之前已有好幾篇研究顯示，未感染者體內有抗新冠病毒的免疫 T cells，有可能是因為和其他的冠狀病毒有 cross-reactivity。這篇研究用 flow cytometry 分析了未感染者和患者抗冠狀病毒 Spike protein 的三種抗體 IgA, IgM 和 IgG，想知道新冠病毒和感冒冠狀病毒之間 cross-reactivity 程度有多少。
相關文章：未感染過新冠病毒或 SARS 的人也有對抗新冠病毒的 T cells
冠狀病毒的 Spike protein 分成 S1 和 S2 兩個 domains，S2 在冠狀病毒間的相似度比較高，叫有可能是 cross-reactivity 的來源。他們的 competitive binding assays 結果顯示，未感染者和患者的血清抗體間的 cross-reactivity 主要在於 S2。跟未感染者的抗體相較，患者血清內的抗體免感度(sensitivity)和專一性(specificity)比較高。
相關文章：抗新冠病毒的 T cells 和抗感冒冠狀病毒的有 cross-reactivity
這種 cross-reactivity 有多普及呢？他們分析了疫情前 2011 年到 2019 年時收集的血清，和新冠病毒患者的血清做比較。結果顯示冠狀病毒間的 cross-reactivity 在年輕族群中比較普遍，2011 年到 2018 年間，十六歲以下的健康個體約有 50% 的血清內有可辨識新冠病毒 Spike 的 IgG，17 - 25 歲之間只有 2%；2019 年採集的中年族群的血清，約有 8% 有低量的、可辨識新冠病毒 Spike 的 IgG。例外，新冠病毒患者血清內同時有可辨識 Spike 的 IgG, IgM 和 IgA，而未感染者的則主要為 IgG，沒有 IgM 和 IgA，重要的是未感染者血清內的抗體具有中和新冠病毒的效力。
Paper:
KW Ng et al, Preexisting and de novo humoral immunity to SARS-CoV-2 in humans. Science (2020)
2020年11月20日 星期五
2020年8月8日 星期六
不需用細胞和病毒的中和抗體檢測
快速抗體檢測，這是之前新加坡大學和 Duke University 合作的那個，他們測的是體內的中和抗體(neutralizing antibodies)，就是可以和病毒結合，使它不能感染細胞，有抑制病毒作用的抗體。
要測體內是否有中和抗體，需要做抗體中和檢測(virus neutralization test, VNT)，簡單來說就是把抗體和病毒先混在一起 incubate，一個小時後再把抗體和病毒的混合物來拿來感染細胞，看看感染率有多少。中和抗體越多，可以抑制的病毒也就愈多，感染的細胞也就越少。通常這種檢測用的是原本的、活的病毒，所以要測新冠病毒的中和抗體的話，用的就是新冠病毒，不過如果要用新冠病毒，就需要 BSL3 的實驗室。在這篇論文裡，他們用的方法是 surrogate VNT (sVNT)，不需要用活的病毒，也不需要細胞，所以在 BSL2 實驗室就可以做，而且論文說他們在新加坡(n=175)和中國(n=50)的患者群身上測試結果，99.93% specificity (準確度) & 95-100% sensitivity (敏感度)。
相關文章：新冠病毒(SARS-CoV-2)的檢測 -- qPCR 和抗體
不用病毒，也不用細胞，要怎麼測試呢？因為我們已經知道新冠病毒感染是透過它的 spike protein RBD (receptor-binding domain) 和人類細胞表面的接受器 ACE2 結合而進入細胞的，所以他們認為只要在 ELISA plate 上測試就可以了，看了論文裡的圖示，其實就是普通的 ELISA，把 ACE2 coat 在 ELISA 上面，當作是細胞表面，然後把患者血清和 RBD 混合，RBD 已經是 HRP-conjugate，之後再把混合後的 Ab/RBD-HRP 加到 ACE2-coated ELISA plate，最後測訊號看看有多少 RBD 和 ACE2 結合，訊號越低的就表示血清裡中和抗體的含量越高。
他們還和兔子、老鼠、駱馬和人類的其他十五個 mAb 做比較，看看他們的 sVNP 是否能分別出普通抗體和有中和作用的抗體，結果顯示那些 mAb 在他們的 sVNP 檢測裡只有微弱的中和病毒的效用，有的甚至沒有，表示 sVNP 測到的是中和抗體的含量，而不是所有抗新冠病毒的抗體 [註]。
