 surrogate virus neutralization test based on antibody-mediated blockage of ACE2–spike protein–protein interaction. Nature Biotech (2020)
2020年6月27日 星期六
新冠肺炎患者體內的抗體有哪些
這篇研究分析了六十幾位 COVID-19 患者體內的抗體，想知道他們在感染後的產生時間和其 neutralizing 的功效。
摘要：
1. 用 ELISA 實驗的結果，發現用 Spike RBD (receptor-binding domain) 來測試患者體內抗體的 specificity 和 sensitivity 比較高。
2. 幾乎沒有患者在症狀出現後八天內有測到中和抗體(neutralizing antibodies)，然後在第 21 天時有 91% 的患者測得到低量的 neutralizing antibodies，只有 73% 的患者體內有保護作用的中和抗體含量高於 1:80。
3. 大約有 32% 在症狀出現 21 天後，體內中和抗體的量依然很低，有的甚至沒有。
4. 大部分的人在出現症狀七天後，體內才測到較高的 IgG 和 IgM 抗體。
5. 症狀出現九天後，體內 IgG 抗體較為普遍，大多數感染過的人都有 IgG 抗體(94%)，七成的患者有 IgM。
6. FDA 建議用血清來治療的 titre 是 1:160，目前只收症狀持續兩個禮拜的康復患者捐獻的血液用於治療。
7. RBD-binding 的抗體量和保護作用(neutralizing)呈現正相關：體內 anti-RBD 的抗體越多，保護作用越大。
8. 患者體內 IgM 的量也和體內的中和抗體(neutralizing antibodies)的量呈現正相關。
註：中和抗體為可結合病毒，進而抑制其感染細胞的抗體。
摘要：
1. 用 ELISA 實驗的結果，發現用 Spike RBD (receptor-binding domain) 來測試患者體內抗體的 specificity 和 sensitivity 比較高。
2. 幾乎沒有患者在症狀出現後八天內有測到中和抗體(neutralizing antibodies)，然後在第 21 天時有 91% 的患者測得到低量的 neutralizing antibodies，只有 73% 的患者體內有保護作用的中和抗體含量高於 1:80。
3. 大約有 32% 在症狀出現 21 天後，體內中和抗體的量依然很低，有的甚至沒有。
4. 大部分的人在出現症狀七天後，體內才測到較高的 IgG 和 IgM 抗體。
5. 症狀出現九天後，體內 IgG 抗體較為普遍，大多數感染過的人都有 IgG 抗體(94%)，七成的患者有 IgM。
6. FDA 建議用血清來治療的 titre 是 1:160，目前只收症狀持續兩個禮拜的康復患者捐獻的血液用於治療。
7. RBD-binding 的抗體量和保護作用(neutralizing)呈現正相關：體內 anti-RBD 的抗體越多，保護作用越大。
8. 患者體內 IgM 的量也和體內的中和抗體(neutralizing antibodies)的量呈現正相關。
註：中和抗體為可結合病毒，進而抑制其感染細胞的抗體。
新冠病毒的哪個部分最能引起免疫反應呢？
知道這個有什麼用呢？可以用來做疫苗研發，如果我們知道病毒的哪個蛋白或蛋白的哪個片段可以引起有效的免疫反應，那就可以用來作為疫苗，比起打入整顆的病毒，只打入病毒的某個蛋白或某個蛋白片段會相對安全，有人想研發 DNA- 或 RNA-based 疫苗的部分原因也在此，因為它們只會在體內表現病毒的蛋白或蛋白片段，而不是整個病毒。
這個研究主要是用 Spike protein，他們把 Spike protein 依照目前所知的 domains 分成幾個片段試驗。
1. S-ectodomain (S1+S2), aa 16-1213
2. S1, aa 16-685
3. RBD, aa 319-541
4. S2, aa 686-1213
相關文章：近期和新冠病毒抗體相關的研究
他們把這些蛋白片段打入兔子體內，第一次和第一次施打隔了兩個禮拜，然後在打入後第八天取血清分析，看看哪個可以引起強烈的免疫反應。他們用 ELISA 測試血清裡的 IgG 和四種抗原的反應，結果顯示所有的血清都有可和 S-ecto 產生強烈反應的 IgG，而和其他三個抗原的反應則滿 specific，打入 S2 兔子的血清只對 S2 產生反應，對 S1 和 RBD 則沒反應。
因為 ELISA 分析的是 IgG binding，他們另外也用 SPR 分析其他 Ig binding，結果顯示在二次施打後，所有取得的血清裡，anti-Spike 的抗體中有 80% 是 IgG，10-15% 是 IgA，以及少量的 IgM。專一性的話呢， S-ecto 兔子的血清裡，大多數抗體都和 S-ecto 結合，再來是和 S1，最後是 RBD 和 S2，大概是 S-ecto 的三分之一。S1 兔子血清裡和 S-ecto, S1 以及 RBD 結合的抗體都差不多多，沒有和 S2 結合的。RBD 兔子血清裡的抗體一樣是和 S-ecto, S1 以及 RBD 結合的量都差不多，但是量都是 S1 兔子的三倍，而且這些抗體對抗原的 affinity 是其他兔子抗體的五倍。
