抗新冠病毒的 T cells 和抗感冒冠狀病毒的有 cross-reactivity

另外兩篇關於 T cells 對新冠病毒反應的研究，一篇是分析健康個體和新冠患者的 T cells，一篇是分析未感染者體內對新冠病毒有反應的 T cells，看看他們和普通感冒的冠狀病毒是否有 cross-reactivity。

刊在 Science 的那篇之前已經有一篇發表在 Cell，同樣是分析健康個體和 COVID-19 康復患者的血清，然後發現所有康復患者都有可辨識新冠病毒 Spike protein 的 CD4+ (helper) T cells，T cells 的反應程度和 IgG 量成正向相關，然後七成的康復患者有可對抗新冠病毒的 CD8+ (killer) T cells，而且反應強烈。康復患者除了帶有可辨識 Spike protein 的免疫細胞外，他們也帶有可辨識其他病毒蛋白的 T cells，像是 M protein 和 N protein。

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在之前的研究裡，他們同樣也分析了疫情前採集到的血清，同樣帶有可辨識新冠病毒的 T cells。

「他們檢測了於 2015-2018 年採樣到、沒有感染過新冠病毒的血液檢體，結果發現其中有 40% - 60% 含有可以辨識新冠病毒的 helper T cells，不過和康復患者不同的是他們的 T cells 反應雖然也是以 Spike 為主，但幾乎沒有對 N protein 或 M protein 有反應的 T cells，次主要的是 NSPs (non-structural proteins)。而之所以會有這些 T cells，可能是因為這些人之前感染過其他種類的冠狀病毒，cross-reactivity 使他們體內也有能辨識新冠病毒的 T cells。研究者們認為這是之前感染其他四種引起感冒症狀的冠狀病毒時產生的，因為這些血液檢體裡都有針對至少其中三種常見冠狀病毒的 T cells，血清檢測也顯示全部都有 HCoV-OC43 和 HCoV-NL43 Spike protein 的 IgG 抗體，表示大多數人都感染過常見的四種感冒冠狀病毒，而且至少感染過超過三種，而這也可能是為什麼大部分的人感染到新冠病毒後都只是輕症或無症狀。」

註：常見的四種感冒冠狀病毒為 NL63, 229E, OC43 和 HKU1。

這和後來瑞典，以及 Duke-NUS 的研究結果相似，未感染者的體內有可辨識 Spike 和 NSPs 的 T cells，但是極少有可辨識 N protein 的。那這些對新冠病毒有反應的 T cells 是哪裡來的呢？是因為感染過感冒冠狀病毒而得來的嗎？如果是的話，表示抗普通冠狀病毒的 T cells 和抗新冠病毒的 T cells 是有 cross-reactivity 的。他們後來發表在 Science 的這篇研究，就是分析未感染者體內的 T cells 可辨識的新冠病毒蛋白有哪些，另一篇德國研究團隊發表在 Nuture 也做了類似的分析。（德國的這篇之前已先發表在 medRxiv）

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他們用 2018 年採樣到的血清去掃新冠病毒的蛋白片段，看對哪些片段有反應，大部分對病毒蛋白有反應的為 CD4+ T cells，少數為 CD8 T cells，和之前的研究結果一致。用來測試 T cells 反應的病毒片段分為兩組，一組是 Spike 的片段，一組是非 Spike 的片段，能被 T cells 辨識的片段大約是個一半。T cells 有反應的 Spike 那一半只有 11% 的目標是 RBD，而非 Spike 的那一半則大多是 NSPs，並且沒有對 M proteins 有反應的。相較之下，COVID-19 患者的 CD4+ T cells 則是對 M proteins 有強烈反應。

ok, 那這些疫情開始前一年的血清到底是為什麼有抗新冠病毒蛋白的 T cells？到底是不是因為和其他普通的感冒冠狀病毒有 cross-reactivity？他們發現這些血清裡的 T cells 都對常見的感冒冠狀病毒有反應，包括了 NL63, OC42 和 HKU1。另外，有 57% 的 cross-reactivity 在於那些蛋白片段有 >67% 的相似度。

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下面這個 podcast 是對這篇研究的討論：Immune 34 - Coronavirus cross-reacting T cells



如果對免疫細胞實驗不了解的，podcast 裡解釋滿清楚的，下面幾點是我筆記到的：

1. 未見識過新冠病毒的 naive T cells 被新冠病毒的蛋白片段刺激後(1st boost)，會轉變成 memory T cells，memory T cells 如果再度接受刺激(2nd boost)，則會快速繁殖(proliferation)，因此如果未感染者血清內的免疫細胞接受新冠病毒的蛋白片段刺激後便快速繁殖，表示他們體內已有可辨識新冠病毒的 T cells。

