未感染過新冠病毒或 SARS 的人也有對抗新冠病毒的 T cells

體內對抗病毒或細菌的免疫系統除了抗體外，還有免疫細胞們。之前說過，免疫系統有兩種，一種是第一線的先天免疫系統(innate immunity)，另一種是感染後學習得來的 adaptive immunity。簡單來說，第一線的先天免疫系統裡，負責打仗的是白血球，包括巨噬細胞(macrophage)和自然殺手細胞(natural killer cells, NK cells)等等。負責第二線 adaptive immunity 則是消滅被感染細胞的 T cells 和生產抗體的 B cells。通常感染後的 B cells 反應程度和 T cells 反應程度是相關的，有一個就有另一個，之前較多研究是著重在感染新冠病毒後，體內是否產生可以對抗的中和抗體(neutralizing antibodies)，不過最近有幾篇研究是關於 T cells 免疫反應的，有趣的發現是有的人體內測不到抗新冠病毒的抗體，但卻有抗新冠病毒的 T cells，尤其是 CD4+ (helper) T cells。

相關文章：輕症及無症狀患者帶有可對抗新冠病毒的 T cells

人類冠狀病毒有七個，除了這次的 SARS-CoV-2 和之前的 SARS, MERS，另外就是造成感冒的 OC43, HKU1, 229E 和 NL63，這些全部都會引起 T cells 反應和產生抗體，不過抗體消退的比 T cells 反應快，SARS 患者的抗體大概可維持兩、三年，不過他們的 memory T cells 在感染後至今已有十七年了仍存在於體內。之前有研究顯示抗冠狀病毒的抗體有 cross-reactivity，除了抗 spike RBD (receptor-binding domain) 的抗體比較有 specificity，由於其他蛋白在冠狀病毒中還滿 conserved，抗這些蛋白的抗體很多都有 cross-reactivity，也就是說抗其他冠狀病毒的抗體也可以辨識新冠病毒的抗體。抗體是這樣，T cells 也是這樣嗎？

前幾天發表在 Nature 的一篇研究分析了三組人的 T cells，包括有 SARS 康復患者、新冠病毒的康復患者，以及沒有感染過 SARS 和 SARS-CoV-2 或接觸過患者的個體，想知道他們體內是否有對抗新冠病毒的 T cells ，還有對病毒的哪些部分有反應，例如結構蛋白(structural protein) nucleocapsid (NP) 和非結構蛋白(non-structural proteins) NSP7 等等 [註]。

註：病毒蛋白分為兩種：structural proteins 和 non-structural (NS) proteins。Structural proteins 就是組成病毒的蛋白，例如 capsid proteins 或是 envelope proteins。NS proteins 大多是酶類蛋白，功能為調控病毒蛋白的表現居多，這篇論文裡測的 NSP7 和 NSP13 在冠狀病毒的小族群裡變化不多，SARS 和 SARS-CoV-2 的 NSP7 和 NSP13 幾乎一樣，這種通常會有 cross-reactivity。

1. 新冠病毒患者, n = 36

所有康復患者的免疫細胞(PBMC, peripheral blood mononuclear cells)對 NP 有反應，但是只有 33% 的人對 NSP7 和 NSP13 有反應。有的人的 T cells 可以對 NP 的很多片段有反應，有些 NP 片段除了可被新冠病毒患者的 T cells 辨識外，同時也可以被 SARS 康復患者的 T cells 所辨識。對病毒 NP 片段有反應的以 CD4 T cells 為主。

相關文章：新冠病毒感染者體內 T 細胞的免疫反應

2. SARS 康復患者, n = 23

SARS 已經過去十七年了，康復患者的免疫系統仍然可以對抗 SARS 嗎？這篇研究顯示，SARS 康復患者體內仍存有可以辨識 SARS NP 的免疫細胞，而且也可以辨識新冠病毒的 NP，不過對其 NSP7 和 NSP13 沒什麼反應。這是否說，新冠病毒感染患者的免疫細胞維持的時間和 SARS 康復患者的免疫細胞一樣，可以維持長達十多年後仍對病毒有反應？

3. 沒有 SARS 或新冠病毒病史和接觸史, n = 37

其中二十幾位的血液是 2019 年七月以前採樣的，十一位是抗體測試對新冠病毒的 NP 反應為陰性。分析結果顯示一半以上未感染者的 T cells 可以辨識新冠病毒的蛋白片段，不過它們辨識的片段大多和康復患者體內的 T cells 辨識的病毒片段不同，主要以 NSP7, NSP13 和 NP 為主。NSP7 和 NSP13 雖然在 SARS 和 SARS-CoV-2 間的相似度高，但是和感冒冠狀病毒 OC43, HKU1, NL63 和 229E 的相似度滿低的，那這些未感染過 SARS-CoV-1/2 個體體內的 T cells 不是因為感染過感冒冠狀病毒後習得來的，那是從哪裡得來的呢？是其他未被發現的冠狀病毒嘛？

這篇研究中也提到，雖然體內有可對抗新冠病毒的 T cells，不代表可以使個體免於感染，不過可以在感染之後就消滅它，至少不會使它演變成重症。



相關文章：新冠病毒的哪個部分最能引起免疫反應呢？

從這篇研究我們知道了什麼？

1. COVID-19 康復患者體內有可以辨識 SARS-CoV-2 的免疫細胞，而且有 cross-reactivity，也可以辨識 SARS 的病毒蛋白。

2. SARS 康復患者體內的免疫細胞可以維持十七年後仍對 SARS 蛋白有反應，並且也有 cross-reactivity，同樣對新冠病毒有反應。

3. 未感染過 SARS-CoV-1/2 或未接觸過患者的個體體內也有可以辨識新冠病毒蛋白的免疫細胞，不過辨識的蛋白和 SARS-CoV-1/2 的康復患者不同，以 NSP7 和 NSP13 為主，不像 SARS-CoV-1/2 康復患者的免疫細胞，主要辨識的是 NP。

