利用 peptide 檢測早期阿茲海默症

這是一年前的研究了 XD，我在刷臉書的時候看到有興趣但當下沒時間細讀的會先存起來，然後等有時間再打開來看，寫寫分享，然後不知不覺就積了很多沒看的，剛剛翻到這篇才發現竟然已經默默過了一年惹。（淚）

對阿茲海默症有點小了解的大概都知道治療此病的瓶頸主要有兩個，一是無法及早發現，通常發現時，也就是出現輕微失智症狀時(mild cognition impairment, MCI)，已經太晚了，二是藥物無法通過 BBB (blood-brain barrier)，因此目前除了藥物研發的研究，有的是針對如何在症狀未出現時便可即早發現。

動物腦部有一個蛋白是 CTGF (connective tissue growth factor)，主要功能是免疫反應和組織修復，AD 基轉老鼠腦部的 CTGF 會在 Aβ 堆積前出現上升的現象。這篇刊在 Nature Communications 的研究利用 phage display 釣到了一個目標蛋白是 CTGF，長度為九個氨基酸的環形胜肽(cyclic peptide) ，稱為 DAG。

怎麼用 phage display 釣的呢？他們是用 CX7C library，CX7C 是九個氨基酸長的 peptide，第一個和最後一個(也就是第九個)氨基酸是 cysteine，中間七個氨基酸是隨機的，用的是 degenerate codons NNK [註1]。兩端的 Cys 會形成 disulfide bond，使這小段的 peptide 變成一個環狀，用來標靶癌細胞的 iRGD 就是一個例子 [註2]。（iGRD sequence: CRGDKGPDC)

註 1：K = G or T and S = C or G。
CX7C library 製作細節可參考這篇：Tero AH Järvinen 的這篇：Design of Target-Seeking Antifibrotic Compounds

註 2： 之前有不少研究是用 phage display 釣出各個器官的 homing peptides，就是說這些 peptides 只會出現在某些器官，也就是這些器官有其他器官沒有的標靶蛋白或標靶物，可以用來當作器官的 biomarkers。用來穿過癌細胞 iRGD 就是用這個方法找到的，有興趣的可以參考 T Teesalu et al 的這篇：Mapping of Vascular ZIP Codes by Phage Display

關於噬菌體展示 phage display 可以參考之前這篇：Phage display 和小抗體製造

CX7C library 裡的九個氨基酸長的 peptides 會表現在 T7 phage 的表面，研究者們再把這些 T7 phage 靜脈注射到老鼠體內。T7 phage 進到老鼠體內後會到處遊走，其表面的 peptide 其在遊晃的時候便可找尋和它相結合的蛋白質。他們把 T4 library 分別打入正常老鼠(wildtype)和不同階段的 AD 基轉老鼠裡（三個月、五個月、七個月和九個月大的老鼠），然後再取其海馬迴(hippocampus)做比較，看有哪些 peptides 會大量出現在 AD 基轉老鼠的海馬迴裡，但卻沒出現在正常老鼠裡的，表示它的標靶蛋白是 AD 腦部裡的某個蛋白，可用來做為阿茲海默症的 biomarker，或許也可以用在治療上。比較了之後，他們找到惹 DAG (序列為：CDAGRKQKC，通常以前三個氨基酸為名)。

DAG 出現在所有階段的 AD 基轉老鼠腦內，包括皮質(cortex)和海馬迴(hippocampus)，表示早期的 AD 老鼠腦部就有可以作為 biomarker 的蛋白。接著，他們把 DAG 打入基轉 AD 老鼠裡後做了一連串的螢光染色，試圖找出 DAG 的標靶細胞和標靶蛋白，發現它出現在鄰近有 Aβ 的神經星狀膠質細胞(astrocytes)。另外，DAG 也出現在大腦皮質(cerebrocortex)的血管內皮細胞(biomarker: CD31)，而它標靶蛋白是血管內皮細胞上的 CTGF。這個蛋白質表現在人類和老鼠的腦中，功能是啟動發炎反應和組織修復，腦部受傷後 CTGF 的表現量會上升。他們研究了 CTGF 在腦部的表現，發現和正常老鼠相比，它同樣大量表現在 AD 基轉老鼠的大腦皮質和海馬迴，而且也是出現在 astrocytes，他們也做惹 binding 測試，確認 DAG 的標靶的確是 CTGF。