註：並不是所有抗新冠病毒的抗體都是中和抗體，有抑制病毒的效用，之前有研究顯示只有 anti-Spike S1 和 anti-Spike RBD 的抗體有抑制病毒的效用。
相關文章：近期和新冠病毒抗體相關的研究
除此之外，論文裡說他們的 sVNT 測的是所有中和病毒的 isotypes，也就是包括 IgG 和 IgM，不像其他大多數的抗體檢測，只有測 IgG 或 IgM。他們用了不同濃度的 IgM 和 IgG 抗體去測，都可以測到中和抗體，即便 IgG 和 IgM 量都很低，也可以測出中和抗體 70-90% 的抑制功效，表示他們的 sVNT 的敏感度很高。另外，他們也試了不同動物的中和抗體和普通抗體，也就是把 RBD 或整顆病毒打入動物體內，被打入 RBD 的動物體內產生的抗體便都會是有抑制效用的中和抗體，打入整顆病毒的可能只有部分是中和抗體，結果顯示皆可測到中和抗體，不過被打入 RBD 的動物血清抑制病毒的效力比較高。
最後，就是測試準確度了，看看 sVNT 是否可分別出 SARS, 新冠病毒和其他的冠狀病毒。實驗結果顯示感冒冠狀病毒(229E, NL63 or OC43)患者的血清裡並沒有測到可抑制新冠病毒的抗體，而 SARS 康復患者的血清內則有一點點，顯示有一點 cross-reactivity。不過當把 SARS sVNT 和 SARS-CoV-2 sVNT 放在一起比較的話，是可以看出分別的，SARS 康復患者的血清對 SARS RBD 的抑制效果比 SARS-CoV-2 要好。
雖然他們在 sVNT 裡 SARS 患者的血清和新冠病毒是有 cross-reactivity，但其他研究團隊用病毒和細胞系統的中和檢測(conventional VNT, cVNT)中是沒有的，所以這表示 sVNT 的敏感度比較高嗎？我覺得有意思的是 SARS 康復患者的血清裡仍測得到中和抗體，大家都知道 SARS 已經過去十七年了，這表示感染過 SARS 後，體內的抗體能維持十七年，而不是之前認為的只有三年嗎？他們有跟 2003 年時，感染不到一年後採的血清相比，十七年後血清內的中和抗體量是比感染不到一年時低，但也沒有說低很多。
他們也和普通的 cVNT 做比較，看結果是否一樣，sVNT 的結果是否可以轉譯成 cVNT，看起來結果是一樣的，表示 sVNT 應該可以取代 cVNT。剛需要花上兩三天的 cVNT 相比，sVNT 花的時間是要短得多，一天內可以搞定，不過論文中說只要一、兩個小時也 .... incubation 就兩個小時惹，再加處理血清和做 ELISA 本身的時間，總共也要花個三、四個小時吧，雖然他們用 RBD-HRP 就可以少一個小時的 incubation time, but still.... 不過它的好處是普通實驗室就可以做惹。
原論文：
CW Tan et al, A SARS-CoV-2 surrogate virus neutralization test based on antibody-mediated blockage of ACE2–spike protein–protein interaction. Nature Biotech (2020)
要測體內是否有中和抗體，需要做抗體中和檢測(virus neutralization test, VNT)，簡單來說就是把抗體和病毒先混在一起 incubate，一個小時後再把抗體和病毒的混合物來拿來感染細胞，看看感染率有多少。中和抗體越多，可以抑制的病毒也就愈多，感染的細胞也就越少。通常這種檢測用的是原本的、活的病毒，所以要測新冠病毒的中和抗體的話，用的就是新冠病毒，不過如果要用新冠病毒，就需要 BSL3 的實驗室。在這篇論文裡，他們用的方法是 surrogate VNT (sVNT)，不需要用活的病毒，也不需要細胞，所以在 BSL2 實驗室就可以做，而且論文說他們在新加坡(n=175)和中國(n=50)的患者群身上測試結果，99.93% specificity (準確度) & 95-100% sensitivity (敏感度)。
相關文章：新冠病毒(SARS-CoV-2)的檢測 -- qPCR 和抗體