再來就是看這些抗體的保護力了，他們用 RBD-hACE2 binding competition SPR assay 和 neutralization 測試抗體抑制病毒的功效。因為新冠病毒進入細胞靠的是 RBD 和宿主細胞 hACE2 的結合，competition SPR assay 便是測試抗體阻斷 RBD 和 hACE2 的功效如何，結果顯示 S1 兔子和 RBD 兔子的血清阻斷的效能最好，分別為 84% 和 94%，而 S1+S2 的只有 44%。那這些抗體是否可以阻止細胞被病毒感染呢？實驗結果顯示 RBD 兔子的血清抑制病毒感染的效果最好，再來是 S1 兔子的血清，最後才是 S1+S2 兔子的血清。
結論：用病毒 Spike protein RBD 產生出來的抗體對抗原的 affinity 最高，最能有效阻斷 RBD-hACEII binding，抑制病毒感染細胞的效果也最好。
Publication:
S Ravichandran et al, Antibody signature induced by SARS-CoV-2 spike protein immunogens in rabbits. Science Translational Medicine (2020)
這個研究主要是用 Spike protein，他們把 Spike protein 依照目前所知的 domains 分成幾個片段試驗。
1. S-ectodomain (S1+S2), aa 16-1213
2. S1, aa 16-685
3. RBD, aa 319-541
4. S2, aa 686-1213
相關文章：近期和新冠病毒抗體相關的研究
他們把這些蛋白片段打入兔子體內，第一次和第一次施打隔了兩個禮拜，然後在打入後第八天取血清分析，看看哪個可以引起強烈的免疫反應。他們用 ELISA 測試血清裡的 IgG 和四種抗原的反應，結果顯示所有的血清都有可和 S-ecto 產生強烈反應的 IgG，而和其他三個抗原的反應則滿 specific，打入 S2 兔子的血清只對 S2 產生反應，對 S1 和 RBD 則沒反應。
因為 ELISA 分析的是 IgG binding，他們另外也用 SPR 分析其他 Ig binding，結果顯示在二次施打後，所有取得的血清裡，anti-Spike 的抗體中有 80% 是 IgG，10-15% 是 IgA，以及少量的 IgM。專一性的話呢， S-ecto 兔子的血清裡，大多數抗體都和 S-ecto 結合，再來是和 S1，最後是 RBD 和 S2，大概是 S-ecto 的三分之一。S1 兔子血清裡和 S-ecto, S1 以及 RBD 結合的抗體都差不多多，沒有和 S2 結合的。RBD 兔子血清裡的抗體一樣是和 S-ecto, S1 以及 RBD 結合的量都差不多，但是量都是 S1 兔子的三倍，而且這些抗體對抗原的 affinity 是其他兔子抗體的五倍。
再來就是看這些抗體的保護力了，他們用 RBD-hACE2 binding competition SPR assay 和 neutralization 測試抗體抑制病毒的功效。因為新冠病毒進入細胞靠的是 RBD 和宿主細胞 hACE2 的結合，competition SPR assay 便是測試抗體阻斷 RBD 和 hACE2 的功效如何，結果顯示 S1 兔子和 RBD 兔子的血清阻斷的效能最好，分別為 84% 和 94%，而 S1+S2 的只有 44%。那這些抗體是否可以阻止細胞被病毒感染呢？實驗結果顯示 RBD 兔子的血清抑制病毒感染的效果最好，再來是 S1 兔子的血清，最後才是 S1+S2 兔子的血清。
結論：用病毒 Spike protein RBD 產生出來的抗體對抗原的 affinity 最高，最能有效阻斷 RBD-hACEII binding，抑制病毒感染細胞的效果也最好。
Publication:
S Ravichandran et al, Antibody signature induced by SARS-CoV-2 spike protein immunogens in rabbits. Science Translational Medicine (2020)
2020年3月28日 星期六
武漢肺炎輕症患者體內的免疫反應
在上週發表的 Nature Medicine 裡有一篇是關於輕症患者體內的免疫反應，我相信台灣應該也有康復者的資料，只是不知道有沒有觀察其免疫反應。
這篇是個案，雖說每個人體質不太一樣，但應該也差不了多少，有些復原後的情形也和之前一些康復患者的報告結果一致。
這位個案是從武漢到澳洲墨爾本的 47 歲女士，抵達澳洲的一週後出現 lethargy, sore throat, dry cough, pleuritic chest pain, mild dyspnea, subjective fevers 這些這症狀，出現症狀四天後去墨爾本的急診。他沒去過那個海鮮市場，也沒接觸過已知患者。患者會加入研究是透過 Sentinel Travelers Research Preparedness Platform for Emerging Infectious Diseases novel coronavirus substudy (SETREP-ID-coV)。
患者健康狀況：沒抽煙、沒有服用藥物，身體算健康。
進醫院時的臨床診斷：
- 體溫為 38.5C
- 脈搏每分鐘 120 下
- 血壓 140/80 mm Hg
