又一篇新冠病毒的小抗體研究

這集的標題雖然是駱馬的小抗體(nanobodies)，但前半個小時是討論中國的 CoronaVac，同時他們也收到很多 email 詢問為什麼美國不也做 inactivated virus vaccine。



第一個用病毒做的疫苗是 Edward Jenner 的天花疫苗(smallpox, 1798)，為 inactivated Vaccinia virus。第二個 Pasteur 的狂犬病疫苗(rabies, 1885)，再來是黃熱症疫苗(yellow fever, 1935)和流感疫苗(influenza, 1936) [1]，流感疫苗剛開始是給軍方用，因為在第一次世界大戰時美軍人力因流感而有所損失 [2]。

至於為什麼美國不用病毒做新冠病毒的疫苗呢？他們解釋是美國已經研發其他種類的疫苗很久了，包括 mRNA 疫苗和 subunit 疫苗，所以可以直接拿來用，加上大藥廠已經砸很多錢在研發新型疫苗，因此拿來研發新冠病毒疫苗相對來講反而是比較簡單的。另一個可能原因是用病毒做疫苗需要用到 BSL3 的實驗室，不方便大量生產。

關於中國的 CoronaVac，他們提到 inactivated virus vaccine 通常是用 UV 或福馬林(formalin)去 inactivate viruses，但中國的這支疫苗是用 β-propiolactone (C3H4O2)，雖然它也被用來 inactivate viruses，不過它會和蛋白質反應，可能會改變蛋白結構，而且最近有幾篇研究顯示 β-propiolactone 會使 Spike 的 S1 脫離 [3, 4]，而可讓免疫系統產生中和抗體的 RBD 就在 S1，如果新冠病毒疫苗少惹 S1，那疫苗效用還剩多少？另外，如果要做 inactivated viruses，也會先評估用來 inactivate 的物質會不會改變病毒結構，是否每個 batch 的品質都穩定一致。之前的疫苗之所以用 inactivated viruses，是因為當時那個年代的技術就只能用 inactivated viruses，並不是因為它比較安全，如今的科技使疫苗不再局限於用 inactivated viruses。

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裡面還有一段對話滿好笑的(30:25)，CoronaVac 的臨床實驗是 Phase I/II 合在一起，通常是 Phase I 安全測試過了以後，換一批測試者做 Phase II。SinoVac 是一二期一起做，第一期只有七天，七天後如果沒出現問題就進入 Phase II [5]。然後其中一位就說，因為是用 inactivated viruses，如果真的有問題的話，七天後試驗者可能就掰掰了，既然七天後沒人死，就表示疫苗算是安全的。XD

(33:50) "... that the Chinese government enlisted army personnel for at least one of the phases for their trial and I thought we were critical of that for a while, but I think that's no longer a criticism."

".... yeah, we got a lot of pushback from people in China who said this is often done and it is often done, but they said it was licensed and it was actually a Phase II trial, so they should have just said it's a Phase III trial, right? instead of saying it was licensed for you."

"I think the issue there was is it okay to do that in troops, ..... I think I pointed out the U.S. can't exactly get on a moral high horse about what's been done."

還有一段莫名戳中我的笑點，是討論到 Phase III 是在中國、巴西和土耳其做的，最近還加了印尼。

(44:10) "I don't think they had enough cases in China to do the Phase III, right?"

"I think because at that point the pandemic was really under control such through lockdowns in China, they were actually having a hard time getting cases for their clinical trials, but uhh unfortunately, plenty of other countries had plenty of cases."

之後駱馬小抗體的部分是討論德國研究團隊於上個月發表在 Science 的研究。之前有提過駱馬除了正常的 IgG，還有一種只有 heavy chain 的抗體 HCAb，以及釣出小抗體的噬菌體展示(phage display)。

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在這篇之前，德州大學(U Texas)也在去年發表過他們抗 SARS 的小抗體，他們是把 SARS Spike 打入駱馬體內，然後釣出小抗體，經過 cyro-EM 分析發現效果最好的小抗體 VHH-72 是把 Spike RBD 固定在某個 conformation，使它無法動。他們把這個小抗體測試在假新冠病毒上(pseudovirus)，發現它也可以抑制新冠病毒。