不用病毒，也不用細胞，要怎麼測試呢？因為我們已經知道新冠病毒感染是透過它的 spike protein RBD (receptor-binding domain) 和人類細胞表面的接受器 ACE2 結合而進入細胞的，所以他們認為只要在 ELISA plate 上測試就可以了，看了論文裡的圖示，其實就是普通的 ELISA，把 ACE2 coat 在 ELISA 上面，當作是細胞表面，然後把患者血清和 RBD 混合，RBD 已經是 HRP-conjugate，之後再把混合後的 Ab/RBD-HRP 加到 ACE2-coated ELISA plate，最後測訊號看看有多少 RBD 和 ACE2 結合，訊號越低的就表示血清裡中和抗體的含量越高。
他們還和兔子、老鼠、駱馬和人類的其他十五個 mAb 做比較，看看他們的 sVNP 是否能分別出普通抗體和有中和作用的抗體，結果顯示那些 mAb 在他們的 sVNP 檢測裡只有微弱的中和病毒的效用，有的甚至沒有，表示 sVNP 測到的是中和抗體的含量，而不是所有抗新冠病毒的抗體 [註]。
註：並不是所有抗新冠病毒的抗體都是中和抗體，有抑制病毒的效用，之前有研究顯示只有 anti-Spike S1 和 anti-Spike RBD 的抗體有抑制病毒的效用。
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除此之外，論文裡說他們的 sVNT 測的是所有中和病毒的 isotypes，也就是包括 IgG 和 IgM，不像其他大多數的抗體檢測，只有測 IgG 或 IgM。他們用了不同濃度的 IgM 和 IgG 抗體去測，都可以測到中和抗體，即便 IgG 和 IgM 量都很低，也可以測出中和抗體 70-90% 的抑制功效，表示他們的 sVNT 的敏感度很高。另外，他們也試了不同動物的中和抗體和普通抗體，也就是把 RBD 或整顆病毒打入動物體內，被打入 RBD 的動物體內產生的抗體便都會是有抑制效用的中和抗體，打入整顆病毒的可能只有部分是中和抗體，結果顯示皆可測到中和抗體，不過被打入 RBD 的動物血清抑制病毒的效力比較高。
最後，就是測試準確度了，看看 sVNT 是否可分別出 SARS, 新冠病毒和其他的冠狀病毒。實驗結果顯示感冒冠狀病毒(229E, NL63 or OC43)患者的血清裡並沒有測到可抑制新冠病毒的抗體，而 SARS 康復患者的血清內則有一點點，顯示有一點 cross-reactivity。不過當把 SARS sVNT 和 SARS-CoV-2 sVNT 放在一起比較的話，是可以看出分別的，SARS 康復患者的血清對 SARS RBD 的抑制效果比 SARS-CoV-2 要好。
雖然他們在 sVNT 裡 SARS 患者的血清和新冠病毒是有 cross-reactivity，但其他研究團隊用病毒和細胞系統的中和檢測(conventional VNT, cVNT)中是沒有的，所以這表示 sVNT 的敏感度比較高嗎？我覺得有意思的是 SARS 康復患者的血清裡仍測得到中和抗體，大家都知道 SARS 已經過去十七年了，這表示感染過 SARS 後，體內的抗體能維持十七年，而不是之前認為的只有三年嗎？他們有跟 2003 年時，感染不到一年後採的血清相比，十七年後血清內的中和抗體量是比感染不到一年時低，但也沒有說低很多。
他們也和普通的 cVNT 做比較，看結果是否一樣，sVNT 的結果是否可以轉譯成 cVNT，看起來結果是一樣的，表示 sVNT 應該可以取代 cVNT。剛需要花上兩三天的 cVNT 相比，sVNT 花的時間是要短得多，一天內可以搞定，不過論文中說只要一、兩個小時也 .... incubation 就兩個小時惹，再加處理血清和做 ELISA 本身的時間，總共也要花個三、四個小時吧，雖然他們用 RBD-HRP 就可以少一個小時的 incubation time, but still.... 不過它的好處是普通實驗室就可以做惹。
原論文：
CW Tan et al, A SARS-CoV-2 surrogate virus neutralization test based on antibody-mediated blockage of ACE2–spike protein–protein interaction. Nature Biotech (2020)
2020年6月27日 星期六
新冠肺炎患者體內的抗體有哪些
這篇研究分析了六十幾位 COVID-19 患者體內的抗體，想知道他們在感染後的產生時間和其 neutralizing 的功效。
摘要：
