Phage display 和小抗體製造

之前聊過抗體的一些知識，這篇來介紹如何用 phage display (噬菌體展示)來製造抗體，這邊說的抗體是奈米抗體 VHH，也就是 nanobodies (Nbs)。如果還記得之前說過的，駱駝除了正常的 IgG 抗體外，還有一種只有 heavy chain 的小抗體(HCAbs)，而 VHH 就是它的 variable region，很小，只有 14kDa 左右。和用老鼠產生抗體的方式類似，只是這是把抗原打到羊駝(llama, alpaca, 屬於駱駝科 Familiy: Camelidae)體內。

奈米抗體(nanobodies)的開發流程

整個用 phage display 研發小抗體的步驟大概是：

1. Purify antigen (純化抗原)
2. Immunization (把抗原打到動物體內讓他們產生抗體)
3. Library building (製造抗體 library)：整個過程包括抽取動物的免疫細胞(lymphocytes)，從免疫細胞裡抽取 RNA，把 RNA 轉成 cDNA，PCR amplification，clone 到 phagemid 裡面後再 transform 到細菌裡做成細菌的 library。之後用 phage 去感染細菌，轉成 phage library。
4. Biopanning & phage amplification: 從含有各種抗體基因的 phage library 裡面把不跟抗原反應的抗體洗掉，抓出和抗原抓出相對應的抗體。
5. Phage ELISA: 利用 ELISA 釣出 positive clones，這個步驟是要從 biopanning 出來的一堆 phage 裡一個個挑出真的會和抗原反應的抗體。
6. Sequencing of positive clones：定序從 phage library 釣出來的抗體，知道序列後就可以大量生產。
7. Cloning into expression vector & purification: 把抗體的基因轉到 expression expression vector 後就可以大量表現和純化抗體。

打入抗原、讓牠產生抗體後，就可以採集牠的 lymphocytes，從中抽取 mRNA，再轉成 cDNA。之後用可以 amplify VHH 的 primers 和 PCR 去 amplify，再把這些 amplified 出來 VHH fragments subclone 到 phagemid。這些 amplified 出來的 VHH fragments 就是抗體的 DNA library。


Figure / Phagemid pMECS. VHH gene is fused to gIII gene of bacteriophage. (Vincke et al 2002)

噬菌體的構造

Phagemid 本身有包含 bacteriophage (噬菌體)的一些東西(e.g., f1 origin)，所以除了會複製外，在 helper phage M13 的加入下 [註1]，會在細菌裡 package 成一個個的 phage particles。把 VHH 的 DNA library subclone 進 phagemid 裡面是為了讓它和 phage 的 gene III 連結在一起 [註2]，gene III 的蛋白質 product 是噬菌體的外層蛋白 g3p (g3 protein)，也就是 coat protein [註3]。把 VHH 的 DNA library 和 gene III 連結在一起的話，那當 phagemid 在複製和 package 成 phage 的時候，就會和 g3p 一起表現在 phage 的表面（下圖 P3 的地方），這就是 phage display (噬菌體展示)，把抗體展示在噬菌體表面。


Figure / Microbiology: Chapter 11 - Molecular Biology of Viruses (W. W. Norton)

註1：f1 和 M13 phage 都屬於 inovirus (ssDNA virus)，M13 有十個 genes，gene I 到 gene X，它們的 protein products 即是 g1p 到 g10p。Phage display 裡常用的 helper phage 是 M13KO7，可以幫助噬菌體把 phagemid 包進 phage particle 裡面。

"M13KO7 is able to replicate in the absence of phagemid DNA. In the presence of a phagemid bearing a wild-type M13 or f1 origin, single-stranded phagemid is packaged preferentially and secreted into the culture medium.This allows easy production of single-stranded phagemid DNA for mutagenesis or sequencing." （摘自 NEB 的產品網頁）

註2：下面提供的 protocol 裡用的 phagemid 是 pMECS，它帶有 f1 origin 和 gene III。
註3：如果對病毒還算熟悉的話，就是類似病毒的 capsid proteins 或是 envelope proteins。M13 的 g3p 是在的尾端，Expasy 的 ViralZone 有不錯的介紹：Inovirus - M13 phage。

要讓噬菌體把 VHH 表現在它的表面，需要把 phagemid 轉入細菌中，這樣它才有辦法在細菌裡面 package 成一個個的 phage，並且在細菌中大量繁殖，而這些會表現 VHH 的 phage 就是 phage library。

怎麼釣出你要的奈米抗體？

因為一隻羊駝裡可以打入好幾種抗原，所以產生的抗體是對抗不同抗原的混合，因此上面做出來的 phage library 其實是各種抗體的混合。例如你在一隻駱駝裡打入 A, B, C 三個抗原，牠體內就會產生 anti-A, anti-B 和 anti-C 的奈米抗體，你的 phage library 也就會是這三種抗體的混合，如果你要從中挑出 anti-A 的 nanobodies，這時候就要做 biopanning 。

那要怎麼挑出來呢？

就是用 A 抗原去挑，把 A 固定在盤子上後，加入 phage library，這時候表現有 anti-A nanobodies 的 phage 就會 bind A，然後把其他不會 bind A 抗原的 phage 都洗掉，再把會 bind A 抗原的 phage 洗出來(elution)，就是你的 anti-A phage library 惹。Anti-B 和 anti-C 的 phage 也可以用同樣方法挑出來，這個步驟就是 biopanning。


Figure / Scheme of phage display (T Schirrmann et al, Molecules 2011; doi: 10.3390/molecules16010412)

上圖中可以看到每個 phage 的尾巴都表現不同的抗體，這些抗體會和它可以辨識的抗原結合，然後其他的抗原的抗體或是 non-specific binding 會被洗掉，而可以和抗原結合的抗體則會被挑出來，在 helper phage 的幫助之下再度感染細菌，使這些帶有能夠辨識抗原的抗體的噬菌體 amplify。經過 amplification 的噬菌體再進入下一輪的 biopanning，把 binding 比較弱的和其他的 non-specific binding 再洗掉，這樣重複個兩三輪。

之後這些各別的 anti-A, anti-B 和 anti-C phage library 可以用 ELISA 的方法(i.e., phage ELISA)挑出 individual phage clones，例如找出 affinity 最高、最 specific，或是最 stable 的 nanobodies。挑出來的 phage clones 可以萃取出它們的 phagemid，定序之後就可以知道這些 nanobodies 的 DNA sequences。



詳細的 protocol 可以參考這篇：

C Vincke et al, Generation of Single Domain Antibody Fragments Derived from Camelids and Generation of Manifold Constructs. Antibody Engineering (2012)


延伸閱讀： 關於抗體和抗體藥的一些小知識