2. MHCI 和 MHCII 辨識的 peptide 長度不一樣，MHCI 主要表現在 CD8+ T cells，能夠抓到 peptide 長度是 8-10 個氨基酸；MHCII 表現在 CD4+ T cells，辨識的則是 13-18 個氨基酸長，因為他們用的 peptide 長度是 14-15 個氨基酸長，所以抓到的主要是 CD4+ T cells，這並不表示未感染者體內沒有 anti-Spike CD8+ T cells，而是這個實驗設計本身就是以釣出 CD4+ T cells 為主。

3. 因為人體內的 CD4+ T cells 有兩種：未見識過新冠病毒的 naive T cells 和見識過新冠病毒的 memory T cells，如果這些 2018 年採集的、未感染過新冠病毒的血清內有可辨識新冠病毒的 T cells 是因為和其他冠狀病毒的 cross-reactivity 而產生的，則需要確定它們是 memory T cells，怎麼確定？Naive T cells 和 memory T cells 表面的 markers 不一樣，所以可以用來辨識是哪種。

德國的那個則是比較了 COVID-19 患者的血清和健康個體的 T cells 對新冠病毒的反應，83% 的患者對 Spike 有反應，35% 的健康個體對 Spike 有反應（健康個體的 PCR 和血清檢驗為陰性）。雖然 COVID-19 患者和健康個體的 T cells 都可以辨識 Spike，但是有些差別。COVID-19 的 T cells 對 Spike S1 和 S2 domain 的反應程度差不多，但健康患者對 C-terminal 的 S2 反應比較強烈，而這個部分和其他常見的感冒冠狀病毒相似度很高，於是他們測了健康個體血清裡的抗體，發現所有健康個體都帶有常見的冠狀病毒，而且是四個全帶。這也可能是為什麼小朋友不易感染新冠病毒，因為學校不時有感冒冠狀病毒傳來傳去，大部分的小朋友應該都有抗冠狀病毒的免疫細胞惹。XD

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「當時參與研究的志願者中，只有 11% 體內沒有抗體，顯示在當時的年代(1961-1977)，這株冠狀病毒非常普及。當一年後再讓這些志願者感染這株病毒，看看抗體是否還有保護作用，發現抗體對同株的病毒有保護作用，但對相近病毒(也就是同樣是 alphacoronavirus，但是不同病毒株)只有部分的保護作用。後來有篇研究(Callow et al, 1990)顯示，如果體內抗體量不夠的話，229E 的康復患者可被二次感染。參與此研究的志願者在感染病毒一週後，IgG 開始上升，然後在十四天時達到高峰，一年後再測的時候抗體量仍然比感染前高，當再一次接受感染挑戰的時候，雖然約有一半的人被二次感染，但都沒有症狀。另外，第一次感染的時候，在前五到六天都測得到病毒，而二次感染時，只有前兩天測得到病毒，顯示病毒被清掉的很快。」



所以，到目前大概知道了什麼？

1. 未感染的健康個體雖然沒有抗新冠病毒的抗體，但是有可辨識新冠病毒的 T cells。COVID-19 患者的 T cells 幾乎對所有新冠病毒的蛋白都有反應，包括 Spike, M & N proteins，以及 NSPs，但未感染者則是以 Spike 和 NSPs 為主，對 N 沒什麼反應。

2. 有的原因很可能是因為感染過常見的感冒冠狀病毒，體內已有抗冠狀病毒的 T cells，由於有 cross-reactivity，因此這些 T cells 也可以辨識新冠病毒。

3. Cross-reactivity 的部分目前知道的可能有 Spike S2 和一些 NSPs，homology 可能要高於 67%，cross-reactivity 才會比較高。


未感染者體內雖然有可辨識新冠病毒的 CD4+ T cells，但並不表示它們有保護作用，因為他們是 helper T cells，並沒有消滅病毒或感染細胞的實質功能，所以我還滿想知道未感染者體內是否有 CD8+ T cells。



原論文：

J Mateus et al, Selective and cross-reactive SARS-CoV-2 T cell epitopes in unexposed humans. Science (2020)

J Braun et al, SARS-CoV-2-reactive T cells in healthy donors and patients with COVID-19. Nature (2020)

未感染過新冠病毒或 SARS 的人也有對抗新冠病毒的 T cells

體內對抗病毒或細菌的免疫系統除了抗體外，還有免疫細胞們。之前說過，免疫系統有兩種，一種是第一線的先天免疫系統(innate immunity)，另一種是感染後學習得來的 adaptive immunity。簡單來說，第一線的先天免疫系統裡，負責打仗的是白血球，包括巨噬細胞(macrophage)和自然殺手細胞(natural killer cells, NK cells)等等。負責第二線 adaptive immunity 則是消滅被感染細胞的 T cells 和生產抗體的 B cells。通常感染後的 B cells 反應程度和 T cells 反應程度是相關的，有一個就有另一個，之前較多研究是著重在感染新冠病毒後，體內是否產生可以對抗的中和抗體(neutralizing antibodies)，不過最近有幾篇研究是關於 T cells 免疫反應的，有趣的發現是有的人體內測不到抗新冠病毒的抗體，但卻有抗新冠病毒的 T cells，尤其是 CD4+ (helper) T cells。