4. 目前還不知道為什麼未感染者的體內會有可以辨識 SARS-CoV-2 蛋白的免疫細胞，只知道不是因為感染過感冒冠狀病毒後產生的。



Articles:
TN / “Common Cold” Coronaviruses Could Help Produce Anti-SARS-CoV-2 Immune Cells (July 2020)


Papers:
DM Altmann & RJ Boyton, SARS-CoV-2 T cell immunity: Specificity, function, durability, and role in protection. Science (2020)

NL Bert et al, SARS-CoV-2-specific T cell immunity in cases of COVID-19 and SARS, and uninfected controls. Nature (2020)

新冠病毒感染者體內 T 細胞的免疫反應

人類體內對抗病菌的免疫機制除了透過抗體外，還有各種免疫細胞，雖然目前關於新冠病毒的研究大多著重在抗體，但免疫 T cells 也扮演著清除病毒的重要角色。康復者到底會不會免於二次感染呢？這可能和感染後產生多少抗體、抗體維持多久，和免疫細胞反應的強度有關，感染後要能產生有效的免疫反應，才表示疫苗的研發是有意義的。最近有篇研究是關於 T cells，發現有些未受 SARS-CoV-2 感染者的體內有對抗此病毒的 T cells，很可能是因為之前感染過其他冠狀病毒產生的。

關於免疫系統裡 T cells 和 B cells 的功能，我很喜歡下面這張圖，覺得畫得很清楚。B cells 是製造抗體的，T cells 是殺死受感染的細胞，但他們兩個都要先從 APC (antigen presenting cells) 那裡取得病毒的資料，才能製造出可以辨識病毒的抗體，或是受到感染的細胞。（就像你想讓狗去找嫌疑犯，要先讓牠聞一下嫌疑犯身上的味道，然後再讓牠去搜尋一樣。）


Figure / Development of immunity (Nature News 2020; doi: 10.1038/d41586-020-01221-y)

La Jolla Institute 的研究團隊想知道病毒的哪個部分可以引發強烈的 T 細胞反應，因為這個病毒蛋白的片段可能可以用來做疫苗。他們先預測了一些可能會引起強烈 T 細胞反應的病毒蛋白片段(peptides)，其中一組是 spike protein 的片段，另一組是除了 spike proteins 之外所有 SARS-CoV-2 蛋白的片段，每個約十個氨基酸長，然後把這些片段測試在 20 位新冠病毒康復患者的血清上。這二十位康復患者都算是輕症的，有症狀但是不需要住院，血清是在症狀出現後 20 - 35 天後，完全沒症狀後採集的，有先用 ELISA 檢測過，確定他們的血清內有抗 Spike protein RBD 的抗體。他們發現所有的康復患者都有可以辨識新冠病毒 Spike protein 的 helper (CD4+) T cells，helper T cells 反應的程度和 anti-Spike IgG 量正向相關，七成的患者有針對新冠病毒的 killer (CD8+) T cells，而且 T cells 的反應非常強烈。目前很多人對患者是否對新冠病毒有免疫力有疑慮，認為病毒不見得會引起免疫反應，加上有報導說有患者再次感染，不過這個研究顯示，大多數的患者的免疫系統是對新冠病毒有反應的。

註：helper T cells 負責幫助 B cells 產生抗體，和抗體 IgG 和 IgA 量有關；killer T cells (又稱 cytotoxic T cells, CTLs) 負責清除病毒。

除此之外，這些血清內也有可以辨識新冠病毒其他蛋白的 T cells，包括 M protein 和 N protein。所有患者的血清都有針對非 Spike protein 的 helper T cells，比例上大概是 50% 的 T cells 是針對 Spike protein，50% 是針對 Spike protein 以外的病毒蛋白。

由以上結果看，我們也許不用對疫苗研發太過悲觀，新冠病毒是可以引起免疫反應的，接下來要知道的是這個免疫反應是否能使人體對病毒產生保護作用，如果可以的話，研發出成功的疫苗是有希望的。

不過，這篇研究裡的患者是有症狀的，那無症狀患者是否也有可以辨識新冠病毒的 T cells，並能產生強烈的免疫反應呢？這篇研究裡沒有檢測無症狀患者的 T cells responses，但是檢測了未受感染者的 T cell responses。

他們檢測了於 2015-2018 年採樣到、沒有感染過新冠病毒的血液檢體，結果發現其中有 40% - 60% 含有可以辨識新冠病毒的 helper T cells，不過和康復患者不同的是他們的 T cells 反應雖然也是以 Spike 為主，但幾乎沒有對 N protein 或 M protein 有反應的 T cells，次主要的是 NSPs (non-structural proteins)。而之所以會有這些 T cells，可能是因為這些人之前感染過其他種類的冠狀病毒，cross-reactivity 使他們體內也有能辨識新冠病毒的 T cells。研究者們認為這是之前感染其他四種引起感冒症狀的冠狀病毒時產生的，因為這些血液檢體裡都有針對至少其中三種常見冠狀病毒的 T cells，血清檢測也顯示全部都有 HCoV-OC43 和 HCoV-NL43 Spike protein 的 IgG 抗體，表示大多數人都感染過常見的四種感冒冠狀病毒，而且至少感染過超過三種，而這也可能是為什麼大部分的人感染到新冠病毒後都只是輕症或無症狀。