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德國的這個研究則是把新冠病毒的 Spike RBD 和用福馬林去活性過的新冠病毒打入駱馬後釣出小抗體，然後測試這些小抗體的中和效用(neutralizing activity)，發現其中一株中和效果最強的小抗體 VHH E 的 IC50 可到 60 nM [6]。VHH E 和其他小抗體不太一樣，它的 CDR3 特別長，雖然和 ACE2 結合的點和之前發現的小抗體 CC12.3 和 H11-D4 相同，但方向不一樣。之前研究發現，Spike RBD trimer 通常處在一個 up & down conformation 平衡的一個狀態，較常發生的狀態是沒有或三個中只有一個 RBD 處於 up conformation。雖然三個 RBD 都為 up conformation 的狀態很少見，但只有 up conformation 才可以和 ACE2 結合，只是不知道需要幾個 RBD 為 up conformation。

他們用 cryo-EM 分析 VHH E 和 ACE2 結合的狀態，發現和 VHH E 結合的大多是三個 RBD 都為 up conformation，並且各和一個 VHH E 結合，顯示 VHH E 會把 RBD 固定在 3-up conformation，而且一旦結合，RBD 就無法變回 down conformation。不免俗的，也要試試把兩、三個 VHH 連在一起看看效果會不會更好，當然也是用常用的 (GGGS)3 linker，結果發現 IC50 可以降到 pM range (930 pM for VHH EE, 520 pM for VHH EEE)。這篇研究和其他不同的地方是他們還有測試哪些突變會逃過 VHH 的中和作用，有趣的是如果某個突變可以逃過某個 VHH，大多的情況是它會對其他 VHH 更敏感，所以如果把兩個不同的 VHH 結合在一起，便沒有突變可以逃過 VHH。相反的，雖然 VHH EEE 有很強的中和作用，single mutantion 就可以讓病毒逃掉。



References:

1. S Plotkin, History of vaccination. PNAS (2014)

2. US CDC / Influenza Historic Timeline

3. Y Cai et al, Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science (2020)

4. AV Letarov et al, Free SARS-CoV-2 Spike Protein S1 Particles May Play a Role in the Pathogenesis of COVID-19 Infection. Biochemistry (2020)

5. Z Wu et al, Safety, tolerability, and immunogenicity of an inactivated SARS-CoV-2 vaccine (CoronaVac) in healthy adults aged 60 years and older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1/2 clinical trial. The Lancet (2021)

6. P Koenig et al, Structure-guided multivalent nanobodies block SARS-CoV-2 infection and suppress mutational escape. Science (2021)

用基改益生菌治療 C. difficle 感染

之前有介紹過，量產抗體有幾個選項，可以用動物細胞，可以用大腸桿菌，也可以用酵母，另外還有一種是雞蛋(IgY)。

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這篇研究用的是酵母菌，把基改後可以生產抗體的酵母菌吃下去，讓它在體內製造抗體來對抗 Clostridioides difficile (困難梭狀桿菌)感染。困難梭狀桿菌感染(Clostridioides difficile infection, CDI)通常發生在老年人，尤其是有在服用治療其他感染的抗生素的，抗生素會殺掉很多細菌，包括好的腸道菌，使它們無法對抗 C. difficile，雖然針對 C. difficile 的抗生素大多有效，但有時候會反覆感染，最後造成死亡。

 

Figure / Clostridioides difficile Infection (US CDC)

除了用抗生素治療，另一種就抗體治療，普通的做法是大量生產、純化抗體後，然後靜脈注射至血管內，經由血液進到腸胃道，中和困難梭狀桿菌產生的毒素。這篇研究的團隊，想說與其要經過層層運輸，不如基改益生菌，讓它可以生產抗體，吃下去後直接進入腸胃道，不是更方便？而且如果可以讓益生菌(probiotics)在體內生產抗體，還省掉了純化抗體需要的時間和金錢。

目前用來生產抗體的酵母菌以 Saccharomyces 和 Pichia 為主，Saccharomyces 是 baker's yeast，Pichia 則是 brewer's yeast，比較常用來大量生產蛋白。S. cerevisiae 可能大家比較常用，通常做 yeast 2-hybrid 就是用這株，這篇研究用的是 Saccharomyce boulardii。關於 S. boulardii 的研究不多，不過它和 S. cerevisiae 是同種，照理說基改後應該也可以生產抗體，中和困難梭狀桿菌的毒素 TcdA, TcdB。