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人類冠狀病毒有七個，除了這次的 SARS-CoV-2 和之前的 SARS, MERS，另外就是造成感冒的 OC43, HKU1, 229E 和 NL63，這些全部都會引起 T cells 反應和產生抗體，不過抗體消退的比 T cells 反應快，SARS 患者的抗體大概可維持兩、三年，不過他們的 memory T cells 在感染後至今已有十七年了仍存在於體內。之前有研究顯示抗冠狀病毒的抗體有 cross-reactivity，除了抗 spike RBD (receptor-binding domain) 的抗體比較有 specificity，由於其他蛋白在冠狀病毒中還滿 conserved，抗這些蛋白的抗體很多都有 cross-reactivity，也就是說抗其他冠狀病毒的抗體也可以辨識新冠病毒的抗體。抗體是這樣，T cells 也是這樣嗎？

前幾天發表在 Nature 的一篇研究分析了三組人的 T cells，包括有 SARS 康復患者、新冠病毒的康復患者，以及沒有感染過 SARS 和 SARS-CoV-2 或接觸過患者的個體，想知道他們體內是否有對抗新冠病毒的 T cells ，還有對病毒的哪些部分有反應，例如結構蛋白(structural protein) nucleocapsid (NP) 和非結構蛋白(non-structural proteins) NSP7 等等 [註]。

註：病毒蛋白分為兩種：structural proteins 和 non-structural (NS) proteins。Structural proteins 就是組成病毒的蛋白，例如 capsid proteins 或是 envelope proteins。NS proteins 大多是酶類蛋白，功能為調控病毒蛋白的表現居多，這篇論文裡測的 NSP7 和 NSP13 在冠狀病毒的小族群裡變化不多，SARS 和 SARS-CoV-2 的 NSP7 和 NSP13 幾乎一樣，這種通常會有 cross-reactivity。

1. 新冠病毒患者, n = 36

所有康復患者的免疫細胞(PBMC, peripheral blood mononuclear cells)對 NP 有反應，但是只有 33% 的人對 NSP7 和 NSP13 有反應。有的人的 T cells 可以對 NP 的很多片段有反應，有些 NP 片段除了可被新冠病毒患者的 T cells 辨識外，同時也可以被 SARS 康復患者的 T cells 所辨識。對病毒 NP 片段有反應的以 CD4 T cells 為主。

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2. SARS 康復患者, n = 23

SARS 已經過去十七年了，康復患者的免疫系統仍然可以對抗 SARS 嗎？這篇研究顯示，SARS 康復患者體內仍存有可以辨識 SARS NP 的免疫細胞，而且也可以辨識新冠病毒的 NP，不過對其 NSP7 和 NSP13 沒什麼反應。這是否說，新冠病毒感染患者的免疫細胞維持的時間和 SARS 康復患者的免疫細胞一樣，可以維持長達十多年後仍對病毒有反應？

3. 沒有 SARS 或新冠病毒病史和接觸史, n = 37

其中二十幾位的血液是 2019 年七月以前採樣的，十一位是抗體測試對新冠病毒的 NP 反應為陰性。分析結果顯示一半以上未感染者的 T cells 可以辨識新冠病毒的蛋白片段，不過它們辨識的片段大多和康復患者體內的 T cells 辨識的病毒片段不同，主要以 NSP7, NSP13 和 NP 為主。NSP7 和 NSP13 雖然在 SARS 和 SARS-CoV-2 間的相似度高，但是和感冒冠狀病毒 OC43, HKU1, NL63 和 229E 的相似度滿低的，那這些未感染過 SARS-CoV-1/2 個體體內的 T cells 不是因為感染過感冒冠狀病毒後習得來的，那是從哪裡得來的呢？是其他未被發現的冠狀病毒嘛？

這篇研究中也提到，雖然體內有可對抗新冠病毒的 T cells，不代表可以使個體免於感染，不過可以在感染之後就消滅它，至少不會使它演變成重症。



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從這篇研究我們知道了什麼？

1. COVID-19 康復患者體內有可以辨識 SARS-CoV-2 的免疫細胞，而且有 cross-reactivity，也可以辨識 SARS 的病毒蛋白。

2. SARS 康復患者體內的免疫細胞可以維持十七年後仍對 SARS 蛋白有反應，並且也有 cross-reactivity，同樣對新冠病毒有反應。

3. 未感染過 SARS-CoV-1/2 或未接觸過患者的個體體內也有可以辨識新冠病毒蛋白的免疫細胞，不過辨識的蛋白和 SARS-CoV-1/2 的康復患者不同，以 NSP7 和 NSP13 為主，不像 SARS-CoV-1/2 康復患者的免疫細胞，主要辨識的是 NP。