- 胸部聽診有 bi-basal rhonchi
- 沒有呼吸道併發症
- 沒有急性呼吸道衰竭症狀
- 出現症狀後第四天，RT-qPCR 有測到病毒，直到第六天都測到病毒，但第七天開始顯示為陰性，血液內 C-reactive protein 增加，免疫細胞數量正常。
Figure / 病患復原情況和病毒檢測結果，可以看到雖然咳嗽持續到第 11 天，但第七天開始檢測結果就都是陰性了，病毒量已經降低到測不到。(Thevarajan et al, Nature Medicine 2020)
治療方式：打點滴補充水份，沒給氧氣，沒給抗生素、類固醇或抗病毒藥物。
恢復狀況：症狀開始後第五天的胸部 X 光顯示有 bi-basal infiltrates (肺浸潤)，但是第十天時已經沒有肺浸潤的情況，於是第十一天便讓他回家自主管理，第十三天已完全康復，但還是在家待到第二十天，直到第二十天還是無恙。
體內免疫反應進程：
1. 出現症狀後第 7 到 20 天血液內和新冠病毒(SARS-CoV-2)有反應的 IgG 和 IgM 抗體大量增加。
2. ASCs (antibody-secreting cells)和 CD4+ T cells 於血液中病毒清乾淨後的第七天開始出現。ASCs在第八天達到高峰，CD4+ T cells 則在第八、九天持續增加。這兩個細胞在患者中的高峰期皆比健康個體高很多，而且直到第 20 天康復後都還存在患者體內。CD8+ T cells 也是從第一天開始快速增加直到第九天，但是在第 20 天開始下降。在得流感或施打流感疫苗後，這些免疫細胞也會大量增加。
3. Cytokines & chemokines：H7N9 重症患者體內會大量增加的 IL-6, IL-8, IL-10, MIP-1β 和 IFN-γ 在有症狀的第七到九之間都沒有顯著增加。
在看到輕症患者康復後肺部也會受損的臉書文後，看了這篇後感到心安一些。
原論文：I Thevarajan et al, Breadth of concomitant immune responses prior to patient recovery: a case report of non-severe COVID-19. Nature Medicine (2020)
這篇是個案，雖說每個人體質不太一樣，但應該也差不了多少，有些復原後的情形也和之前一些康復患者的報告結果一致。
這位個案是從武漢到澳洲墨爾本的 47 歲女士，抵達澳洲的一週後出現 lethargy, sore throat, dry cough, pleuritic chest pain, mild dyspnea, subjective fevers 這些這症狀，出現症狀四天後去墨爾本的急診。他沒去過那個海鮮市場，也沒接觸過已知患者。患者會加入研究是透過 Sentinel Travelers Research Preparedness Platform for Emerging Infectious Diseases novel coronavirus substudy (SETREP-ID-coV)。
患者健康狀況：沒抽煙、沒有服用藥物，身體算健康。
進醫院時的臨床診斷：
- 體溫為 38.5C
- 脈搏每分鐘 120 下
- 血壓 140/80 mm Hg
- 胸部聽診有 bi-basal rhonchi
- 沒有呼吸道併發症
- 沒有急性呼吸道衰竭症狀
- 出現症狀後第四天，RT-qPCR 有測到病毒，直到第六天都測到病毒，但第七天開始顯示為陰性，血液內 C-reactive protein 增加，免疫細胞數量正常。
Figure / 病患復原情況和病毒檢測結果，可以看到雖然咳嗽持續到第 11 天，但第七天開始檢測結果就都是陰性了，病毒量已經降低到測不到。(Thevarajan et al, Nature Medicine 2020)
治療方式：打點滴補充水份，沒給氧氣，沒給抗生素、類固醇或抗病毒藥物。
恢復狀況：症狀開始後第五天的胸部 X 光顯示有 bi-basal infiltrates (肺浸潤)，但是第十天時已經沒有肺浸潤的情況，於是第十一天便讓他回家自主管理，第十三天已完全康復，但還是在家待到第二十天，直到第二十天還是無恙。
體內免疫反應進程：
1. 出現症狀後第 7 到 20 天血液內和新冠病毒(SARS-CoV-2)有反應的 IgG 和 IgM 抗體大量增加。
2. ASCs (antibody-secreting cells)和 CD4+ T cells 於血液中病毒清乾淨後的第七天開始出現。ASCs在第八天達到高峰，CD4+ T cells 則在第八、九天持續增加。這兩個細胞在患者中的高峰期皆比健康個體高很多，而且直到第 20 天康復後都還存在患者體內。CD8+ T cells 也是從第一天開始快速增加直到第九天，但是在第 20 天開始下降。在得流感或施打流感疫苗後，這些免疫細胞也會大量增加。
3. Cytokines & chemokines：H7N9 重症患者體內會大量增加的 IL-6, IL-8, IL-10, MIP-1β 和 IFN-γ 在有症狀的第七到九之間都沒有顯著增加。
在看到輕症患者康復後肺部也會受損的臉書文後，看了這篇後感到心安一些。
原論文：I Thevarajan et al, Breadth of concomitant immune responses prior to patient recovery: a case report of non-severe COVID-19. Nature Medicine (2020)