1. 用 ELISA 實驗的結果，發現用 Spike RBD (receptor-binding domain) 來測試患者體內抗體的 specificity 和 sensitivity 比較高。
2. 幾乎沒有患者在症狀出現後八天內有測到中和抗體(neutralizing antibodies)，然後在第 21 天時有 91% 的患者測得到低量的 neutralizing antibodies，只有 73% 的患者體內有保護作用的中和抗體含量高於 1:80。
3. 大約有 32% 在症狀出現 21 天後，體內中和抗體的量依然很低，有的甚至沒有。
4. 大部分的人在出現症狀七天後，體內才測到較高的 IgG 和 IgM 抗體。
5. 症狀出現九天後，體內 IgG 抗體較為普遍，大多數感染過的人都有 IgG 抗體(94%)，七成的患者有 IgM。
6. FDA 建議用血清來治療的 titre 是 1:160，目前只收症狀持續兩個禮拜的康復患者捐獻的血液用於治療。
7. RBD-binding 的抗體量和保護作用(neutralizing)呈現正相關：體內 anti-RBD 的抗體越多，保護作用越大。
8. 患者體內 IgM 的量也和體內的中和抗體(neutralizing antibodies)的量呈現正相關。
註：中和抗體為可結合病毒，進而抑制其感染細胞的抗體。
摘要：
1. 用 ELISA 實驗的結果，發現用 Spike RBD (receptor-binding domain) 來測試患者體內抗體的 specificity 和 sensitivity 比較高。
2. 幾乎沒有患者在症狀出現後八天內有測到中和抗體(neutralizing antibodies)，然後在第 21 天時有 91% 的患者測得到低量的 neutralizing antibodies，只有 73% 的患者體內有保護作用的中和抗體含量高於 1:80。
3. 大約有 32% 在症狀出現 21 天後，體內中和抗體的量依然很低，有的甚至沒有。
4. 大部分的人在出現症狀七天後，體內才測到較高的 IgG 和 IgM 抗體。
5. 症狀出現九天後，體內 IgG 抗體較為普遍，大多數感染過的人都有 IgG 抗體(94%)，七成的患者有 IgM。
6. FDA 建議用血清來治療的 titre 是 1:160，目前只收症狀持續兩個禮拜的康復患者捐獻的血液用於治療。
7. RBD-binding 的抗體量和保護作用(neutralizing)呈現正相關：體內 anti-RBD 的抗體越多，保護作用越大。
8. 患者體內 IgM 的量也和體內的中和抗體(neutralizing antibodies)的量呈現正相關。
註：中和抗體為可結合病毒，進而抑制其感染細胞的抗體。
新冠病毒的哪個部分最能引起免疫反應呢？
知道這個有什麼用呢？可以用來做疫苗研發，如果我們知道病毒的哪個蛋白或蛋白的哪個片段可以引起有效的免疫反應，那就可以用來作為疫苗，比起打入整顆的病毒，只打入病毒的某個蛋白或某個蛋白片段會相對安全，有人想研發 DNA- 或 RNA-based 疫苗的部分原因也在此，因為它們只會在體內表現病毒的蛋白或蛋白片段，而不是整個病毒。
這個研究主要是用 Spike protein，他們把 Spike protein 依照目前所知的 domains 分成幾個片段試驗。
1. S-ectodomain (S1+S2), aa 16-1213
2. S1, aa 16-685
3. RBD, aa 319-541
4. S2, aa 686-1213
相關文章：近期和新冠病毒抗體相關的研究
他們把這些蛋白片段打入兔子體內，第一次和第一次施打隔了兩個禮拜，然後在打入後第八天取血清分析，看看哪個可以引起強烈的免疫反應。他們用 ELISA 測試血清裡的 IgG 和四種抗原的反應，結果顯示所有的血清都有可和 S-ecto 產生強烈反應的 IgG，而和其他三個抗原的反應則滿 specific，打入 S2 兔子的血清只對 S2 產生反應，對 S1 和 RBD 則沒反應。