這篇研究用來中和 TcdA, TcdB 的是小抗體 VHH，他們把四個可以中和 TcdA, TcdB 的 VHH 接在一起，之間用 GSSS linker 接在一起成為 ABAB，然後測試它們的中和效力，並且和 Merck 的抗體藥 actoxumab & bezlotoxumab 相比，老鼠實驗(腹腔注射)的結果顯示，效果比 Merck 的抗體藥好一千倍，接下來要解決的就是怎麼把 VHH 用非注射的方式送到腸胃道。研究團隊選擇用益生菌，在益生菌中選擇用 S. boulardii，原因有幾個：安全性已知道，也有治療 CDI 的基本效用，並可和抗生素一起使用。雖然沒有用 S. boulardii 表現抗體的研究，但同種的 S. cerevisiae 已被廣泛用來表現抗體。他們先試著在 S. cerevisiae 裡表現 ABAB，看用哪個 secretion signal 表現最好，然後在放到 S. boulardii，經過一些 optimization 之後，表現量可以增加四倍，然後測試 S. boulardii 生產的 ABAB 是否仍具有中和效用，細胞實驗的結果顯示是可以的，再來就是測試安全性了。

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他們讓接受抗生素的老鼠每天吃一劑的 S. boulardii (10^9 CFU)，看看是否有副作用，結果顯示老鼠除了變胖之外，沒有明顯的副作用。除此之外，老鼠的糞便中還可測到持續表現 ABAB 的益生菌，重要的是從腸胃道取出的 gut fluid 仍保有抑制 TcdB-induced toxicity 的效用，沒有被餵食基改益生菌的老鼠糞便則沒有抑制 toxicity 的效用。

通常在治療細菌感染或是術前準備時，會給病患吃抗生素，但服用抗生素會增加 CDI 的感染風險，那表現 ABAB 的益生菌可以解決這個困擾嗎？在預防性治療實驗中，他們讓接受抗生素的老鼠先吃七天表現 ABAB 的基改益生菌，或是沒表現 ABAB 的益生菌，然後再讓他們感染 C. difficle，結果發現沒吃益生菌或是吃沒表現 ABAB 益生菌的老鼠出現CDI 感染症狀，糞便裡有 C. difficle 和其毒素，而吃表現 ABAB 益生菌的老鼠則症狀輕微或是無症狀，糞便裡的 C. difficle 也相對少。用在急性感染治療上的效果如何呢？老鼠在感染後八到十二個小時內出現症狀，有的在 48 小時內死亡，存活率大概五成，而被餵食表現 ABAB 基改益生菌的老鼠存活率有八成，而且復原力也較高。

在臨床上，病患在停止抗生素治療後，有時會出現反覆感染的狀況。在預防反覆感染的實驗中，老鼠在接受感染的一天後開始每天吃基改益生菌，連吃十三天。沒接受表現 ABAB 益生菌或沒表現 ABAB 益生菌的老鼠在停止 vancomycin 後出現再度感染的情況，像是腹瀉、體重減輕或死亡，而服用表現 ABAB 益生菌的老鼠再度感染的狀況顯著降低，只有輕微腹瀉，也沒有體重降低的狀況。

好好奇糞便裡的基改益生菌是否仍有抑制 toxicity 的效用。哦，對了，反基改人士會不會說他們寧願吃抗生素，也不要吃基改益生菌呢？XD



Articles:

US CDC: Nearly half a million Americans suffered from Clostridium difficile infections in a single year

Science / Antibody-producing yeast vanquishes deadly gut infection in mice (Oct 2020)


Paper:

K Chen et al, A probiotic yeast-based immunotherapy against Clostridioides difficile infection. Science Translational Medicine (2020)

抗新冠病毒的合成小抗體 sybodies

之前美國德州大學的研究團隊首先發表 Spike protein cyro-EM structure 後不久，又發表了一篇從駱馬身上釣出抗新冠病毒的小抗體 nanobodies。