註：四種常見的冠狀病毒為 HCoV-OC43, HCoV-HKU1, HCoV-NL63 和 HCoV-229E ，前兩者為 betacoronaviruses，後兩者為 alphacoronaviruses。

相關文章：感染過冠狀病毒是否就免疫了呢？

另外，上個月有篇發表在 medRxiv 也有類似的結果，他們除了從新冠病毒康復病患的體內發現有能夠辨認 Spike protein 的 helper T cells，也從沒感染過的個體裡發現可以辨識 SARS-CoV-2 的 helper T cells。



Articles:

Science / T cells found in COVID-19 patients ‘bode well’ for long-term immunity (May 2020)

TN / Analysis of SARS-CoV-2 Immune Response Bodes Well for Vaccine Development (May 2020)


Papers:

A Grifoni et al, Targets of T cell responses to SARS-CoV-2 coronavirus in humans with COVID-19 disease and unexposed individuals. Cell (2020)

J Braun et al, Presence of SARS-CoV-2 reactive T cells in COVID-19 patients and healthy donors. medRxiv (2020)

感染過冠狀病毒是否就免疫了呢？

目前市面上有很多血清檢測的 kits，而我們最想用血清檢測回答的問題有：

1. 康復患者血清內的抗體量是多少？
2. 多少才有保護作用，使人不被二次感染？（這也算是疫苗效用的一個指標，如果抗體無法避免二次感染，那疫苗 .....？）
3. 無症狀患者、輕症患者和重症患者體內的抗體量是都一樣的嗎？是否所有感染者都能產生大量的抗體，使其不被二次感染？還是重症患者的抗體比較多？
4. 體內抗體能維持多久，有效避免二次感染的抗體量會維持多久？

上個月刊在 medRxiv 的這篇研[1]究分析了目前關於冠狀病毒的相關研究，想要試著回答上面的問題，但因為新冠病毒是這幾個月的事，所以 SARS, MERS 和其他造成感冒的冠狀病毒的研究比較多。

註：常見的、會引起感冒症狀的人類冠狀病毒有 229E (alphacoronavirus), NL63 (alphacoronavirus), OC43 (betacoronavirus), HKU1 (betacoronavirus)。

1. 造成感冒的冠狀病毒，例如 229E，康復患者體內的抗體大概可以維持一年使人不被二次感染，或是再次感染的症狀也是很輕微。

2. SARS 康復患者體內的抗體在感染後第四個月達到高峰，而且則能維持到三年左右，使其不被二次感染。（不過研究裡檢測的最後時間點是感染後第三年，所以只知道至少三年，之後就不知道了。）

3. MERS 輕症換者可在症狀發生後的半年和一年的時間點測到 IgG，重症患者的時間點也差不多。

4. 其中一篇研究[2]裡是測試冠狀病毒 229E 的康復患者是否會二次感染。當時參與研究的志願者中，只有 11% 體內沒有抗體，顯示在當時的年代(1961-1977)，這株冠狀病毒非常普及。當一年後再讓這些志願者感染這株病毒，看看抗體是否還有保護作用，發現抗體對同株的病毒有保護作用，但對相近病毒(也就是同樣是 alphacoronavirus，但是不同病毒株)只有部分的保護作用。後來有篇研究[3]顯示，如果體內抗體量不夠的話，229E 的康復患者可被二次感染。參與此研究的志願者在感染病毒一週後，IgG 開始上升，然後在十四天時達到高峰，一年後再測的時候抗體量仍然比感染前高，當再一次接受感染挑戰的時候，雖然約有一半的人被二次感染，但都沒有症狀。另外，第一次感染的時候，在前五到六天都測得到病毒，而二次感染時，只有前兩天測得到病毒，顯示病毒被清掉的很快。（不知道這是不是這次有很多無症狀患者的原因，如果血清檢測可以順便檢驗其他的 betacoronaviruses 的話可能可以知道。）

5. 有些冠狀病毒抗體有 cross-reactivity，像是 229E 的抗體可以使患者約一年不被同種的冠狀感染，例如同是 alphacoronavirus 的 NL63。


Figure / Quantitative and binary readouts in serology assays. (Krammer & Simon, Science 2020)

雖說目前有很多血清抗體檢測，但是要知道新冠病毒的康復患者是否能夠避免二次感染，需要可以測量體內抗體量的檢測，而這需要做 ELISA，比較耗時也比較耗人力，需要在實驗室執行。LFA 之類的快篩只能知道有或沒有，而且需要夠高的 sensitivity 和 specificity，才不會有太多的 false positive 或 false negative，主要是用來了解病毒感染的盛行率(sero-pervalence)。



Article:

Science / Serology assays to manage COVID-19 (May 2020)


References:

1. AT Huang et al, A systematic review of antibody mediated immunity to coronaviruses: antibody kinetics, correlates of protection, and association of antibody responses with severity of disease. medRxiv (2020)

2. SE Reed, The behaviour of recent isolates of human respiratory coronavirus in vitro and in volunteers: evidence of heterogeneity among 229E-related strains. J Med Virology (1984)

3. KA Callow et al, The time course of the immune response to experimental coronavirus infection of man. Epidemiology & Infection (1990)