因為 ELISA 分析的是 IgG binding，他們另外也用 SPR 分析其他 Ig binding，結果顯示在二次施打後，所有取得的血清裡，anti-Spike 的抗體中有 80% 是 IgG，10-15% 是 IgA，以及少量的 IgM。專一性的話呢， S-ecto 兔子的血清裡，大多數抗體都和 S-ecto 結合，再來是和 S1，最後是 RBD 和 S2，大概是 S-ecto 的三分之一。S1 兔子血清裡和 S-ecto, S1 以及 RBD 結合的抗體都差不多多，沒有和 S2 結合的。RBD 兔子血清裡的抗體一樣是和 S-ecto, S1 以及 RBD 結合的量都差不多，但是量都是 S1 兔子的三倍，而且這些抗體對抗原的 affinity 是其他兔子抗體的五倍。
再來就是看這些抗體的保護力了，他們用 RBD-hACE2 binding competition SPR assay 和 neutralization 測試抗體抑制病毒的功效。因為新冠病毒進入細胞靠的是 RBD 和宿主細胞 hACE2 的結合，competition SPR assay 便是測試抗體阻斷 RBD 和 hACE2 的功效如何，結果顯示 S1 兔子和 RBD 兔子的血清阻斷的效能最好，分別為 84% 和 94%，而 S1+S2 的只有 44%。那這些抗體是否可以阻止細胞被病毒感染呢？實驗結果顯示 RBD 兔子的血清抑制病毒感染的效果最好，再來是 S1 兔子的血清，最後才是 S1+S2 兔子的血清。
結論：用病毒 Spike protein RBD 產生出來的抗體對抗原的 affinity 最高，最能有效阻斷 RBD-hACEII binding，抑制病毒感染細胞的效果也最好。
Publication:
S Ravichandran et al, Antibody signature induced by SARS-CoV-2 spike protein immunogens in rabbits. Science Translational Medicine (2020)
這個研究主要是用 Spike protein，他們把 Spike protein 依照目前所知的 domains 分成幾個片段試驗。
1. S-ectodomain (S1+S2), aa 16-1213
2. S1, aa 16-685
3. RBD, aa 319-541
4. S2, aa 686-1213
相關文章：近期和新冠病毒抗體相關的研究
他們把這些蛋白片段打入兔子體內，第一次和第一次施打隔了兩個禮拜，然後在打入後第八天取血清分析，看看哪個可以引起強烈的免疫反應。他們用 ELISA 測試血清裡的 IgG 和四種抗原的反應，結果顯示所有的血清都有可和 S-ecto 產生強烈反應的 IgG，而和其他三個抗原的反應則滿 specific，打入 S2 兔子的血清只對 S2 產生反應，對 S1 和 RBD 則沒反應。
因為 ELISA 分析的是 IgG binding，他們另外也用 SPR 分析其他 Ig binding，結果顯示在二次施打後，所有取得的血清裡，anti-Spike 的抗體中有 80% 是 IgG，10-15% 是 IgA，以及少量的 IgM。專一性的話呢， S-ecto 兔子的血清裡，大多數抗體都和 S-ecto 結合，再來是和 S1，最後是 RBD 和 S2，大概是 S-ecto 的三分之一。S1 兔子血清裡和 S-ecto, S1 以及 RBD 結合的抗體都差不多多，沒有和 S2 結合的。RBD 兔子血清裡的抗體一樣是和 S-ecto, S1 以及 RBD 結合的量都差不多，但是量都是 S1 兔子的三倍，而且這些抗體對抗原的 affinity 是其他兔子抗體的五倍。
再來就是看這些抗體的保護力了，他們用 RBD-hACE2 binding competition SPR assay 和 neutralization 測試抗體抑制病毒的功效。因為新冠病毒進入細胞靠的是 RBD 和宿主細胞 hACE2 的結合，competition SPR assay 便是測試抗體阻斷 RBD 和 hACE2 的功效如何，結果顯示 S1 兔子和 RBD 兔子的血清阻斷的效能最好，分別為 84% 和 94%，而 S1+S2 的只有 44%。那這些抗體是否可以阻止細胞被病毒感染呢？實驗結果顯示 RBD 兔子的血清抑制病毒感染的效果最好，再來是 S1 兔子的血清，最後才是 S1+S2 兔子的血清。
結論：用病毒 Spike protein RBD 產生出來的抗體對抗原的 affinity 最高，最能有效阻斷 RBD-hACEII binding，抑制病毒感染細胞的效果也最好。
Publication:
S Ravichandran et al, Antibody signature induced by SARS-CoV-2 spike protein immunogens in rabbits. Science Translational Medicine (2020)
2020年3月28日 星期六
武漢肺炎輕症患者體內的免疫反應
在上週發表的 Nature Medicine 裡有一篇是關於輕症患者體內的免疫反應，我相信台灣應該也有康復者的資料，只是不知道有沒有觀察其免疫反應。
這篇是個案，雖說每個人體質不太一樣，但應該也差不了多少，有些復原後的情形也和之前一些康復患者的報告結果一致。
這位個案是從武漢到澳洲墨爾本的 47 歲女士，抵達澳洲的一週後出現 lethargy, sore throat, dry cough, pleuritic chest pain, mild dyspnea, subjective fevers 這些這症狀，出現症狀四天後去墨爾本的急診。他沒去過那個海鮮市場，也沒接觸過已知患者。患者會加入研究是透過 Sentinel Travelers Research Preparedness Platform for Emerging Infectious Diseases novel coronavirus substudy (SETREP-ID-coV)。
患者健康狀況：沒抽煙、沒有服用藥物，身體算健康。
進醫院時的臨床診斷：
- 體溫為 38.5C
- 脈搏每分鐘 120 下
- 血壓 140/80 mm Hg
- 胸部聽診有 bi-basal rhonchi
- 沒有呼吸道併發症
- 沒有急性呼吸道衰竭症狀
- 出現症狀後第四天，RT-qPCR 有測到病毒，直到第六天都測到病毒，但第七天開始顯示為陰性，血液內 C-reactive protein 增加，免疫細胞數量正常。
Figure / 病患復原情況和病毒檢測結果，可以看到雖然咳嗽持續到第 11 天，但第七天開始檢測結果就都是陰性了，病毒量已經降低到測不到。(Thevarajan et al, Nature Medicine 2020)
治療方式：打點滴補充水份，沒給氧氣，沒給抗生素、類固醇或抗病毒藥物。
恢復狀況：症狀開始後第五天的胸部 X 光顯示有 bi-basal infiltrates (肺浸潤)，但是第十天時已經沒有肺浸潤的情況，於是第十一天便讓他回家自主管理，第十三天已完全康復，但還是在家待到第二十天，直到第二十天還是無恙。
體內免疫反應進程：
1. 出現症狀後第 7 到 20 天血液內和新冠病毒(SARS-CoV-2)有反應的 IgG 和 IgM 抗體大量增加。
2. ASCs (antibody-secreting cells)和 CD4+ T cells 於血液中病毒清乾淨後的第七天開始出現。ASCs在第八天達到高峰，CD4+ T cells 則在第八、九天持續增加。這兩個細胞在患者中的高峰期皆比健康個體高很多，而且直到第 20 天康復後都還存在患者體內。CD8+ T cells 也是從第一天開始快速增加直到第九天，但是在第 20 天開始下降。在得流感或施打流感疫苗後，這些免疫細胞也會大量增加。
3. Cytokines & chemokines：H7N9 重症患者體內會大量增加的 IL-6, IL-8, IL-10, MIP-1β 和 IFN-γ 在有症狀的第七到九之間都沒有顯著增加。
在看到輕症患者康復後肺部也會受損的臉書文後，看了這篇後感到心安一些。
原論文：I Thevarajan et al, Breadth of concomitant immune responses prior to patient recovery: a case report of non-severe COVID-19. Nature Medicine (2020)
這篇是個案，雖說每個人體質不太一樣，但應該也差不了多少，有些復原後的情形也和之前一些康復患者的報告結果一致。
這位個案是從武漢到澳洲墨爾本的 47 歲女士，抵達澳洲的一週後出現 lethargy, sore throat, dry cough, pleuritic chest pain, mild dyspnea, subjective fevers 這些這症狀，出現症狀四天後去墨爾本的急診。他沒去過那個海鮮市場，也沒接觸過已知患者。患者會加入研究是透過 Sentinel Travelers Research Preparedness Platform for Emerging Infectious Diseases novel coronavirus substudy (SETREP-ID-coV)。