新冠病毒(SARS-CoV-2)檢測 -- qPCR 和抗體檢測（續）
有看中研院那篇的就知道，目前檢測新冠病毒的方法有三：
1. qPCR：檢測體內是否有病毒 RNA，知道 primers 就可以用來檢測，不需要另外研發，相對準確，敏感度高(sensitivity)，但需四到六小時，包含運送檢體時間等等的 turnaround time 至少要一天。不過目前 UCSF, Mammoth 和加州 Public Health 部門合作研發的 SARS-CoV-2 DETECTR 利用 CRISPR 技術似乎可以快速檢測，加上 RNA extraction 的時間只要 45 分鐘。
2. 用抗體檢測體內抗原(也就是病毒)：跟 qPCR 比起來準確度較低(需要注意有沒有 cross-reactivity)，也需要時間研發，但是檢驗方法簡單，速度也快，turnaround time 約二十分鐘到一小時。（下圖的第三種 sandwich assay）
3. 用抗原(也就是病毒蛋白)檢測體內是否有抗體：研發時間沒上面那個長，比較簡單，檢驗方法也同樣簡單和快速，但需要等到症狀出現後，病患體內產生抗體才測得到，通常是用來追蹤是否曾經感染過。（下圖的第一種 direct assay 或第二種 indirect assay）
相關文章：新冠病毒(SARS-CoV-2)的檢測 -- qPCR 和抗體
Figure / Diagram of common ELISA formats (direct vs. sandwich assays)(Thermo Fisher)
註：抗體檢測的原理跟 ELISA 相同，可以固定抗原(antigen)去測體內抗體(antibody)，如上圖的第一種和第二種，這種只要有抗原就可以測，或是固定抗體去測體內是否有抗原，如上圖中的第三種，這種比較需要花時間先去研發出好的抗體。
相關文章：簡單檢測新冠病毒抗體
Nature 的這篇介紹了幾個正在研發的抗體檢測，第一個介紹的就是中研院楊老師的那個 LFIA！和大多數用 S (spike) protein 做抗原的抗體檢測不同的是中研院用的是 N (nucleocapsid) protein，其中一株抗體和 SARS 還有其他種冠狀病毒的 spike protein 沒有 cross-reactivity。不過看了這篇才知道，中研院的抗體是用 AI 去模擬 Ag-Ab interactions 後製造出來人造抗體 libraries，然後再用 phage display 去抓出抗體，而不是用動物去製造抗體，或是從康復患者體內釣出來，因此省掉了兩個月的時間。（也就是說中研院有抗體的基因序列，可以大量生產，也許可以測試是否能用於治療，不過我覺得 anti-spike 的抗體應該會比較有效果。）
相關文章：Phage display 和小抗體製造
Figure / Schematic representation of a LFIA device (Banerjee et al, Analyst 2018; doi: 10.1039/C8AN00307F)
抗體檢測大多用 LFIA (lateral flow immunoassay) 式的快篩，原理跟 ELISA 相同，只是長得像驗孕棒 XD。如上圖的 LFIA 所示，用的是 sandwich assay，也就是把抗體固定在檢測棒上面，然後先讓(可能含有病毒)的血液和帶有染劑的抗體混合，然後讓混合後的血液和抗體流過檢測棒，如果有血液含有抗原(也就是抗原)的話，就會被固定在檢測棒的抗體抓住。另一條 control line 是抓多餘的帶有染劑的抗體，也就是確認有足夠的抗體，並且有作用。因此如果血液中有病毒的話，就會有兩條線，沒有的話就會只出現 control line 那條線。
第二個介紹的是加拿大的公司 Sona Nanotech (Halifax-based)，他們是和 GE 合作研發的 LFIA，抗原用的是 spike protein 的 S1 domain，目前預估是六到八週內可以有供研究使用的產量。
如最之前說的，檢測體內是否有對抗病毒的抗體相對簡單，只要純化出抗原就可以下去測了，德國柏林的 Pharmact 已經有二十分鐘的抗體快篩檢測，用的抗原是 N protein 和 spike protein 的 S1 和 S2 domain，可以用來檢測患者體內是否有這兩個病毒蛋白的抗體，這個快篩可以檢測到 IgM 和 IgG，IgM 是人體受感染後最先產生的抗體，之後再產生 IgG。他們和 qPCR 結果做比較，結果顯示準確度很高 -- 100% true negative 和 0% false positive，不過缺點是敏感度低，因為一開始的 IgM 反應並不高，感染後的 4 - 10 天內測到的敏感度只有 70%，但是第 11 天到第 24 天可以測到 92.5%，IgG 在這幾天測到的比例也高達 98.6%，因此整體 false negative 比例約為 13%。
關於患者體內的免疫反應可參考：武漢肺炎輕症患者體內的免疫反應
其他相關文章：關於武漢病毒(SARS-CoV-2) Cryo-EM 那篇論文的閒聊
Article:
Nature / Fast, portable tests come online to curb coronavirus pandemic (March 2020)