從駱馬體內得到的新冠病毒小抗體

哎呀呀，已經有人做了啊。這篇的研究團隊是之前做 Spike protein Cyro-EM 的那個，原來他們也有做駱馬(llama)的小抗體研究啊。

相關文章：關於武漢病毒(SARS-CoV-2) Cryo-EM 那篇論文的閒聊

如果有看過我之前關於小抗體那篇的，就知道駱馬和鯊魚除了有普通的 IgG 之外，還有一種只有 heavy chain 的小抗體 HCAbs (heavy chain antibodies)，如果只取它的 Fv (variable region)，體積會更小，稱為 VHH 或是 nanobodies (Nbs)。這種小抗體要顧慮的地方比傳統 IgG 要少一些，例如不用考慮是否醣化(glycosylation)，加上也較容易生產製造，所以近來也引起關注，可望作為另一種型態的抗體藥。

相關文章：關於抗體和抗體藥的一些小知識

根據文中所述，他們自 2016 年起就用駱馬研發對抗 SARS 和 MARS 的小抗體。駱馬被先後打入 SARS 和 MERS 的 Spike protein 後體內會產上對抗 Spike protein 的抗體，他們在打入抗原的六週後取出駱馬的淋巴球，然後再用噬菌體展示(phage display)從中釣出可以和 Spike protein 結合的小抗體。他們從從駱馬淋巴球裡抓到七個 MERS 的小抗體和五個 SARS 的小抗體，得到了小抗體的基因序列後，便在酵母菌裡大量表現，然在再用 ELISA 確認它是否真的能夠和病毒結合。經過試驗發現其中一個 VHH 可以中和 SARS，為 VHH-72，並且和 MERS 的 S protein 沒有 cross-reactivity。

註 1：抗原(antigen)對免疫系統來講就是外來物，因此可以是病毒或細菌，免疫系統在外來物入侵後即會產生抗體(antibody)對抗外來物。

註 2：一隻駱馬可以被打入五種抗原，之後在用 phage display 把分別的小抗體釣出來，想更瞭解細節的可參考之前的《 Phage display 和小抗體製造 》這篇。

接著，他們想測試這些 VHH 是否可以抑制病毒，於是他們改造了基改過無害的 lentivirus VSV，讓它們在表面表現 S protein，假裝是 SARS，然後看看這些假 SARS 病毒是否能夠進入細胞，結果顯示和假 SARS 或假 MERS 結合力很強的 VHH 可以抑制病毒，結合力若的則沒有抑制的效果，其中以 VHH-72 的效果最好，9 nM 就可以達到抑制的效果。另外，VHH-72 雖然和 SARS S protein RBD 的結合力很強，但是 ELISA 的結果顯示它對 SARS S protein NTD (N-terminal domain) 沒有反應，表示 VHH-72 是透過和 RBD 結合來抑制病毒。

這個研究裡我比較訝異的是他們也分析了小抗體和病毒結合的 crystal structure，發現 VHH 抑制病毒的機制應該是把 Spike 的 RBD 固定在某個 conformation，使它不能動。VHH-72 是透過其 CDR2 和 CDR3 和病毒結合，但結合點和 ACE2 似乎不同，和 ACE2 競爭的不是 CDR2 或 CDR3，而是比較遠的 FR (framework region)。


Figure / The Crystal Structure of SARS VHH-72 Bound to the SARS-CoV-1 RBD (Wrapp et al, Cell 2020)

因為新冠病毒的 Spike protein 和 SARS 的很像，所以他們想知道 VHH-72 是否也可以抑制 SARS-CoV-2 的感染。他們發現 VHH-72 也會和新冠病毒的 S protein RBD 結合，但是 binding affinity 比較低。他們的 crystal structure 分析結果顯示 VHH-72 是和 SARS S RBD 的 R426 接合，而這個氨基酸在 SARS-CoV-2 則是 N439，這可能是造成 binding affinity 的原因。為了增強 binding affinity，他們試了兩種方法：一是用 (GGGS)3 linker 把兩個 VHH-72 尾接頭的連在一起(VHH-72-VHH-72)，一是在它後面接一個 IgG Fc (VHH-72-Fc)。ELISA 測試的結果顯示，這兩種都會會 SARS S 和 SARS-CoV-2 S 結合，並且細胞實驗顯示 VHH-72-Fc 可以抑制假 SARS 和假 SARS-CoV-2。

有意思的是 VHH-72 在病毒 S protein 的結合點似乎和之前發表過的抗體不同，倒是和 CR3022 類似，不過 CR3022 並無法抑制 SARS-CoV-2。

相關文章：近期和新冠病毒抗體相關的研究

哦，另外還有一個重要的點，就是這個小抗體可以在動物細胞裡大量表現，別以為這沒什麼，你如果遇過那種在三種細菌株裡都表現不出來，要不就表現出來但是不 soluble 的 VHH 就知道苦了。（現在每天都在和 phage display 還有 VHH 奮戰的苦主 QQ）

其實這篇研究的另一半是 MERS 和它的 VHH，有興趣的人可以看看。



Article:

UT NEWS / Antibodies from Llamas Could Help in Fight Against COVID-19 (Apr 2020)

TN / Llama Antibodies Could Help Fight Against COVID-19 (May 2020)


Paper:

Wrapp et al, Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-Domain Camelid Antibodies. Cell (2020)

近期和新冠病毒抗體相關的研究

可能現在大家都知道 SARS 和 SARS-CoV-2 都是利用自身的 spike protein (S protein) 和人類細胞表面的 ACE2 結合而進入細胞的，因此阻斷 S protein 和 ACE2 的結合變成目前藥物研發的主要標靶，最近好幾篇研究都是關於用抗體去達到這個目的。