4. 目前還不知道為什麼未感染者的體內會有可以辨識 SARS-CoV-2 蛋白的免疫細胞，只知道不是因為感染過感冒冠狀病毒後產生的。



Articles:
TN / “Common Cold” Coronaviruses Could Help Produce Anti-SARS-CoV-2 Immune Cells (July 2020)


Papers:
DM Altmann & RJ Boyton, SARS-CoV-2 T cell immunity: Specificity, function, durability, and role in protection. Science (2020)

NL Bert et al, SARS-CoV-2-specific T cell immunity in cases of COVID-19 and SARS, and uninfected controls. Nature (2020)

輕症及無症狀患者帶有可對抗新冠病毒的 T cells

免疫系統除了較為人知的白血球，例如巨噬細胞(macrophae)等等，還有抗體外，另外就是 T 細胞和製造抗體的 B 細胞。最近有幾篇研究是關於感染新冠病毒後，體內的 T 細胞反應，發現康復患者體內除了有抗 Spike protein 的抗體外，同時也都有能夠辨識新冠病毒的 CD4+ (helper) T cells，並且有強烈反應。也有研究顯示，未感染過新冠病毒的患者的血液檢體裡，也含有可辨識新冠病毒的 helper T cells。

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至於輕症或無症狀患者呢？輕症或無症狀患者的體內不見得測得到抗體，不過最近瑞典的 Karolinska Institute 的研究團隊發現，輕症及無症狀患者體內有對抗新冠病毒的 T cells，即便他們體內沒有產生足夠、可被檢測到的抗體量。

這篇研究先比較了重症患者、康復後的輕症或無症狀患者，還有健康個體的血液，發現其 CD4+ T cells 裡的 CD38 和 PD-1，以及 CD8+ T cells 裡的 CD38 和 CTLA-4 等等的表現有明顯的區別，重症患者的 CD38 和 PD-1 表現比健康個體要高。普遍來說，患者早期的 CD8+ T cells 會有 CD38 和 PD-1 表現增加的現象，而康復患者則是偏向 CCR7+ 的表現增加。他們利用這些差別，分析了今年五月中院內的五個不同族群、兩百位多位個體的 memory T cells，包括在疫情發生前或發生中的健康個體、輕重症和無症狀的康復患者，和康復患者一起住的家庭成員。

跟之前的研究一樣，疫情爆發前的健康個體血液裡有可辨識新冠病毒 membrane protein 和 spike protein 的 T cells，但是對 nucleocapsid 沒有反應，而康復患者則對這三個病毒蛋白都有反應。令人覺訝異的是輕症和無症狀患者，以及在疫情期間捐血的健康個體的血液裡，皆有對這三個病毒蛋白都有反應的 T cells。另外，CD4+ T cells 的反應比 CD8+ T cells 強烈。最後，他們比較了這五個族群體內抗體和 T cells 的關係，發現有些人的抗體檢驗為陰性，但是卻帶有對抗 nucleocapsid, membrane protein 和 spike protein 的 CD4+ 和 CD8+ T cells。帶有對新冠病毒有強烈 T cell responses 的人口中，除了患者家屬、輕症及無症狀患者外，還有在疫情期間的健康患者，帶有抗病毒 T cells 的人數是帶有抗體人數的兩倍之多，表示即便用血清檢測也低估了感染人數。

有些學者擔心，輕症或無症狀患者體內的免疫反應不足以產生保護效應，因為抗體量不高，不過這個研究顯示，雖然抗體不高，但是對抗病毒的 T cells，表示已有可以對抗病毒的免疫機制。在之前 SARS 疫苗的研發中，發現疫苗雖然沒在老鼠體內產生足夠抗體，但卻可以引起 T cell responses，並且足以使老鼠免於不被 SARS 再次感染而死亡，這個現象同樣也在這個研究裡的輕症和無症狀康復患者中觀察到。也有其他研究觀察到，未感染者帶有可辨識新冠病毒的 T cells，可能是因為和其他冠狀病毒有些許的 cross-reactivity 造成的，如果是這樣的話，是不是血清低估感染人數似乎也不能確定。



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抗新冠病毒的 T cells 和抗感冒冠狀病毒的有 cross-reactivity


Articles:

TN / SARS-CoV-2 Immunity Likely To Be Higher Than Antibody Testing Has Shown (July 2020)

Karolinska Instututet / Immunity to COVID-19 is probably higher than tests have shown (June 2020)


Paper:

T Sekine e tal, Robust T cell immunity in convalescent individuals with asymptomatic or mild COVID-19. bioRxiv (2020)