Papers:
JP Broughton et al, Rapid Detection of 2019 Novel Coronavirus SARS-CoV-2 Using a CRISPR-based DETECTR Lateral Flow Assay. MedRxiv (2020)
R Banerjee & A Jaiswal, Recent advances in nanoparticle-based lateral flow immunoassay as a point-of-care diagnostic tool for infectious agents and diseases. Analyst (2018)
2019年2月16日 星期六
你對牛奶過敏嗎？也許可以來個腸道菌移植治療
你是屬於會對牛奶過敏的人嗎？最近有研究顯示，腸道菌移植可能可以使你不再對牛奶過敏。
之前有研究顯示，對牛奶過敏(cow's milk allergic, CMA)的小孩的腸道菌落和不會對牛奶過敏的有些不同，也顯示某些腸道菌似乎可以降低對食物過敏的風險，於是科學家們想試試不會過敏的小孩的腸道菌是否可以使身體不再對牛奶裡的乳球蛋白 β-lactoglobulin (BLG) 產生免疫反應。
他們把八位幼童的腸道菌移植到在無菌空間生長的老鼠體內，移植的方法是把處理過的糞便經由食道直接灌到老鼠胃部 --intragastric gavage。這些無菌老鼠(germ-free mice, GF mice)是敏感體質，會對 BLG 和 cholera toxin 產生過敏反應，除了體溫會下降外，身體也會製造 BLG 的抗體 IgE 和 IgG1。八位幼兒中有四位是健康沒過敏的和四位 CMA 過敏兒，CMA 幼兒有吃 hydorlyzed casein 治療過敏情況，健康幼兒則吃標準牛奶基底的配方奶。
無菌老鼠分為三 組，一組是完全沒接受腸道菌移植的 GF mice，一組是接受健康幼兒糞便移植的，和一組接受 CMA 過敏兒移植的。腸道菌移植 42 天之後，他們給老鼠 BLG，然後觀察是否出現過敏反應。結果顯示未接受腸胃道菌移植的和接受 CMA 腸道菌的出現了過敏反應，包括體溫下降和血液裡有大量的 BLG-specific IgE 和 IgG，而接受健康幼兒腸道菌的老鼠則沒有出現這些反應，他們也試了喝母奶的健康兒和 CMA 過敏兒的腸道菌，移植健康幼兒腸道菌的老鼠同樣沒出現 BLG 的過敏反應，但是移植 CMA 腸道菌的老鼠有過敏反應，表示牛奶或是母奶並不是造成過敏的原因。
所以，到底健康幼兒和過敏兒的腸道菌落有什麼不同呢？科學家們分析了這些幼兒的便便，看看到底哪裡不同，結果發現兩者之間有 58 種菌的菌量不同。另外，他們除了分析有哪些菌在健康兒體中比較多，哪些在 CMA 體中比較多外，同時也分析了老鼠的糞便，然後和幼兒的做比對。結果顯示接受健康幼兒腸胃道移植的老鼠，糞便裡富含 Clostridia 家族下面的一種菌 Lachnospiraceae，這種菌之前被認為可以保護宿主身體不對食物過敏。
接著，他們採集了老鼠腸胃道的表皮細胞(ileal epithelium)做分析，發現接受健康幼兒腸道菌的老鼠會表現不一樣的基因，有幾個基因的表現比接受 CMA 的老鼠高，顯示腸道菌會影響宿主的基因表現和免疫系統。他們再用基因表現量的差異做區分去比較這些老鼠的腸道菌，結果顯示接受健康兒腸道菌移植的老鼠體內富含的幾種菌落皆屬於 Lachnospiraceae，並且是以 Anaerostipes caccae 為主。
之後，他們想確認 A. caccae 是否為影響基因表現和避免過敏的主要因素，於是把這株細菌移植到無菌老鼠裡，結果出現了相同的變化，例如表現量上升的基因和接受健康幼兒的腸道菌移植的老鼠的是一樣的，而且這些老鼠對 BLG 也沒產生過敏反應，顯示 A. caccae 在保護幼兒不對牛奶過敏上佔有很大因素。
Article:
Mindzilla / Gut Microbes from Healthy Infants Block Milk Allergy Development in Mice (Jan 2019)
Paper:
T Feehley et al, Healthy infants harbor intestinal bacteria that protect against food allergy. Nature Medicine (2019)
之前有研究顯示，對牛奶過敏(cow's milk allergic, CMA)的小孩的腸道菌落和不會對牛奶過敏的有些不同，也顯示某些腸道菌似乎可以降低對食物過敏的風險，於是科學家們想試試不會過敏的小孩的腸道菌是否可以使身體不再對牛奶裡的乳球蛋白 β-lactoglobulin (BLG) 產生免疫反應。
他們把八位幼童的腸道菌移植到在無菌空間生長的老鼠體內，移植的方法是把處理過的糞便經由食道直接灌到老鼠胃部 --intragastric gavage。這些無菌老鼠(germ-free mice, GF mice)是敏感體質，會對 BLG 和 cholera toxin 產生過敏反應，除了體溫會下降外，身體也會製造 BLG 的抗體 IgE 和 IgG1。八位幼兒中有四位是健康沒過敏的和四位 CMA 過敏兒，CMA 幼兒有吃 hydorlyzed casein 治療過敏情況，健康幼兒則吃標準牛奶基底的配方奶。