SARS-CoV-2 S protein 位於病毒的表面，是個醣化蛋白(glycoprotein)，會三個組成一體(trimer)。S protein 本身又大致分成三個 domains: N-terminal S1, S2 & C-terminal TM (transmembrane) domain，S1 和 S2 之間有個 furin cleavage site，S1 裡包含了 RBD (receptor-binding domain)，負責和 ACE2 結合，結合了之後 S1/S2 會被切開露出 S2，CoVs 的 S2 會進一步在 S2' site 再切割一次，這個切割會露出 S2 的 fusion peptide，可以讓病毒和細胞膜結合，使其進入細胞內。


Figure / Structure of 2019-nCoV S in the prefusion conformation (Wrapp et al, Science 2020)

Walls et al 發表在 Cell 的研究顯示 SARS-CoV-2 和 ACE 結合的 affinity 和 SARS 的差不多，他們也發現和 SARS不同的是 SARS-CoV-2 有個 furin cleavage site，SARS 的是一個 arginine (R)，SARS-CoV-2 則是 RRAR。SARS S protein 的 S1/S2 cleavage site 可以被細胞內蛋白酶 CatB/L (cathepsins B/L, cysteine protease) 和 TMPRESS2 (serine protease) 切割， 因此 Hoffmann et al 他們也測試了這兩個蛋白酶，看看他們是否也能切割 SARS-CoV-2 的 S protein，結果顯示除了 furin protease，SARS-CoV-2 也用 TMPRSS2，CatB/L 則是可有可無。另外，臨床使用的 serine protease inhibitor camostate mysylate，同時也是 TMPRSS2 inhibitor，也顯示可以抑制 SARS-CoV-2 進入細胞。如果和 CatB/L inhibitor E-64d 一起使用，則可以完全阻止病毒感染，在沒有 TMPRSS2 的情況下，SARS-CoV-2 也可以用 CatB/L。

Hoffmann et al 除了發現 SARS 和 SARS-CoV-2 都是透過 ACE2 進入細胞，而且帶有 ACE2 抗體的血清可以阻止這兩個病毒進入細胞外，也發現從 SARS 康復患者體內取出 anti-SARS 的抗體是 anti-S antibodies。他們取了三位 SARS 康復患者的血清測試，發現可以降低 SARS-CoV-2 感染，雖然效用比 SARS 較低。不過，他們把 SARS S1 打入兔子體內後產生的抗體可以有效抑制 SARS 和 SARS-CoV-2 感染細胞。另外，Walls et al 他們的結構研究顯示 SARS 和 SARS-CoV-2 的 S proteins 非常相似，SARS 的抗體很可能會和 SARS-CoV-2 有 cross-reactivity 而可以也抑制 SARS-CoV-2，於是他們把 SARS- S 打入老鼠體內，然後測試其產生的抗體是否能抑制 SARS-CoV-2，結果發現可以。由以上看來，對抗 SARS 的抗體或是疫苗可能對現在的 SARS-CoV-2 也多少有某種程度的效用。

不過，有趣的是之前 Cryo-EM 的那篇試了三個 SARS 的 anti-S RBD 的抗體(S230, m396, 80R)，想說竟然結構那麼像，不知道有沒有 cross-reactivity，沒想到那三個抗體都無法辨識 SARS-CoV-2。這個結果和 Walls et al 還有 Hoffmann et al 的不同的原因可能是因為這兩篇的研究產生的 polyclonal antibodies 可能抓到的是 S protein 的 S2 domain，而這篇用的是 anti-RBD (S1) antibodies。

相關文章：關於武漢病毒(SARS-CoV-2) Cryo-EM 那篇論文的閒聊

這個月，Scripps Research 的團隊在 Science 發表了 SARS 抗體和 SARS-CoV-2 結合的研究，他們發現 SARS 和新冠病毒和抗體的結合點幾乎一樣，也許是為什麼 SARS 抗體和 SARS-CoV-2 會有 cross-reactivity 的原因。他們研究的一個 SARS 的抗體 CR3022 是荷蘭的一家藥廠 Crucell Holland B.V. 於 2016 年從 SARS 康復患者體內釣出的，年初的時候有研究發現 CR3022 和新冠病毒有 cross-reactivity，於是 Scripps Dr. Wilson 的研究團段想知道這個抗體是怎麼和 SARS-CoV-2 結合的，結果發現這個抗體和 SARS 及 SARS-CoV-2 S protein RBD 結合的點非常相似。有趣的是病毒和 CR3022 的這個結合點和它和 ACE2 的結合點有些距離，因此不存在競爭的關係。另外，這個結合點在平常的狀態並不在病毒的表面，而是當 RBD 處於某種狀態下才會出現在表面的地方。在細胞實驗中，CR3022 雖然可中和 SARS，但卻無法中和 SARS-CoV-2。因為有太多迷點，所以目前還不了解和 CR3022 的這個結合點在病毒感染的真正功能是什麼，不過至少知道這個抗體是用不同的機制來抑制病毒感染。



Articles:

TN / Clues to SARS-CoV-2 Vulnerability Emerge (April 2020)


Publications:

AC Walls et al, Structure, Function, and Antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein. Cell (2020)

M Hoffmann et al, SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell (2020)

M Yuan et al, A highly conserved cryptic epitope in the receptor-binding domains of SARS-CoV-2 and SARS-CoV. Science (2020)

D Wrapp et al, Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science (2020)