T Sekine e tal, Robust T cell immunity in convalescent individuals with asymptomatic or mild COVID-19. Cell (2020)

有記憶的先天免疫系統

先天免疫系統是可以學習、訓練的嗎？

關於新冠病毒，目前知道的就是大多數人都是無症狀或是輕症，只有少數人會進展到重症，而且大多數是老年人或慢性病患者，這是否和免疫能力有關？

人體的免疫系統有兩種，一種是 innate immune system，一種是 adaptive immune system。Innate immune defense 是先天的免疫反應，沒有針對特定外來物，通常是免疫系統和某個外來物(細菌或病毒)的第一次見面。Adaptive immune system 則是改進過後的免疫反應，是免疫系統跟外來物第一次見面後學習來的，有記憶性，會針對某個外來物。例如說大家第一次感染到新冠病毒的時候，身體對抗的免疫反應是 innate immue system，在這一戰的時候，主要打仗者是各種白血球們(e.g., monocytes, macrophages, natural killer cells)，他們在打仗的過程中得到新冠病毒的蛋白資料(抗原)，然後用這些資料產生對抗它的免疫細胞 (T cells, B cells)和抗體，進化成 adaptive immune defense，當再次感染的時候，adaptive immune system 就可以立刻叫喚出針對新冠病毒的免疫細胞和抗體，快速消滅病毒。（有興趣的可以看工作細胞第三集）



Innate immunity 和 adaptive immunity 的差別主要在前者沒有記憶性，後者則是依靠前者的經驗學習記憶後得來的 immunity，不過近期有研究認為，innate immunity 也是可以被訓練成有記憶性的，也就是 trained immunity，而這靠的是改變基因表現，也就是 epigenetic reprogramming。Trained immunity 和原本的 adaptive immunity 不同點在於 [3]：

1. 參與 trained immunity 的免疫細胞有 monocytes, macrophages, natural killer cells (NK cells) 等等，adaptive immunity 則是 T cells 和 B cells。

2. adaptive immunity 是有目標性的，靠的是基因重組(gene rearrangement)後產生的、針對不同抗原的抗體，trained immunity 改變的不是基因本身，而是基因的表現(epigenetic)。有意思的是之前有研究顯示 NK cells 和 CD8+ T cells (CTLs) 有相似的基因表現機制，可能是讓 NK cells 有記憶性的的原因 [4]。

3. trained immunity 改變免疫細胞功能是短期的，只有幾個月，adaptive immunity 的改變則是長期的，可達幾年。


Figure / Schematic representation of the concept of "training immunity" (Kar & Joosten, Nature Immunology 2020)

這一篇文章要說的便是 innate immunity 是否可以被訓練，進而展現 adaptive immunity 的部分功能 [5]，也就是說在初次感染時，白血球等等習得了要產生哪些蛋白對抗，當後來再次感染的時候，不需要受到相同的病菌感染，innate immunity 的免疫細胞就會立刻產生某些 cytokines 去對抗，就是所謂的 trained immunity。之前有研究顯示卡介苗(bacillus Calmette-Guérin; BCG vaccine)可以產生 trained immunity，卡介苗是去掉毒性的活細菌疫苗，雖然針對的是造成肺結核(tuberculosis)的細菌(Mycobacterium bovis)，但是它引起的 trained immunity 有降低其他病菌感染的效用，例如流感和皰疹病毒，稱為 off-target effects 或是 non-specific effects (NSEs)。另外，健康人施打卡介苗會增加 pro-inflammatory cytokines，得到呼吸道感染的機率比沒打過卡介苗的低了 73%。

之前有研究觀察到有施打卡介苗的國家，新冠病毒確診病例和重症率比較低 [1]，可能是因為它產生的 trained immunity 的效用，對抗病菌的免疫力增強了，因而降低了新冠病毒的感染率。不過，雖然在台灣施打卡介苗是 mandatory，但是在北美並不是，根據加拿大 Health Canada 網站的資訊 [2]，卡介苗的效用不高，而且會干擾診斷，有施打過卡介苗的在肺結核的皮膚測試(TST; tuberculin skin testing)會顯示為陽性，需要病人告知是否施打過卡介苗，不然不知道陽性反應是因為卡介苗還是因為真的感染，所以並不鼓勵施打卡介苗。

"Clinical trials have demonstrated conflicting results regarding BCG vaccine's efficacy. Meta-analytic reviews have estimated the vaccine efficacy in preventing any TB disease at approximately 51%. The protective effect of BCG vaccine against disseminated TB in the newborn is estimated to be 78%.

The duration of BCG vaccine protection is not well-established. Although generally thought to have declining protection over time, one follow up study demonstrated a protective effect for as long as 60 years. BCG vaccine will not prevent the development of active TB in individuals who are already infected with M. tuberculosis. TB disease should be considered as a possible diagnosis in any vaccinee who presents with a suggestive history, or signs or symptoms of TB, regardless of immunization history."