無菌老鼠分為三 組，一組是完全沒接受腸道菌移植的 GF mice，一組是接受健康幼兒糞便移植的，和一組接受 CMA 過敏兒移植的。腸道菌移植 42 天之後，他們給老鼠 BLG，然後觀察是否出現過敏反應。結果顯示未接受腸胃道菌移植的和接受 CMA 腸道菌的出現了過敏反應，包括體溫下降和血液裡有大量的 BLG-specific IgE 和 IgG，而接受健康幼兒腸道菌的老鼠則沒有出現這些反應，他們也試了喝母奶的健康兒和 CMA 過敏兒的腸道菌，移植健康幼兒腸道菌的老鼠同樣沒出現 BLG 的過敏反應，但是移植 CMA 腸道菌的老鼠有過敏反應，表示牛奶或是母奶並不是造成過敏的原因。
所以，到底健康幼兒和過敏兒的腸道菌落有什麼不同呢？科學家們分析了這些幼兒的便便，看看到底哪裡不同，結果發現兩者之間有 58 種菌的菌量不同。另外，他們除了分析有哪些菌在健康兒體中比較多，哪些在 CMA 體中比較多外，同時也分析了老鼠的糞便，然後和幼兒的做比對。結果顯示接受健康幼兒腸胃道移植的老鼠，糞便裡富含 Clostridia 家族下面的一種菌 Lachnospiraceae，這種菌之前被認為可以保護宿主身體不對食物過敏。
接著，他們採集了老鼠腸胃道的表皮細胞(ileal epithelium)做分析，發現接受健康幼兒腸道菌的老鼠會表現不一樣的基因，有幾個基因的表現比接受 CMA 的老鼠高，顯示腸道菌會影響宿主的基因表現和免疫系統。他們再用基因表現量的差異做區分去比較這些老鼠的腸道菌，結果顯示接受健康兒腸道菌移植的老鼠體內富含的幾種菌落皆屬於 Lachnospiraceae，並且是以 Anaerostipes caccae 為主。
之後，他們想確認 A. caccae 是否為影響基因表現和避免過敏的主要因素，於是把這株細菌移植到無菌老鼠裡，結果出現了相同的變化，例如表現量上升的基因和接受健康幼兒的腸道菌移植的老鼠的是一樣的，而且這些老鼠對 BLG 也沒產生過敏反應，顯示 A. caccae 在保護幼兒不對牛奶過敏上佔有很大因素。
Article:
Mindzilla / Gut Microbes from Healthy Infants Block Milk Allergy Development in Mice (Jan 2019)
Paper:
T Feehley et al, Healthy infants harbor intestinal bacteria that protect against food allergy. Nature Medicine (2019)
2018年2月4日 星期日
關於抗體和抗體藥的一些小知識
近幾年來抗體藥變得頗為流行，不少藥廠研發抗體藥，其中包括治療阿茲罕默症的 aducanumab 和 solanezumab。藥名後面為 -mab 的代表是抗體藥，-mab 即為 mAb (monoclonal antibody)。
Figure / Wiki - Drug nomenclature（點圖可以放大）
學名藥命名方式可參考這：Generic Name Stems
大家都知道抗體 IgG 長什麼樣子吧？就是兩個 heavy chains 和兩個 light chains，辨認抗原(antigen)的那端是 Fv (variable regions)，另一端則是會被醣化(glycosylation)和引發免疫反應的 Fc (constant regions)。但是，你知道嗎？駱駝(camelid, llama)的體內有兩種抗體哦哦哦！一種是跟人類一樣的 IgG，另一種是只有 heavy chains 的抗體(HCAbs)，這種特別的抗體的 Fv 叫做 VHH (下圖)，又稱 nanobodies (Nbs)，雖然只有 heavy chain，但是對抗原的 binding affinity 並沒有比較弱，加上體積小，可以用來做抗體藥。
Figure / P. Holier & P. J. Hudson, Nature Biotechnology 2005 (doi: 10.1038/nbt1142)
簡單來說抗體藥有幾種，一種是整個 IgG，一種是只有 Fab，或甚至是只有 Fv，近來更小的 single-chain Fv (scFv) 和 VHH (Nbs) 也引起關注，這兩種小抗體有個好處，就是比完整的 IgG 更容易穿透細胞，也容易被清洗掉(這點有好也有壞，要看用在哪)，而且因為小又沒有 Fc，所以打入體內做為治療時不會引起不必要的免疫反應。
目前做抗體藥的方法有分三種，一種是大家比較知道的 in vivo，先打到動物裡，再取出 B cells 和 myeloma 合成 hybridomas 生產 monoclonal antibody。另一種是在 E. coli 裡面製造，這種大家應該也知道，在細菌裡面製造的優勢就是量大且便宜。最後一種是在酵母菌裡面製造，在酵母菌製造的優勢也是量大且便宜，但比細菌好的是它是 eukaryotic。
因為正常情況下，Fc 的部分會醣化，所以如果要做整個 IgG 的話，最好是在 mammalian cells 裡面製造，就是用 hybridomas，因為細菌並沒有 glycosylation，所以如果用細菌的話，還要再另外 in vitro glycosylation，這麼麻煩的話為什麼還要用細菌呢？如果你是要製造 Fab 或是 scFv 的話，因為不需要 glycosylation，這時候用細菌就可以省時省錢。