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nanobodis 是什麼呢？駱馬和鯊魚體內除了有普通的 IgG 之外，還有一種只有 heavy chain 的小抗體 HCAbs，其辨識抗原的 Fv (variable region)為 VHH，又稱為 nanobodies，近幾年因為體積小，相較傳統 IgG 易純化，開始受到注目。

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駱馬和鯊魚體內產生的小抗體是天然的，需要先把抗原打進駱馬體內，等牠們產生抗體後，從牠們的免疫細胞內抽出抗體的基因序列製造成 libraries，再用噬菌體展示(phage display)的技術釣出抗抗原的小抗體，這個普遍抓抗體的方法雖然不難，但費時費力，而且你需要先找到駱馬用 XD。

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2018 年的時候，瑞士蘇黎世大學的研究團隊研發了三個針對細胞膜蛋白(membrane proteins)不同面的人造合成小抗體 libraries，這三個 libraries 的不同主要在於 CDR3 的長度，不同的長度會和蛋白表變不同的地方結合[註1]，而從這些 libraries 釣出來的合成小抗體(synthetic nanobodies) 稱為 sybodies。

註1：他們把這三個 libraries 稱為 concave, loop, convex。Concave 的 CDR3 比較短，只有六個氨基酸長，主要透過它們 concave surface 和抗原結合。 Loop 的 CDR3 則是中長度(12 a.a.)，是一個 loop 的形狀，可以進到接受器(receptor)的 cavity 而結合。Convex 的 CDR3 最長(16 a.a.)，會形成一個 hydrophobic core 和抗原結合。


Figure / Selection of sybodies against membrane proteins within three weeks (Zimmermann et al, eLife 2018)

EMBL Hamburg 的研究團隊這個月在 Nature Comm 發表了他們的研究，他們從三個 sybody libraries 裡共釣出 85 個合成小抗體，純化了其中 62 個後，檢測了它們的 binding affinity，其中有六個和 Spike RBD 結合力很強，Kd 範圍約為 10 nM - 60 nM，其中以 Sb23 這株小抗體最強。

小抗體的結合力強，那是否有抑制病毒的作用呢？他們掃了 36 個小抗體，測試它們的中合力(neutralizaiton activity)，發現其中十一個小抗體的 IC50 < 20 ug/ml，六個的 IC50 < 5 ug/ml，Sb23 的 IC50 則只有 0.6 ug/ml (48 pM)，當它和 Fc 接在一起後，IC50 可達到 0.007 ug/ml (0.56 pM)，未來有望用於治療。

IC50 用 ug/ml 來表示真是不習慣啊，於是我把它換算成 pM 惹。

Sb23 (MW = 12.5 kDa)
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFPVESENMHWYRQAPGKEREWVAAIYSTGGWTLYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAVQVGYWYEGQGTQVTVS



Articles:

EMBL Press release / cientists identify synthetic mini-antibody to combat COVID-19

TN / Synthetic Mini-Antibody Binds to and Neutralizes SARS-CoV-2 (Nov 2020)

Addgene blog / No Llamas Required - Synthetic Nanobodies Against Membrane Proteins (June 2020)



Papers:

 TF Custodio et al, Selection, biophysical and structural analysis of synthetic nanobodies that effectively neutralize SARS-CoV-2. Nature Comm (2020)

I Zimmermann et al, Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife (2018)

從駱馬體內得到的新冠病毒小抗體

哎呀呀，已經有人做了啊。這篇的研究團隊是之前做 Spike protein Cyro-EM 的那個，原來他們也有做駱馬(llama)的小抗體研究啊。

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如果有看過我之前關於小抗體那篇的，就知道駱馬和鯊魚除了有普通的 IgG 之外，還有一種只有 heavy chain 的小抗體 HCAbs (heavy chain antibodies)，如果只取它的 Fv (variable region)，體積會更小，稱為 VHH 或是 nanobodies (Nbs)。這種小抗體要顧慮的地方比傳統 IgG 要少一些，例如不用考慮是否醣化(glycosylation)，加上也較容易生產製造，所以近來也引起關注，可望作為另一種型態的抗體藥。

