又一篇新冠病毒的小抗體研究

這集的標題雖然是駱馬的小抗體(nanobodies)，但前半個小時是討論中國的 CoronaVac，同時他們也收到很多 email 詢問為什麼美國不也做 inactivated virus vaccine。



第一個用病毒做的疫苗是 Edward Jenner 的天花疫苗(smallpox, 1798)，為 inactivated Vaccinia virus。第二個 Pasteur 的狂犬病疫苗(rabies, 1885)，再來是黃熱症疫苗(yellow fever, 1935)和流感疫苗(influenza, 1936) [1]，流感疫苗剛開始是給軍方用，因為在第一次世界大戰時美軍人力因流感而有所損失 [2]。

至於為什麼美國不用病毒做新冠病毒的疫苗呢？他們解釋是美國已經研發其他種類的疫苗很久了，包括 mRNA 疫苗和 subunit 疫苗，所以可以直接拿來用，加上大藥廠已經砸很多錢在研發新型疫苗，因此拿來研發新冠病毒疫苗相對來講反而是比較簡單的。另一個可能原因是用病毒做疫苗需要用到 BSL3 的實驗室，不方便大量生產。

關於中國的 CoronaVac，他們提到 inactivated virus vaccine 通常是用 UV 或福馬林(formalin)去 inactivate viruses，但中國的這支疫苗是用 β-propiolactone (C3H4O2)，雖然它也被用來 inactivate viruses，不過它會和蛋白質反應，可能會改變蛋白結構，而且最近有幾篇研究顯示 β-propiolactone 會使 Spike 的 S1 脫離 [3, 4]，而可讓免疫系統產生中和抗體的 RBD 就在 S1，如果新冠病毒疫苗少惹 S1，那疫苗效用還剩多少？另外，如果要做 inactivated viruses，也會先評估用來 inactivate 的物質會不會改變病毒結構，是否每個 batch 的品質都穩定一致。之前的疫苗之所以用 inactivated viruses，是因為當時那個年代的技術就只能用 inactivated viruses，並不是因為它比較安全，如今的科技使疫苗不再局限於用 inactivated viruses。

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裡面還有一段對話滿好笑的(30:25)，CoronaVac 的臨床實驗是 Phase I/II 合在一起，通常是 Phase I 安全測試過了以後，換一批測試者做 Phase II。SinoVac 是一二期一起做，第一期只有七天，七天後如果沒出現問題就進入 Phase II [5]。然後其中一位就說，因為是用 inactivated viruses，如果真的有問題的話，七天後試驗者可能就掰掰了，既然七天後沒人死，就表示疫苗算是安全的。XD

(33:50) "... that the Chinese government enlisted army personnel for at least one of the phases for their trial and I thought we were critical of that for a while, but I think that's no longer a criticism."

".... yeah, we got a lot of pushback from people in China who said this is often done and it is often done, but they said it was licensed and it was actually a Phase II trial, so they should have just said it's a Phase III trial, right? instead of saying it was licensed for you."

"I think the issue there was is it okay to do that in troops, ..... I think I pointed out the U.S. can't exactly get on a moral high horse about what's been done."

還有一段莫名戳中我的笑點，是討論到 Phase III 是在中國、巴西和土耳其做的，最近還加了印尼。

(44:10) "I don't think they had enough cases in China to do the Phase III, right?"

"I think because at that point the pandemic was really under control such through lockdowns in China, they were actually having a hard time getting cases for their clinical trials, but uhh unfortunately, plenty of other countries had plenty of cases."

之後駱馬小抗體的部分是討論德國研究團隊於上個月發表在 Science 的研究。之前有提過駱馬除了正常的 IgG，還有一種只有 heavy chain 的抗體 HCAb，以及釣出小抗體的噬菌體展示(phage display)。

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在這篇之前，德州大學(U Texas)也在去年發表過他們抗 SARS 的小抗體，他們是把 SARS Spike 打入駱馬體內，然後釣出小抗體，經過 cyro-EM 分析發現效果最好的小抗體 VHH-72 是把 Spike RBD 固定在某個 conformation，使它無法動。他們把這個小抗體測試在假新冠病毒上(pseudovirus)，發現它也可以抑制新冠病毒。

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德國的這個研究則是把新冠病毒的 Spike RBD 和用福馬林去活性過的新冠病毒打入駱馬後釣出小抗體，然後測試這些小抗體的中和效用(neutralizing activity)，發現其中一株中和效果最強的小抗體 VHH E 的 IC50 可到 60 nM [6]。VHH E 和其他小抗體不太一樣，它的 CDR3 特別長，雖然和 ACE2 結合的點和之前發現的小抗體 CC12.3 和 H11-D4 相同，但方向不一樣。之前研究發現，Spike RBD trimer 通常處在一個 up & down conformation 平衡的一個狀態，較常發生的狀態是沒有或三個中只有一個 RBD 處於 up conformation。雖然三個 RBD 都為 up conformation 的狀態很少見，但只有 up conformation 才可以和 ACE2 結合，只是不知道需要幾個 RBD 為 up conformation。

他們用 cryo-EM 分析 VHH E 和 ACE2 結合的狀態，發現和 VHH E 結合的大多是三個 RBD 都為 up conformation，並且各和一個 VHH E 結合，顯示 VHH E 會把 RBD 固定在 3-up conformation，而且一旦結合，RBD 就無法變回 down conformation。不免俗的，也要試試把兩、三個 VHH 連在一起看看效果會不會更好，當然也是用常用的 (GGGS)3 linker，結果發現 IC50 可以降到 pM range (930 pM for VHH EE, 520 pM for VHH EEE)。這篇研究和其他不同的地方是他們還有測試哪些突變會逃過 VHH 的中和作用，有趣的是如果某個突變可以逃過某個 VHH，大多的情況是它會對其他 VHH 更敏感，所以如果把兩個不同的 VHH 結合在一起，便沒有突變可以逃過 VHH。相反的，雖然 VHH EEE 有很強的中和作用，single mutantion 就可以讓病毒逃掉。



References:

1. S Plotkin, History of vaccination. PNAS (2014)

2. US CDC / Influenza Historic Timeline

3. Y Cai et al, Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science (2020)

4. AV Letarov et al, Free SARS-CoV-2 Spike Protein S1 Particles May Play a Role in the Pathogenesis of COVID-19 Infection. Biochemistry (2020)

5. Z Wu et al, Safety, tolerability, and immunogenicity of an inactivated SARS-CoV-2 vaccine (CoronaVac) in healthy adults aged 60 years and older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1/2 clinical trial. The Lancet (2021)

6. P Koenig et al, Structure-guided multivalent nanobodies block SARS-CoV-2 infection and suppress mutational escape. Science (2021)