酵母菌的話，則是可以用來製造 IgG 或是 Fab, scFv。但是酵母菌的 glycosylation 和人類的不一樣，酵母菌的只有 mannose，生產出來的會附帶大量的 mannose，但是人類的是比較複雜的，通常不只有 mannose，還有 galactose 和 sialic acids 等等，所以需要改造酵母的基因，讓它能夠生產 galactose 和 sialic acid。所以同樣的，如果只是製造 Fab 或是 scFv 的話，用酵母菌會比用動物便宜。如果要製造整個 IgG 的話，雖然比較複雜一點，但是如果基因調控好了，除了可以大量生產外，還可以控制抗體的品質，省錢省時間。另外就是利用酵母菌的話，生產的蛋白質可以讓它釋放出來到培養液中，這樣純化起來會比較容易。
Figure / Jens Nielsen, Bioengineered 2013 (doi: 10.4161/bioe.22856)
當然用 E. coli 或酵母菌的話，不只能製造抗體藥，其他的蛋白質藥物也可以，例如目前市面上已有用酵母菌生產的胰島素(by Novo Nordisk)。
有興趣的可以看下面幾篇 papers。
[05.12.2018 update]
這次 Science 發了這篇文章介紹我之前講的駱駝和鯊魚的小抗體。駱駝和鯊魚除了有正常的 IgG 抗體外，還有一種小抗體，是只有 heavy chain 的抗體。這種小抗體有跟正常抗體一樣的功能，同樣能抓住抗原(antigen)，是免疫系統的一部份，在外來物體入侵時，體內會產生免疫反應製造出這些小抗體。小抗體的 variable region，也就是 VHH，又稱 nanobodies，近年被廣泛研究，看是否能用在治療疾病上面。Nanobody 的其中一種用法就是在它的一端接上讓蛋白降解訊息片段(signal sequence)，例如 degron，這樣當 nanobody 抓到致病蛋白後，接著就會被帶去 proteasome 或是 lysosome 進行降解。
相關舊文：降解蛋白質的密碼(degron)
小抗體的發現是個意外，VUB 的學生想要分析血液和疾病的關聯的時候，因為不想殺老鼠取血，便想到了冷凍庫有駱駝寫的庫存，拿來用後卻發現駱駝血裡面除了有正常的 IgG，還有一種小型的抗體，研究後發現是沒有 light chain 的抗體。之後英國的博士生想要研究駱駝的小抗體，便請 VUB 的研究人員寄血液檢體砍他，沒想到在運送過程中血液莫名弄丟了。不過呢，之後他發現鯊魚血液裡也有這種只有 heavy chain 的小抗體。（這真是太神奇了，為什麼研究會從駱駝跳到鯊魚呢？）
Nanobody 也讓 Kobeilka 得到 2012 年的諾貝爾化學獎，Kobeilka 研究的是 β2-adrenergic receptor，他利用 nanobodies 把 receptor 鎖在 active state 以研究其 crystal structure，他把結果發表在 2011 年的 Nature，之後便在 2012 年因這項研究得到諾貝爾獎。
References:
Science / Mini-antibodies discovered in sharks and camels could lead to drugs for cancer and other diseases (May 2018)
S. Steeland et al, Nanobodies as therapeutics: big opportunities for small antibodies. Drug Discovery Today (2016)
P. Holliger & P.J. Hudson, Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology (2005)
Rasmussen et al, Structure of a nanobody-stabilized active state of the β2 adrenoceptor. Nature (2011)
Figure / Wiki - Drug nomenclature（點圖可以放大）
學名藥命名方式可參考這：Generic Name Stems
大家都知道抗體 IgG 長什麼樣子吧？就是兩個 heavy chains 和兩個 light chains，辨認抗原(antigen)的那端是 Fv (variable regions)，另一端則是會被醣化(glycosylation)和引發免疫反應的 Fc (constant regions)。但是，你知道嗎？駱駝(camelid, llama)的體內有兩種抗體哦哦哦！一種是跟人類一樣的 IgG，另一種是只有 heavy chains 的抗體(HCAbs)，這種特別的抗體的 Fv 叫做 VHH (下圖)，又稱 nanobodies (Nbs)，雖然只有 heavy chain，但是對抗原的 binding affinity 並沒有比較弱，加上體積小，可以用來做抗體藥。
Figure / P. Holier & P. J. Hudson, Nature Biotechnology 2005 (doi: 10.1038/nbt1142)