患者健康狀況：沒抽煙、沒有服用藥物，身體算健康。
進醫院時的臨床診斷：
- 體溫為 38.5C
- 脈搏每分鐘 120 下
- 血壓 140/80 mm Hg
- 胸部聽診有 bi-basal rhonchi
- 沒有呼吸道併發症
- 沒有急性呼吸道衰竭症狀
- 出現症狀後第四天，RT-qPCR 有測到病毒，直到第六天都測到病毒，但第七天開始顯示為陰性，血液內 C-reactive protein 增加，免疫細胞數量正常。
Figure / 病患復原情況和病毒檢測結果，可以看到雖然咳嗽持續到第 11 天，但第七天開始檢測結果就都是陰性了，病毒量已經降低到測不到。(Thevarajan et al, Nature Medicine 2020)
治療方式：打點滴補充水份，沒給氧氣，沒給抗生素、類固醇或抗病毒藥物。
恢復狀況：症狀開始後第五天的胸部 X 光顯示有 bi-basal infiltrates (肺浸潤)，但是第十天時已經沒有肺浸潤的情況，於是第十一天便讓他回家自主管理，第十三天已完全康復，但還是在家待到第二十天，直到第二十天還是無恙。
體內免疫反應進程：
1. 出現症狀後第 7 到 20 天血液內和新冠病毒(SARS-CoV-2)有反應的 IgG 和 IgM 抗體大量增加。
2. ASCs (antibody-secreting cells)和 CD4+ T cells 於血液中病毒清乾淨後的第七天開始出現。ASCs在第八天達到高峰，CD4+ T cells 則在第八、九天持續增加。這兩個細胞在患者中的高峰期皆比健康個體高很多，而且直到第 20 天康復後都還存在患者體內。CD8+ T cells 也是從第一天開始快速增加直到第九天，但是在第 20 天開始下降。在得流感或施打流感疫苗後，這些免疫細胞也會大量增加。
3. Cytokines & chemokines：H7N9 重症患者體內會大量增加的 IL-6, IL-8, IL-10, MIP-1β 和 IFN-γ 在有症狀的第七到九之間都沒有顯著增加。
在看到輕症患者康復後肺部也會受損的臉書文後，看了這篇後感到心安一些。
原論文：I Thevarajan et al, Breadth of concomitant immune responses prior to patient recovery: a case report of non-severe COVID-19. Nature Medicine (2020)
新冠病毒(SARS-CoV-2)檢測 -- qPCR 和抗體檢測（續）
有看中研院那篇的就知道，目前檢測新冠病毒的方法有三：
1. qPCR：檢測體內是否有病毒 RNA，知道 primers 就可以用來檢測，不需要另外研發，相對準確，敏感度高(sensitivity)，但需四到六小時，包含運送檢體時間等等的 turnaround time 至少要一天。不過目前 UCSF, Mammoth 和加州 Public Health 部門合作研發的 SARS-CoV-2 DETECTR 利用 CRISPR 技術似乎可以快速檢測，加上 RNA extraction 的時間只要 45 分鐘。
2. 用抗體檢測體內抗原(也就是病毒)：跟 qPCR 比起來準確度較低(需要注意有沒有 cross-reactivity)，也需要時間研發，但是檢驗方法簡單，速度也快，turnaround time 約二十分鐘到一小時。（下圖的第三種 sandwich assay）
3. 用抗原(也就是病毒蛋白)檢測體內是否有抗體：研發時間沒上面那個長，比較簡單，檢驗方法也同樣簡單和快速，但需要等到症狀出現後，病患體內產生抗體才測得到，通常是用來追蹤是否曾經感染過。（下圖的第一種 direct assay 或第二種 indirect assay）
相關文章：新冠病毒(SARS-CoV-2)的檢測 -- qPCR 和抗體
Figure / Diagram of common ELISA formats (direct vs. sandwich assays)(Thermo Fisher)
註：抗體檢測的原理跟 ELISA 相同，可以固定抗原(antigen)去測體內抗體(antibody)，如上圖的第一種和第二種，這種只要有抗原就可以測，或是固定抗體去測體內是否有抗原，如上圖中的第三種，這種比較需要花時間先去研發出好的抗體。