UBC 研發的藥物將進入臨床試驗 -- soluble hrsACE2

前兩天 Cell 刊登了之前 UBC 研發用來治療 COVID-19 的藥物 [1]，這個研究有多個團隊參與，包括了溫哥華的生技公司 STEMCELL Techonologies。他們研發的藥物 APN01 (human recombinant soluble angiotensin-converting enzyme 2; hrsACE2) 很快便會進入臨床試驗，由歐洲的生技公司 Apeiron Biologics 進行。


這個研究團段已經研究 SARS 很久了，在之前的研究中，知道了：

1. SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都是透過 spike protein 的 RBD (receptor-binding domain) 和人類的 ACE2 結合而進入細胞 [2]。
2. SARS-CoV-2 和 ACE2 的 affinity 比 SARS 強
3. 老鼠實驗中，大量表現 ACE2 的基轉老鼠在感染 SARS 後的病況比較嚴重 [2]。
4. ACE2 除了表現在肺部的表皮細胞，也表現在心臟、腎臟、血管和腸胃細胞，這可能是為什麼有些病患有腸胃道等等的症狀 [1]。
5. 之前的細胞實驗顯示 protease inhibitor camostat mesylate 可以抑制 SARS-CoV-2 的繁殖
6. hrsACE2 已在 2017 年時進入第一、二期的臨床試驗，原本是要用來治療 ARDS (acute respiratory distress syndrome, 急性呼吸窘迫症候群) [3]。


Figure / Possible intervention of SARS-CoV-2 replication (Science 2020, doi:10.1126/science.abb8497)

說是藥物，其實 hrsACE2 就是合成的人類 ACE2，他們的想法是既然 SARS-CoV-2 是透過 ACE2 進入細胞的，那他們就把大量的合成 ACE2 打入體內，使他們和病毒結合，當病毒表面的 RBD 都被合成的 ACE2 塞滿之後，就沒辦法再和細胞表面的 ACE2 結合了，進而達到抑制病毒感染的效果，跟抗體藥類似的概念。

在他們的細胞實驗中，hrsACE2 可以有效的中合病毒，使其無法接觸 ACE2 和進入細胞，但是老鼠的 mrsACE2 便沒有抑制的效果。然後他們試驗在基改的小血管和腎臟，受到 SARS-CoV-2 感染的基改器官在感染的三到六天後都可以檢測到病毒，而加惹 hrsACE2 後則明顯地降低了病毒感染；同樣的，老鼠的 mrsACE2 則沒有抑制 SARS-CoV-2 感染的效果。

要注意的是：
1. hrsACE2 跟其他的抗體一樣，無法完全抑制病毒感染，抑制效果和劑量相關，但也不排除有除了 ACE2 之外的 co-receptor 的可能。
2. hrsACE2 主要是抑制病毒進入細胞，如果病毒已進入細胞，hrsACE2 就沒有太大作用。
3. 這個實驗著重在血管和腎臟細胞，但 SARS-CoV-2 感染的主要器官是肺部。



Articles:

UBC News / Trial drug can significantly block early stages of COVID-19 in engineered human tissues

Science / WHO launches global megatrial of the four most promising coronavirus treatments (March 2020)


Publication:

1. V Monteil et al, Inhibition of SARS-CoV-2 infections in engineered human tissues using clinical-grade soluble human ACE2. Cell (2020)

2. K Kuba et al, A crucial role of angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) in SARS coronavirus-induced lung injury. Nature Medicine (2005)

3. Y Imai et al, Angiotensin-converting enzyme 2 protects from severe acute lung failure. Nature (2005)

新冠病毒(SARS-CoV-2)的檢測 -- qPCR 和抗體

目前的檢測都是以用 qPCR 檢測病患體內是否有武漢病毒的 RNA，這個方法的問題是耗時耗力，尤其是 RNA extraction 相對來講比 DNA 困難不少，是個瓶頸。另外，復原的患者裡沒有病毒後就測不到 RNA，只能針對目前正被感染的患者，而非康復後的患者，如果患者康復了，那感染的源頭或是中介者就斷了。

目前用 qPCR 檢測的目標基因是 N gene, E gene 和 RdRp gene，它們轉譯後的蛋白為 nucleoprotein (N protein), envelope protein (E protein) 和 RdRp (RNA-dependent RNA polymerase)。

關於這個病毒的 background info 請參考這篇：關於武漢病毒(SARS-CoV-2) Cryo-EM 那篇論文的閒聊


Figure / SARS genome (ViralZone 2020)

之前 BC CDC (BC 省疾管局)內部的 seminar 裡有提到他們檢測的流程為先用 qPCR 檢測是否有 RdRP 和 E gene (~24hrs)，再檢測是否有 N gene (2hrs)，然後送定序 RdRP (8-16 hrs)，都顯示 positive 後最後送 National Microbiology Lab (NML) 確認(24-48hrs)。後來我在 CDC 工作的朋友說，現在已經不用送 NML，BC CDC 檢測為陽性就直接公佈了，所以 24 小時內就可以知道結果。(註：NML 為加拿大唯一的 P4 Lab，位於 Winnipeg, Manitoba。)


Figure / The 2019-nCoV Novel Coronavirus – what we know and what we’re finding out (BC CDC)

除了檢測病患的病毒 RNA，另一個方法就是測體內的抗體，感染病患在免疫系統正常的情況下，身體會製造對抗病毒的抗體，因此即使患者復原了，也可以透過檢測體內的抗體得知其是否曾經感染過病毒，例如浙江台商，另外用抗體檢測也比較省時省力。