簡單來說抗體藥有幾種，一種是整個 IgG，一種是只有 Fab，或甚至是只有 Fv，近來更小的 single-chain Fv (scFv) 和 VHH (Nbs) 也引起關注，這兩種小抗體有個好處，就是比完整的 IgG 更容易穿透細胞，也容易被清洗掉(這點有好也有壞，要看用在哪)，而且因為小又沒有 Fc，所以打入體內做為治療時不會引起不必要的免疫反應。
目前做抗體藥的方法有分三種，一種是大家比較知道的 in vivo，先打到動物裡，再取出 B cells 和 myeloma 合成 hybridomas 生產 monoclonal antibody。另一種是在 E. coli 裡面製造，這種大家應該也知道，在細菌裡面製造的優勢就是量大且便宜。最後一種是在酵母菌裡面製造，在酵母菌製造的優勢也是量大且便宜，但比細菌好的是它是 eukaryotic。
因為正常情況下，Fc 的部分會醣化，所以如果要做整個 IgG 的話，最好是在 mammalian cells 裡面製造，就是用 hybridomas，因為細菌並沒有 glycosylation，所以如果用細菌的話，還要再另外 in vitro glycosylation，這麼麻煩的話為什麼還要用細菌呢？如果你是要製造 Fab 或是 scFv 的話，因為不需要 glycosylation，這時候用細菌就可以省時省錢。
酵母菌的話，則是可以用來製造 IgG 或是 Fab, scFv。但是酵母菌的 glycosylation 和人類的不一樣，酵母菌的只有 mannose，生產出來的會附帶大量的 mannose，但是人類的是比較複雜的，通常不只有 mannose，還有 galactose 和 sialic acids 等等，所以需要改造酵母的基因，讓它能夠生產 galactose 和 sialic acid。所以同樣的，如果只是製造 Fab 或是 scFv 的話，用酵母菌會比用動物便宜。如果要製造整個 IgG 的話，雖然比較複雜一點，但是如果基因調控好了，除了可以大量生產外，還可以控制抗體的品質，省錢省時間。另外就是利用酵母菌的話，生產的蛋白質可以讓它釋放出來到培養液中，這樣純化起來會比較容易。
Figure / Jens Nielsen, Bioengineered 2013 (doi: 10.4161/bioe.22856)
當然用 E. coli 或酵母菌的話，不只能製造抗體藥，其他的蛋白質藥物也可以，例如目前市面上已有用酵母菌生產的胰島素(by Novo Nordisk)。
有興趣的可以看下面幾篇 papers。
[05.12.2018 update]
這次 Science 發了這篇文章介紹我之前講的駱駝和鯊魚的小抗體。駱駝和鯊魚除了有正常的 IgG 抗體外，還有一種小抗體，是只有 heavy chain 的抗體。這種小抗體有跟正常抗體一樣的功能，同樣能抓住抗原(antigen)，是免疫系統的一部份，在外來物體入侵時，體內會產生免疫反應製造出這些小抗體。小抗體的 variable region，也就是 VHH，又稱 nanobodies，近年被廣泛研究，看是否能用在治療疾病上面。Nanobody 的其中一種用法就是在它的一端接上讓蛋白降解訊息片段(signal sequence)，例如 degron，這樣當 nanobody 抓到致病蛋白後，接著就會被帶去 proteasome 或是 lysosome 進行降解。
相關舊文：降解蛋白質的密碼(degron)
小抗體的發現是個意外，VUB 的學生想要分析血液和疾病的關聯的時候，因為不想殺老鼠取血，便想到了冷凍庫有駱駝寫的庫存，拿來用後卻發現駱駝血裡面除了有正常的 IgG，還有一種小型的抗體，研究後發現是沒有 light chain 的抗體。之後英國的博士生想要研究駱駝的小抗體，便請 VUB 的研究人員寄血液檢體砍他，沒想到在運送過程中血液莫名弄丟了。不過呢，之後他發現鯊魚血液裡也有這種只有 heavy chain 的小抗體。（這真是太神奇了，為什麼研究會從駱駝跳到鯊魚呢？）
Nanobody 也讓 Kobeilka 得到 2012 年的諾貝爾化學獎，Kobeilka 研究的是 β2-adrenergic receptor，他利用 nanobodies 把 receptor 鎖在 active state 以研究其 crystal structure，他把結果發表在 2011 年的 Nature，之後便在 2012 年因這項研究得到諾貝爾獎。
References:
Science / Mini-antibodies discovered in sharks and camels could lead to drugs for cancer and other diseases (May 2018)
S. Steeland et al, Nanobodies as therapeutics: big opportunities for small antibodies. Drug Discovery Today (2016)
P. Holliger & P.J. Hudson, Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology (2005)
Rasmussen et al, Structure of a nanobody-stabilized active state of the β2 adrenoceptor. Nature (2011)
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