回到卡介苗是否真的的降低新冠病毒感染或重症，因為都還只是觀察到的相關性，所以需要臨床上的確認，目前有幾個國家開始臨床試驗，預計要到今年十月才知道結果。除了卡介苗外，麻疹疫苗也被認為可以產生 trained immunity。



References:

1. JSatoNotes / If I were North American/West European/Australian, I would take BCG vaccination now against the novel coronavirus pandemic

2. Gov of Canada / Bacille Calmette-Guérin (BCG) vaccine: Canadian Immunization Guide

3. MG Netea et al, Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science (2016)

4. UK Kar & L Joosten, Training the trainable cells of the immune system and beyond. Nature Immunology (2020)

5. M Netea et al, Trained Immunity: a Tool for Reducing Susceptibility to and the Severity of SARS-CoV-2 Infection. Cell (2020)

新冠肺炎患者體內的抗體有哪些

這篇研究分析了六十幾位 COVID-19 患者體內的抗體，想知道他們在感染後的產生時間和其 neutralizing 的功效。

摘要：

1. 用 ELISA 實驗的結果，發現用 Spike RBD (receptor-binding domain) 來測試患者體內抗體的 specificity 和 sensitivity 比較高。

2. 幾乎沒有患者在症狀出現後八天內有測到中和抗體(neutralizing antibodies)，然後在第 21 天時有 91% 的患者測得到低量的 neutralizing antibodies，只有 73% 的患者體內有保護作用的中和抗體含量高於 1:80。

3. 大約有 32% 在症狀出現 21 天後，體內中和抗體的量依然很低，有的甚至沒有。

4. 大部分的人在出現症狀七天後，體內才測到較高的 IgG 和 IgM 抗體。

5. 症狀出現九天後，體內 IgG 抗體較為普遍，大多數感染過的人都有 IgG 抗體(94%)，七成的患者有 IgM。

6. FDA 建議用血清來治療的 titre 是 1:160，目前只收症狀持續兩個禮拜的康復患者捐獻的血液用於治療。

7. RBD-binding 的抗體量和保護作用(neutralizing)呈現正相關：體內 anti-RBD 的抗體越多，保護作用越大。

8. 患者體內 IgM 的量也和體內的中和抗體(neutralizing antibodies)的量呈現正相關。

註：中和抗體為可結合病毒，進而抑制其感染細胞的抗體。

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Publication

L Premkumar et al, The receptor binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science Immunology (2020)

新冠病毒的哪個部分最能引起免疫反應呢？

知道這個有什麼用呢？可以用來做疫苗研發，如果我們知道病毒的哪個蛋白或蛋白的哪個片段可以引起有效的免疫反應，那就可以用來作為疫苗，比起打入整顆的病毒，只打入病毒的某個蛋白或某個蛋白片段會相對安全，有人想研發 DNA- 或 RNA-based 疫苗的部分原因也在此，因為它們只會在體內表現病毒的蛋白或蛋白片段，而不是整個病毒。

這個研究主要是用 Spike protein，他們把 Spike protein 依照目前所知的 domains 分成幾個片段試驗。

1. S-ectodomain (S1+S2), aa 16-1213
2. S1, aa 16-685
3. RBD, aa 319-541
4. S2, aa 686-1213

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他們把這些蛋白片段打入兔子體內，第一次和第一次施打隔了兩個禮拜，然後在打入後第八天取血清分析，看看哪個可以引起強烈的免疫反應。他們用 ELISA 測試血清裡的 IgG 和四種抗原的反應，結果顯示所有的血清都有可和 S-ecto 產生強烈反應的 IgG，而和其他三個抗原的反應則滿 specific，打入 S2 兔子的血清只對 S2 產生反應，對 S1 和 RBD 則沒反應。

因為 ELISA 分析的是 IgG binding，他們另外也用 SPR 分析其他 Ig binding，結果顯示在二次施打後，所有取得的血清裡，anti-Spike 的抗體中有 80% 是 IgG，10-15% 是 IgA，以及少量的 IgM。專一性的話呢， S-ecto 兔子的血清裡，大多數抗體都和 S-ecto 結合，再來是和 S1，最後是 RBD 和 S2，大概是 S-ecto 的三分之一。S1 兔子血清裡和 S-ecto, S1 以及 RBD 結合的抗體都差不多多，沒有和 S2 結合的。RBD 兔子血清裡的抗體一樣是和 S-ecto, S1 以及 RBD 結合的量都差不多，但是量都是 S1 兔子的三倍，而且這些抗體對抗原的 affinity 是其他兔子抗體的五倍。