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根據文中所述，他們自 2016 年起就用駱馬研發對抗 SARS 和 MARS 的小抗體。駱馬被先後打入 SARS 和 MERS 的 Spike protein 後體內會產上對抗 Spike protein 的抗體，他們在打入抗原的六週後取出駱馬的淋巴球，然後再用噬菌體展示(phage display)從中釣出可以和 Spike protein 結合的小抗體。他們從從駱馬淋巴球裡抓到七個 MERS 的小抗體和五個 SARS 的小抗體，得到了小抗體的基因序列後，便在酵母菌裡大量表現，然在再用 ELISA 確認它是否真的能夠和病毒結合。經過試驗發現其中一個 VHH 可以中和 SARS，為 VHH-72，並且和 MERS 的 S protein 沒有 cross-reactivity。

註 1：抗原(antigen)對免疫系統來講就是外來物，因此可以是病毒或細菌，免疫系統在外來物入侵後即會產生抗體(antibody)對抗外來物。

註 2：一隻駱馬可以被打入五種抗原，之後在用 phage display 把分別的小抗體釣出來，想更瞭解細節的可參考之前的《 Phage display 和小抗體製造 》這篇。

接著，他們想測試這些 VHH 是否可以抑制病毒，於是他們改造了基改過無害的 lentivirus VSV，讓它們在表面表現 S protein，假裝是 SARS，然後看看這些假 SARS 病毒是否能夠進入細胞，結果顯示和假 SARS 或假 MERS 結合力很強的 VHH 可以抑制病毒，結合力若的則沒有抑制的效果，其中以 VHH-72 的效果最好，9 nM 就可以達到抑制的效果。另外，VHH-72 雖然和 SARS S protein RBD 的結合力很強，但是 ELISA 的結果顯示它對 SARS S protein NTD (N-terminal domain) 沒有反應，表示 VHH-72 是透過和 RBD 結合來抑制病毒。

這個研究裡我比較訝異的是他們也分析了小抗體和病毒結合的 crystal structure，發現 VHH 抑制病毒的機制應該是把 Spike 的 RBD 固定在某個 conformation，使它不能動。VHH-72 是透過其 CDR2 和 CDR3 和病毒結合，但結合點和 ACE2 似乎不同，和 ACE2 競爭的不是 CDR2 或 CDR3，而是比較遠的 FR (framework region)。


Figure / The Crystal Structure of SARS VHH-72 Bound to the SARS-CoV-1 RBD (Wrapp et al, Cell 2020)

因為新冠病毒的 Spike protein 和 SARS 的很像，所以他們想知道 VHH-72 是否也可以抑制 SARS-CoV-2 的感染。他們發現 VHH-72 也會和新冠病毒的 S protein RBD 結合，但是 binding affinity 比較低。他們的 crystal structure 分析結果顯示 VHH-72 是和 SARS S RBD 的 R426 接合，而這個氨基酸在 SARS-CoV-2 則是 N439，這可能是造成 binding affinity 的原因。為了增強 binding affinity，他們試了兩種方法：一是用 (GGGS)3 linker 把兩個 VHH-72 尾接頭的連在一起(VHH-72-VHH-72)，一是在它後面接一個 IgG Fc (VHH-72-Fc)。ELISA 測試的結果顯示，這兩種都會會 SARS S 和 SARS-CoV-2 S 結合，並且細胞實驗顯示 VHH-72-Fc 可以抑制假 SARS 和假 SARS-CoV-2。

有意思的是 VHH-72 在病毒 S protein 的結合點似乎和之前發表過的抗體不同，倒是和 CR3022 類似，不過 CR3022 並無法抑制 SARS-CoV-2。

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哦，另外還有一個重要的點，就是這個小抗體可以在動物細胞裡大量表現，別以為這沒什麼，你如果遇過那種在三種細菌株裡都表現不出來，要不就表現出來但是不 soluble 的 VHH 就知道苦了。（現在每天都在和 phage display 還有 VHH 奮戰的苦主 QQ）

其實這篇研究的另一半是 MERS 和它的 VHH，有興趣的人可以看看。



Article:

UT NEWS / Antibodies from Llamas Could Help in Fight Against COVID-19 (Apr 2020)

TN / Llama Antibodies Could Help Fight Against COVID-19 (May 2020)


Paper:

Wrapp et al, Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-Domain Camelid Antibodies. Cell (2020)