新加坡大學 NUS 和美國 Duke University 合作抗體檢測，並在這週二發表了他們的成果。新加坡在一月時發生了兩起教會的群聚感染，一月 29 號的時候有位年輕男士感到身體不適，但找不到感源。另一個教會則是在一月 19 號的時候有位來自武漢的訪者，後來往回追接觸史的時候發現，年輕男士在一月 25 號的農曆年慶祝活動裡，同時參加活動的一對夫妻曾經接觸過那位武漢訪者。那對夫妻在一月 25 的時候出現症狀而去醫院，但因為症狀輕微並沒被診斷為武漢肺炎。發現了年輕男士和這對夫妻的連結後，這對夫妻在二月 18 號送去 CDC 檢測，不過那時那對夫妻已經康復了，檢測人員認為可能測不到病毒的 RNA，於是除了用 qPCR 檢測外，同時也做了抗體測試。沒想到，先生的 RNA 檢測為陽性，於是隔天被送醫隔離，而太太的檢測則是陰性，不過數日後的抗體檢測結果顯示夫妻兩人皆為陽性，表示兩人體內皆有武漢病毒的抗體，太太也曾經感染過病毒。

他們從康復患者的血液檢體裡發現到辨識病毒 S 蛋白(spike protein)的抗體，而這些抗體在實驗室中顯示可以阻止病毒殺死細胞。同時，他們合成的病毒蛋白也可以被患者血裡的抗體偵測到。不過，用抗體檢測需要注意它的 specificity，因為武漢病毒和 SARS 的蛋白很像，可能會出現 cross-reactivity 的問題(也就是抗體同時可以檢測到 SARS 和武漢病毒的蛋白)，所以必須要確定檢測的抗體只會辨識武漢病毒的蛋白，而新加坡和杜克大學研發的抗體測試可以分辨兩個病毒的蛋白，也就是只會對武漢病毒的蛋白有反應。

看到這裡可能會覺得很熟悉，沒錯，中研院之前也公佈過他們可以在浙江台商的血裡測到武漢病毒的蛋白，不過他們測的是 N 蛋白(nucleoprotein)。


【 名字改來改去，武漢病毒到底叫什麼？】

病毒和其引起的疾病命名方式分為三個等級：(ICTV - Naming the 2019 Coronavirus)

1. 疾病名(disease name)：由 WHO 病名，例如這次的武漢肺炎被 WHO 命名為 COVID-19 (Coronavirus Disease 2019)

2. 病毒名(virus)：由病毒學家命名，例如這次的武漢病毒是由 ICTV 裡的冠狀病毒學家命名為 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)。

3. 病毒分類(species)：由 ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses) 將病毒分類，跟動物的界門綱目科屬種一樣，病毒也由大至小分成 family (名字尾巴是 -dae), subfamily (名字尾巴是 -nae), genus (名字尾巴是 -virus) 和 species (可能前面加個宿主名，例如 canine, porcine 等等的，或是後面加個 type 1, type 2 之類的)，另如這次的冠狀病毒就是 Coronaviridae (family) - Orthocoronavirinae (subfamily) -Betacoronavirus (genus) - Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus (species)。

ICTV 發表的命名武漢病毒的 papers：

AE Gorbalenya et al, Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: The species and its viruses – a statement of the Coronavirus Study Group. bioRxiv (2020)

Coronaviridae Study Group of the ICTV, The species Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2. Nature Microbiology (2020)


Article:

Science / Singapore claims first use of antibody test to track coronavirus infections (Feb 2020)

關於武漢病毒(SARS-CoV-2) Cryo-EM 那篇論文的閒聊

應該有人已經看過這篇論文了，是武漢病毒(SARS-CoV-2)的 cryo-EM，沒想到這麼快就做出來了。

簡單介紹一下這個病毒的 background：

1. enveloped, (+)RNA viruses：病毒的特點就是自帶基因和蛋白很少，都是用宿主細胞的，越小的病毒越是如此。（就像是平常住外面、兩三個禮拜回家一次的人，回去不用帶太多東西，因為可以用家裡的，可能只要帶牙刷、手機和錢包回去就好惹。XD）

2. 大部分病毒的主要自帶基因分為兩種：structural 和 non-structural (NS)。Structural 是組成病毒實體的蛋白，例如 envelope proteins 和 capsid proteins。Non-structural 則是負責病毒複製，例如 transcription factors (TFs) 或是 RNA polymerase (RdRp)。武漢病毒主要的自帶基因有 spike protein (S protein, 屬於 envelope protein), nucleoprotein (N protein), RNA polymerase。同一個家族的病毒通常自帶的基因都差不多，例如武漢病毒和 SARS 都自帶 spike protein 和 N protein。


Figure / Betacoronavirus virion (ViralZone 2020)

3. 武漢病毒和 SARS 的 spike protein 相似度為 86%，和蝙蝠冠狀病毒 RaTG13 的相似度則高達 98%，主要的差異是武漢病毒有一段 "RRAR" furin recognition site，而蝙蝠 RaTG13 和 SARS 的 protease cleavage site 則是只有一個 arginine (R)，在流感病毒裡，其 hemagglutinin protein 帶有 furin binding site 的通常是毒性比較強的病毒株。除此之外，武漢病毒和 RaTG13 S protein 的 RBD 有十七個氨基酸不同。

4. 跟 SARS-CoV 屬於同樣的 species，進入宿主細胞的機制也差不多，是經由它表面的 spike protein 結合宿主細胞的 ACE2 (angiotensin-converting enzyme 2)。