再來就是看這些抗體的保護力了，他們用 RBD-hACE2 binding competition SPR assay 和 neutralization 測試抗體抑制病毒的功效。因為新冠病毒進入細胞靠的是 RBD 和宿主細胞 hACE2 的結合，competition SPR assay 便是測試抗體阻斷 RBD 和 hACE2 的功效如何，結果顯示 S1 兔子和 RBD 兔子的血清阻斷的效能最好，分別為 84% 和 94%，而 S1+S2 的只有 44%。那這些抗體是否可以阻止細胞被病毒感染呢？實驗結果顯示 RBD 兔子的血清抑制病毒感染的效果最好，再來是 S1 兔子的血清，最後才是 S1+S2 兔子的血清。

結論：用病毒 Spike protein RBD 產生出來的抗體對抗原的 affinity 最高，最能有效阻斷 RBD-hACEII binding，抑制病毒感染細胞的效果也最好。



Publication:

S Ravichandran et al, Antibody signature induced by SARS-CoV-2 spike protein immunogens in rabbits. Science Translational Medicine (2020)

武漢肺炎輕症患者體內的免疫反應

在上週發表的 Nature Medicine 裡有一篇是關於輕症患者體內的免疫反應，我相信台灣應該也有康復者的資料，只是不知道有沒有觀察其免疫反應。

這篇是個案，雖說每個人體質不太一樣，但應該也差不了多少，有些復原後的情形也和之前一些康復患者的報告結果一致。

這位個案是從武漢到澳洲墨爾本的 47 歲女士，抵達澳洲的一週後出現 lethargy, sore throat, dry cough, pleuritic chest pain, mild dyspnea, subjective fevers 這些這症狀，出現症狀四天後去墨爾本的急診。他沒去過那個海鮮市場，也沒接觸過已知患者。患者會加入研究是透過 Sentinel Travelers Research Preparedness Platform for Emerging Infectious Diseases novel coronavirus substudy (SETREP-ID-coV)。

患者健康狀況：沒抽煙、沒有服用藥物，身體算健康。

進醫院時的臨床診斷：
- 體溫為 38.5C
- 脈搏每分鐘 120 下
- 血壓 140/80 mm Hg
- 胸部聽診有 bi-basal rhonchi
- 沒有呼吸道併發症
- 沒有急性呼吸道衰竭症狀
- 出現症狀後第四天，RT-qPCR 有測到病毒，直到第六天都測到病毒，但第七天開始顯示為陰性，血液內 C-reactive protein 增加，免疫細胞數量正常。


Figure / 病患復原情況和病毒檢測結果，可以看到雖然咳嗽持續到第 11 天，但第七天開始檢測結果就都是陰性了，病毒量已經降低到測不到。(Thevarajan et al, Nature Medicine 2020)

治療方式：打點滴補充水份，沒給氧氣，沒給抗生素、類固醇或抗病毒藥物。

恢復狀況：症狀開始後第五天的胸部 X 光顯示有 bi-basal infiltrates (肺浸潤)，但是第十天時已經沒有肺浸潤的情況，於是第十一天便讓他回家自主管理，第十三天已完全康復，但還是在家待到第二十天，直到第二十天還是無恙。

體內免疫反應進程：

1. 出現症狀後第 7 到 20 天血液內和新冠病毒(SARS-CoV-2)有反應的 IgG 和 IgM 抗體大量增加。

2. ASCs (antibody-secreting cells)和 CD4+ T cells 於血液中病毒清乾淨後的第七天開始出現。ASCs在第八天達到高峰，CD4+ T cells 則在第八、九天持續增加。這兩個細胞在患者中的高峰期皆比健康個體高很多，而且直到第 20 天康復後都還存在患者體內。CD8+ T cells 也是從第一天開始快速增加直到第九天，但是在第 20 天開始下降。在得流感或施打流感疫苗後，這些免疫細胞也會大量增加。

3. Cytokines & chemokines：H7N9 重症患者體內會大量增加的 IL-6, IL-8, IL-10, MIP-1β 和 IFN-γ 在有症狀的第七到九之間都沒有顯著增加。


在看到輕症患者康復後肺部也會受損的臉書文後，看了這篇後感到心安一些。



原論文：I Thevarajan et al, Breadth of concomitant immune responses prior to patient recovery: a case report of non-severe COVID-19. Nature Medicine (2020)

新冠病毒(SARS-CoV-2)檢測 -- qPCR 和抗體檢測（續）

有看中研院那篇的就知道，目前檢測新冠病毒的方法有三：

1. qPCR：檢測體內是否有病毒 RNA，知道 primers 就可以用來檢測，不需要另外研發，相對準確，敏感度高(sensitivity)，但需四到六小時，包含運送檢體時間等等的 turnaround time 至少要一天。不過目前 UCSF, Mammoth 和加州 Public Health 部門合作研發的 SARS-CoV-2 DETECTR 利用 CRISPR 技術似乎可以快速檢測，加上 RNA extraction 的時間只要 45 分鐘。