Phage display 和奈米抗體製造

之前聊過抗體的一些知識，這篇來介紹如何用 phage display (噬菌體展示)來製造抗體，這邊說的抗體是奈米抗體 VHH，也就是 nanobodies (Nbs)。如果還記得之前說過的，駱駝除了正常的 IgG 抗體外，還有一種只有 heavy chain 的小抗體(HCAbs)，而 VHH 就是它的 variable region，很小，只有 14kDa 左右。和用老鼠產生抗體的方式類似，只是這是把抗原打到羊駝(llama, alpaca, 屬於駱駝科 Familiy: Camelidae)體內。

奈米抗體(nanobodies)的開發流程

整個用 phage display 研發小抗體的步驟大概是：

1. Purify antigen (純化抗原)
2. Immunization (把抗原打到動物體內讓他們產生抗體)
3. Library building (製造抗體 library)：整個過程包括抽取動物的免疫細胞(lymphocytes)，從免疫細胞裡抽取 RNA，把 RNA 轉成 cDNA，PCR amplification，clone 到 phagemid 裡面後再 transform 到細菌裡做成細菌的 library。之後用 phage 去感染細菌，轉成 phage library。
4. Biopanning & phage amplification: 從含有各種抗體基因的 phage library 裡面把不跟抗原反應的抗體洗掉，抓出和抗原抓出相對應的抗體。
5. Phage ELISA: 利用 ELISA 釣出 positive clones，這個步驟是要從 biopanning 出來的一堆 phage 裡一個個挑出真的會和抗原反應的抗體。
6. Sequencing of positive clones：定序從 phage library 釣出來的抗體，知道序列後就可以大量生產。
7. Cloning into expression vector & purification: 把抗體的基因轉到 expression expression vector 後就可以大量表現和純化抗體。

打入抗原、讓牠產生抗體後，就可以採集牠的 lymphocytes，從中抽取 mRNA，再轉成 cDNA。之後用可以 amplify VHH 的 primers 和 PCR 去 amplify，再把這些 amplified 出來 VHH fragments subclone 到 phagemid。這些 amplified 出來的 VHH fragments 就是抗體的 DNA library。


Figure / Phagemid pMECS. VHH gene is fused to gIII gene of bacteriophage. (Vincke et al 2002)

噬菌體的構造

Phagemid 本身有包含 bacteriophage (噬菌體)的一些東西(e.g., f1 origin)，所以除了會複製外，在 helper phage M13 的加入下 [註1]，會在細菌裡 package 成一個個的 phage particles。把 VHH 的 DNA library subclone 進 phagemid 裡面是為了讓它和 phage 的 gene III 連結在一起 [註2]，gene III 的蛋白質 product 是噬菌體的外層蛋白 g3p (g3 protein)，也就是 coat protein [註3]。把 VHH 的 DNA library 和 gene III 連結在一起的話，那當 phagemid 在複製和 package 成 phage 的時候，就會和 g3p 一起表現在 phage 的表面（下圖 P3 的地方），這就是 phage display (噬菌體展示)，把抗體展示在噬菌體表面。


Figure / Microbiology: Chapter 11 - Molecular Biology of Viruses (W. W. Norton)

註1：f1 和 M13 phage 都屬於 inovirus (ssDNA virus)，M13 有十個 genes，gene I 到 gene X，它們的 protein products 即是 g1p 到 g10p。Phage display 裡常用的 helper phage 是 M13KO7，可以幫助噬菌體把 phagemid 包進 phage particle 裡面。

"M13KO7 is able to replicate in the absence of phagemid DNA. In the presence of a phagemid bearing a wild-type M13 or f1 origin, single-stranded phagemid is packaged preferentially and secreted into the culture medium.This allows easy production of single-stranded phagemid DNA for mutagenesis or sequencing." （摘自 NEB 的產品網頁）

註2：下面提供的 protocol 裡用的 phagemid 是 pMECS，它帶有 f1 origin 和 gene III。
註3：如果對病毒還算熟悉的話，就是類似病毒的 capsid proteins 或是 envelope proteins。M13 的 g3p 是在的尾端，Expasy 的 ViralZone 有不錯的介紹：Inovirus - M13 phage。

要讓噬菌體把 VHH 表現在它的表面，需要把 phagemid 轉入細菌中，這樣它才有辦法在細菌裡面 package 成一個個的 phage，並且在細菌中大量繁殖，而這些會表現 VHH 的 phage 就是 phage library。