5. Spike protein 是個 glycoprotein，也就是說它會被醣化(glycosylated)。通常 envelope viruses 的表面蛋白(envelope protein)是 glycoprotein。S protein 的結構主要分為幾個 domains：SS (signal sequence), NTD (N-terminal domain), RBD (receptor-binding domain), SD1/2 (subdomain 1, 2), TM (transmembrane domain) 和 CT (C-terminal tail) 等等其他一些小的 domains。三個 S proteins 會結合在一起形成一個 trimer，然後和 ACE2 接合以進入宿主細胞，負責和 ACE2 結合的為 RBD。

我朋友是做 protein binding 研究的，看到這篇的重點是 SARS 和 SARS-CoV-2 的 spike protein 結構非常像，但是抗體竟然沒有 cross reactivity，幾個已發表的 SARS-CoV RBD-specific 抗體都對 SARS-CoV-2 沒反應。而我純化蛋白做太多了，看到的重點都是怎麼純化這個蛋白。XD

1. 竟然可以從 293 cells 純化到 0.5mg/L 的蛋白。
2. 純化它的 ectodomain (1-1208)就夠研究和 ACE2 的 binding。
3. 純化它的 ectodomain 只要過兩個 columns：affinity + SEC，而且在 SEC 是只有一個 670kDa 的 single peak。


* RaTG13 spike protein: QHR63300.2
* SARS-CoV spike protein: NP_828851.1
* SARS-CoV-2 spike protein: QHD43416.1



原論文：

D Wrapp et al, Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science (2020)

關於謠言 | 武漢病毒的源頭到底是哪裡？

之前盲眼的尼安德塔石器匠已經寫過了，這篇只是我自己的整理。


Figure / Coronavirus virion (Scientific Animation)

1.
美國 University of North Carolina 於 2015 年十一月，發表了一篇關於 SARS 的研究在 Nature Medicine，說明 SARS 是依靠它的表面蛋白 SHC014 從動物身上傳染到人類身上的。SARS 和 MERS 原本是寄生在其他動物身上的，是怎麼跨物種傳染到人類身上呢？研究顯示中國蝙蝠帶的類 SARS 病毒 RsSHC014-CoV 和人類 SARS 病毒的 SCH014 序列很相似，但是有 15 個氨基酸不同，而這些不同決定 SCH014 是否能和人類的血管酵素(angiotensin converting enzyme II, ACE2)結合。他們把可以感染老鼠的 SARS-CoV 病毒改成可以表現蝙蝠冠狀病毒的表面蛋白 SHC014，結果顯示這個基改冠狀病毒可以和人類的血管收縮轉化酶(angiotensin converting enzyme II, ACE2)結合，並且可以有效的在人類呼吸道細胞中複製繁殖，顯示蝙蝠冠狀病毒很可能透過 SHC014 突變而傳染到人類身上。這篇研究出來以後引發許多討論，認為這類研究太危險，要是基改後的病毒不小心外洩可能會造成很大的問題。NIH 其實在 2013 年就決定停止給這類危險病毒的相關研究 funding，會給這個研究 funding 是因為可以幫助科學家們了解 SARS 的傳染機制，同時這個研究也在法令公佈之前就開始了。

2.
2017 年的時候，Nature 發了一篇關於中國蓋 BSL-4 實驗室的文章，最近被拿出來討論，因為網傳說這次的武漢病毒和其 BSL-4 lab 有關。中國在 2003 年的時候決定在武漢蓋第一個 BSL-4 級的實驗室，但因為種種因素，直到 2014 年年底才完成。實驗室有分四個等級，普通大學裡的只到 BSL-2，如果研究有用到癌症細胞或是人類病毒之類的，需要 BSL-2，通常做研究的都會用到，會有一個專屬的負壓細胞培養小房間。BSL-4 是最高等級，加拿大只有一個，就是 Winnepeg 的那個 National Microbiology Laboratory，會用到這個等級實驗室的有伊波拉病毒和 SARS。

武漢實驗室蓋完開始用之後，引來了一些質疑，像是中國是否可以 use it properly，尤其在他們官僚文化嚴重的情況下，是否會遵守只用規則。除此之外，中國還在哈爾濱、北京和昆明還再蓋共三個 BSL-4 lab，這也讓人質疑，中國是否需要那麼多個 BSL-4 lab，尤其是北京的 BSL-4 lab 曾外洩 SARS 多次。

3.
最近病毒分析結果認為和武漢病毒最相近的是雲南蝙蝠帶有的 RaTG13，而這株病毒為武漢病毒所擁有，上週武漢病毒所的石正麗發表在 Nature 的研究顯示武漢病毒和 RaTG12 的相似度為 96.2%，和 SARS 則只有 79.5%。另外，Nature Medicine 那篇基改 SARS 的研究石正麗也有參與，於是謠言四起，2017 年的那篇文章[2]因此最近在前面加了這段表示謠言未經證實，科學家們認為來源為那個市場："Editors’ note, January 2020: Many stories have promoted an unverified theory that the Wuhan lab discussed in this article played a role in the coronavirus outbreak that began in December 2019. Nature knows of no evidence that this is true; scientists believe the most likely source of the coronavirus to be an animal market."



News:

The Scientist / Lab-Made Coronavirus Triggers Debate (2015)

Nature / Inside the Chinese lab poised to study world's most dangerous pathogens

Science / Mining coronavirus genomes for clues to the outbreak’s origins (2020)


Publication:

VD Menachery et al, A SARS-like cluster of circulating bat coronaviruses shows potential for human emergence. Nature Medicine (2015)

P Zhou et al, A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature (2020)