2. 用抗體檢測體內抗原(也就是病毒)：跟 qPCR 比起來準確度較低(需要注意有沒有 cross-reactivity)，也需要時間研發，但是檢驗方法簡單，速度也快，turnaround time 約二十分鐘到一小時。（下圖的第三種 sandwich assay）

3. 用抗原(也就是病毒蛋白)檢測體內是否有抗體：研發時間沒上面那個長，比較簡單，檢驗方法也同樣簡單和快速，但需要等到症狀出現後，病患體內產生抗體才測得到，通常是用來追蹤是否曾經感染過。（下圖的第一種 direct assay 或第二種 indirect assay）

相關文章：新冠病毒(SARS-CoV-2)的檢測 -- qPCR 和抗體


Figure / Diagram of common ELISA formats (direct vs. sandwich assays)(Thermo Fisher)

註：抗體檢測的原理跟 ELISA 相同，可以固定抗原(antigen)去測體內抗體(antibody)，如上圖的第一種和第二種，這種只要有抗原就可以測，或是固定抗體去測體內是否有抗原，如上圖中的第三種，這種比較需要花時間先去研發出好的抗體。

相關文章：簡單檢測新冠病毒抗體

Nature 的這篇介紹了幾個正在研發的抗體檢測，第一個介紹的就是中研院楊老師的那個 LFIA！和大多數用 S (spike) protein 做抗原的抗體檢測不同的是中研院用的是 N (nucleocapsid) protein，其中一株抗體和 SARS 還有其他種冠狀病毒的 spike protein 沒有 cross-reactivity。不過看了這篇才知道，中研院的抗體是用 AI 去模擬 Ag-Ab interactions 後製造出來人造抗體 libraries，然後再用 phage display 去抓出抗體，而不是用動物去製造抗體，或是從康復患者體內釣出來，因此省掉了兩個月的時間。（也就是說中研院有抗體的基因序列，可以大量生產，也許可以測試是否能用於治療，不過我覺得 anti-spike 的抗體應該會比較有效果。）

相關文章：Phage display 和小抗體製造


Figure / Schematic representation of a LFIA device (Banerjee et al, Analyst 2018; doi: 10.1039/C8AN00307F)

抗體檢測大多用 LFIA (lateral flow immunoassay) 式的快篩，原理跟 ELISA 相同，只是長得像驗孕棒 XD。如上圖的 LFIA 所示，用的是 sandwich assay，也就是把抗體固定在檢測棒上面，然後先讓(可能含有病毒)的血液和帶有染劑的抗體混合，然後讓混合後的血液和抗體流過檢測棒，如果有血液含有抗原(也就是抗原)的話，就會被固定在檢測棒的抗體抓住。另一條 control line 是抓多餘的帶有染劑的抗體，也就是確認有足夠的抗體，並且有作用。因此如果血液中有病毒的話，就會有兩條線，沒有的話就會只出現 control line 那條線。

第二個介紹的是加拿大的公司 Sona Nanotech (Halifax-based)，他們是和 GE 合作研發的 LFIA，抗原用的是 spike protein 的 S1 domain，目前預估是六到八週內可以有供研究使用的產量。

如最之前說的，檢測體內是否有對抗病毒的抗體相對簡單，只要純化出抗原就可以下去測了，德國柏林的 Pharmact 已經有二十分鐘的抗體快篩檢測，用的抗原是 N protein 和 spike protein 的 S1 和 S2 domain，可以用來檢測患者體內是否有這兩個病毒蛋白的抗體，這個快篩可以檢測到 IgM 和 IgG，IgM 是人體受感染後最先產生的抗體，之後再產生 IgG。他們和 qPCR 結果做比較，結果顯示準確度很高 -- 100% true negative 和 0% false positive，不過缺點是敏感度低，因為一開始的 IgM 反應並不高，感染後的 4 - 10 天內測到的敏感度只有 70%，但是第 11 天到第 24 天可以測到 92.5%，IgG 在這幾天測到的比例也高達 98.6%，因此整體 false negative 比例約為 13%。

關於患者體內的免疫反應可參考：武漢肺炎輕症患者體內的免疫反應


其他相關文章：關於武漢病毒(SARS-CoV-2) Cryo-EM 那篇論文的閒聊



Article:

Nature / Fast, portable tests come online to curb coronavirus pandemic (March 2020)


Papers:

JP Broughton et al, Rapid Detection of 2019 Novel Coronavirus SARS-CoV-2 Using a CRISPR-based DETECTR Lateral Flow Assay. MedRxiv (2020)

R Banerjee & A Jaiswal, Recent advances in nanoparticle-based lateral flow immunoassay as a point-of-care diagnostic tool for infectious agents and diseases. Analyst (2018)