怎麼釣出你要的奈米抗體？

因為一隻羊駝裡可以打入好幾種抗原，所以產生的抗體是對抗不同抗原的混合，因此上面做出來的 phage library 其實是各種抗體的混合。例如你在一隻駱駝裡打入 A, B, C 三個抗原，牠體內就會產生 anti-A, anti-B 和 anti-C 的奈米抗體，你的 phage library 也就會是這三種抗體的混合，如果你要從中挑出 anti-A 的 nanobodies，這時候就要做 biopanning 。

那要怎麼挑出來呢？

就是用 A 抗原去挑，把 A 固定在盤子上後，加入 phage library，這時候表現有 anti-A nanobodies 的 phage 就會 bind A，然後把其他不會 bind A 抗原的 phage 都洗掉，再把會 bind A 抗原的 phage 洗出來(elution)，就是你的 anti-A phage library 惹。Anti-B 和 anti-C 的 phage 也可以用同樣方法挑出來，這個步驟就是 biopanning。


Figure / Scheme of phage display (T Schirrmann et al, Molecules 2011; doi: 10.3390/molecules16010412)

上圖中可以看到每個 phage 的尾巴都表現不同的抗體，這些抗體會和它可以辨識的抗原結合，然後其他的抗原的抗體或是 non-specific binding 會被洗掉，而可以和抗原結合的抗體則會被挑出來，在 helper phage 的幫助之下再度感染細菌，使這些帶有能夠辨識抗原的抗體的噬菌體 amplify。經過 amplification 的噬菌體再進入下一輪的 biopanning，把 binding 比較弱的和其他的 non-specific binding 再洗掉，這樣重複個兩三輪。

之後這些各別的 anti-A, anti-B 和 anti-C phage library 可以用 ELISA 的方法(i.e., phage ELISA)挑出 individual phage clones，例如找出 affinity 最高、最 specific，或是最 stable 的 nanobodies。挑出來的 phage clones 可以萃取出它們的 phagemid，定序之後就可以知道這些 nanobodies 的 DNA sequences。



詳細的 protocol 可以參考這篇：

C Vincke et al, Generation of Single Domain Antibody Fragments Derived from Camelids and Generation of Manifold Constructs. Antibody Engineering (2012)


延伸閱讀： 關於抗體和抗體藥的一些小知識

關於抗體和抗體藥的一些小知識

近幾年來抗體藥變得頗為流行，不少藥廠研發抗體藥，其中包括治療阿茲罕默症的 aducanumab 和 solanezumab。藥名後面為 -mab 的代表是抗體藥，-mab 即為 mAb (monoclonal antibody)。


Figure / Wiki - Drug nomenclature（點圖可以放大）

學名藥命名方式可參考這：Generic Name Stems

大家都知道抗體 IgG 長什麼樣子吧？就是兩個 heavy chains 和兩個 light chains，辨認抗原(antigen)的那端是 Fv (variable regions)，另一端則是會被醣化(glycosylation)和引發免疫反應的 Fc (constant regions)。但是，你知道嗎？駱駝(camelid, llama)的體內有兩種抗體哦哦哦！一種是跟人類一樣的 IgG，另一種是只有 heavy chains 的抗體(HCAbs)，這種特別的抗體的 Fv 叫做 VHH (下圖)，又稱 nanobodies (Nbs)，雖然只有 heavy chain，但是對抗原的 binding affinity 並沒有比較弱，加上體積小，可以用來做抗體藥。


Figure / P. Holier & P. J. Hudson, Nature Biotechnology 2005 (doi: 10.1038/nbt1142)

簡單來說抗體藥有幾種，一種是整個 IgG，一種是只有 Fab，或甚至是只有 Fv，近來更小的 single-chain Fv (scFv) 和 VHH (Nbs) 也引起關注，這兩種小抗體有個好處，就是比完整的 IgG 更容易穿透細胞，也容易被清洗掉(這點有好也有壞，要看用在哪)，而且因為小又沒有 Fc，所以打入體內做為治療時不會引起不必要的免疫反應。