相關文章：簡單檢測新冠病毒抗體
Nature 的這篇介紹了幾個正在研發的抗體檢測，第一個介紹的就是中研院楊老師的那個 LFIA！和大多數用 S (spike) protein 做抗原的抗體檢測不同的是中研院用的是 N (nucleocapsid) protein，其中一株抗體和 SARS 還有其他種冠狀病毒的 spike protein 沒有 cross-reactivity。不過看了這篇才知道，中研院的抗體是用 AI 去模擬 Ag-Ab interactions 後製造出來人造抗體 libraries，然後再用 phage display 去抓出抗體，而不是用動物去製造抗體，或是從康復患者體內釣出來，因此省掉了兩個月的時間。（也就是說中研院有抗體的基因序列，可以大量生產，也許可以測試是否能用於治療，不過我覺得 anti-spike 的抗體應該會比較有效果。）
相關文章：Phage display 和小抗體製造
Figure / Schematic representation of a LFIA device (Banerjee et al, Analyst 2018; doi: 10.1039/C8AN00307F)
抗體檢測大多用 LFIA (lateral flow immunoassay) 式的快篩，原理跟 ELISA 相同，只是長得像驗孕棒 XD。如上圖的 LFIA 所示，用的是 sandwich assay，也就是把抗體固定在檢測棒上面，然後先讓(可能含有病毒)的血液和帶有染劑的抗體混合，然後讓混合後的血液和抗體流過檢測棒，如果有血液含有抗原(也就是抗原)的話，就會被固定在檢測棒的抗體抓住。另一條 control line 是抓多餘的帶有染劑的抗體，也就是確認有足夠的抗體，並且有作用。因此如果血液中有病毒的話，就會有兩條線，沒有的話就會只出現 control line 那條線。
第二個介紹的是加拿大的公司 Sona Nanotech (Halifax-based)，他們是和 GE 合作研發的 LFIA，抗原用的是 spike protein 的 S1 domain，目前預估是六到八週內可以有供研究使用的產量。
如最之前說的，檢測體內是否有對抗病毒的抗體相對簡單，只要純化出抗原就可以下去測了，德國柏林的 Pharmact 已經有二十分鐘的抗體快篩檢測，用的抗原是 N protein 和 spike protein 的 S1 和 S2 domain，可以用來檢測患者體內是否有這兩個病毒蛋白的抗體，這個快篩可以檢測到 IgM 和 IgG，IgM 是人體受感染後最先產生的抗體，之後再產生 IgG。他們和 qPCR 結果做比較，結果顯示準確度很高 -- 100% true negative 和 0% false positive，不過缺點是敏感度低，因為一開始的 IgM 反應並不高，感染後的 4 - 10 天內測到的敏感度只有 70%，但是第 11 天到第 24 天可以測到 92.5%，IgG 在這幾天測到的比例也高達 98.6%，因此整體 false negative 比例約為 13%。
關於患者體內的免疫反應可參考：武漢肺炎輕症患者體內的免疫反應
其他相關文章：關於武漢病毒(SARS-CoV-2) Cryo-EM 那篇論文的閒聊
Article:
Nature / Fast, portable tests come online to curb coronavirus pandemic (March 2020)
Papers:
JP Broughton et al, Rapid Detection of 2019 Novel Coronavirus SARS-CoV-2 Using a CRISPR-based DETECTR Lateral Flow Assay. MedRxiv (2020)
R Banerjee & A Jaiswal, Recent advances in nanoparticle-based lateral flow immunoassay as a point-of-care diagnostic tool for infectious agents and diseases. Analyst (2018)
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