目前做抗體藥的方法有分三種，一種是大家比較知道的 in vivo，先打到動物裡，再取出 B cells 和 myeloma 合成 hybridomas 生產 monoclonal antibody。另一種是在 E. coli 裡面製造，這種大家應該也知道，在細菌裡面製造的優勢就是量大且便宜。最後一種是在酵母菌裡面製造，在酵母菌製造的優勢也是量大且便宜，但比細菌好的是它是 eukaryotic。

因為正常情況下，Fc 的部分會醣化，所以如果要做整個 IgG 的話，最好是在 mammalian cells 裡面製造，就是用 hybridomas，因為細菌並沒有 glycosylation，所以如果用細菌的話，還要再另外 in vitro glycosylation，這麼麻煩的話為什麼還要用細菌呢？如果你是要製造 Fab 或是 scFv 的話，因為不需要 glycosylation，這時候用細菌就可以省時省錢。

酵母菌的話，則是可以用來製造 IgG 或是 Fab, scFv。但是酵母菌的 glycosylation 和人類的不一樣，酵母菌的只有 mannose，生產出來的會附帶大量的 mannose，但是人類的是比較複雜的，通常不只有 mannose，還有 galactose 和 sialic acids 等等，所以需要改造酵母的基因，讓它能夠生產 galactose 和 sialic acid。所以同樣的，如果只是製造 Fab 或是 scFv 的話，用酵母菌會比用動物便宜。如果要製造整個 IgG 的話，雖然比較複雜一點，但是如果基因調控好了，除了可以大量生產外，還可以控制抗體的品質，省錢省時間。另外就是利用酵母菌的話，生產的蛋白質可以讓它釋放出來到培養液中，這樣純化起來會比較容易。


Figure / Jens Nielsen, Bioengineered 2013 (doi: 10.4161/bioe.22856)

當然用 E. coli 或酵母菌的話，不只能製造抗體藥，其他的蛋白質藥物也可以，例如目前市面上已有用酵母菌生產的胰島素(by Novo Nordisk)。

有興趣的可以看下面幾篇 papers。


[05.12.2018 update]

這次 Science 發了這篇文章介紹我之前講的駱駝和鯊魚的小抗體。駱駝和鯊魚除了有正常的 IgG 抗體外，還有一種小抗體，是只有 heavy chain 的抗體。這種小抗體有跟正常抗體一樣的功能，同樣能抓住抗原(antigen)，是免疫系統的一部份，在外來物體入侵時，體內會產生免疫反應製造出這些小抗體。小抗體的 variable region，也就是 VHH，又稱 nanobodies，近年被廣泛研究，看是否能用在治療疾病上面。Nanobody 的其中一種用法就是在它的一端接上讓蛋白降解訊息片段(signal sequence)，例如 degron，這樣當 nanobody 抓到致病蛋白後，接著就會被帶去 proteasome 或是 lysosome 進行降解。

相關舊文：降解蛋白質的密碼(degron)

小抗體的發現是個意外，VUB 的學生想要分析血液和疾病的關聯的時候，因為不想殺老鼠取血，便想到了冷凍庫有駱駝寫的庫存，拿來用後卻發現駱駝血裡面除了有正常的 IgG，還有一種小型的抗體，研究後發現是沒有 light chain 的抗體。之後英國的博士生想要研究駱駝的小抗體，便請 VUB 的研究人員寄血液檢體砍他，沒想到在運送過程中血液莫名弄丟了。不過呢，之後他發現鯊魚血液裡也有這種只有 heavy chain 的小抗體。（這真是太神奇了，為什麼研究會從駱駝跳到鯊魚呢？）

Nanobody 也讓 Kobeilka 得到 2012 年的諾貝爾化學獎，Kobeilka 研究的是 β2-adrenergic receptor，他利用 nanobodies 把 receptor 鎖在 active state 以研究其 crystal structure，他把結果發表在 2011 年的 Nature，之後便在 2012 年因這項研究得到諾貝爾獎。



References:

Science / Mini-antibodies discovered in sharks and camels could lead to drugs for cancer and other diseases (May 2018)

S. Steeland et al, Nanobodies as therapeutics: big opportunities for small antibodies. Drug Discovery Today (2016)

P. Holliger & P.J. Hudson, Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology (2005)

Rasmussen et al, Structure of a nanobody-stabilized active state of the β2 adrenoceptor. Nature (2011)