之後，他們檢測了三、四個月大、Aβ 尚未出現的年輕 AD 基轉老鼠腦部，發現 DAG 大量出現在大腦皮質和海馬迴，主要在其血管內皮細胞，表示 DAG 的標靶是 CTGF 而不是 Aβ。為了確認 DAG 不只作用在老鼠腦部細胞，他們用 AD 患者的幹細胞做 binding 測試，是用 DAG-conjugated Ag-nanoparticle (DAG-AgNP) 去染細胞組織，發現可以看到 DAG。用病患的腦部切片測試的話，DAG-AgNP 則出現在含有大量 Aβ 的海馬迴，用螢光染色的話也可以看到 CTGF 同樣出現在海馬迴，表示 DAG 的標靶蛋白是 CTGF。看到這裡可能會覺得證據不夠有力，不過當他們在 DAG-AgNP 之前先加了 anti-CTGF 的抗體後，DAG-AgNP 的訊號就消失了，表示抗體阻斷惹 DAG-CTGF 的結合。 這裡有一點是我想知道，但是文章裡沒提到的，CTGF 在很多神經性疾病中都被發現表現量升高，而在這篇裡顯示疾病初期就可偵測到大量的 CTGF，我的話會想看到在正常老鼠和 AD 基轉老鼠裡，DAG, CTGF 和 Aβ 在三到九個月大的時候，表現量變化的比較。

最後就是 AD 治療的瓶頸，如何把 DAG 送進腦部？他們把 DAG 和帶有氧化鐵 (iron oxide) 的 nanoparticle 結合後，靜脈注射進九個月大的 AD 基轉老鼠裡，發現它可以進入到老鼠的大腦皮質和海馬迴。文章裡提到，這點可以用來做影像檢測 AD，但是 DAG 如果接了染劑或顯影劑後還能進到腦部嗎？



References:

NNR / Potential Biomarker for Early Detection of Alzheimer's (Nov 2017)

AP Mann et al, Identification of a peptide recognizing cerebrovascular changes in mouse models of Alzheimer’s disease. Nature Communications (2017)
https://www.nature.com/articles/s41467-017-01096-0

Tero AH Järvinen, Chapter 12 - Design of Target-Seeking Antifibrotic Compounds. Methods in Enzymology (2012); doi: 10.1016/B978-0-12-391858-1.00013-7

T Teesalu et al, Chapter 2 - Mapping of Vascular ZIP Codes by Phage Display. Methods in Enzymology (2012)

皰疹病毒和阿茲海默症的關係

之前有提過，關於阿茲海默症，有一派的學說認為腦中的 Aβ (amyloid-β) 和 tau 堆積可能是因為病毒或細菌感染所引起的，而最近有兩個發表在 Neuron 的研究顯示了皰疹病毒(herpesviruses)和阿茲海默症的關聯。其中一個研究分析了過世的病患的大腦後，發現患者的腦裡有兩種皰疹病毒的蹤跡，分別為 HHV-6A 和 HHV-7。Mount Sinai 的研究團隊定序了病患腦部的 DNA 和 RNA 想找到可以作為藥物標靶的東西，在分析了超過一千四百位過世病患腦部不同部位 -- 包括有 superior temporal gyrus (STG), anterior prefrontal cortex (APFC) 和 dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC) -- 的檢體後，在腦部的 AFPC 和 STC 發現了皰疹病毒 HHV-6A 的基因 U3/U4 (相似於 HHV-5 的 US22) 和 HHV-7 的 DR1，而且這些病毒似乎會影響人類的基因表現。他們發現 HHV-6A 會抑制 microRNA miR-155 的表現，當他們把老鼠 表現 miR-155 的基因拿掉後，其腦中的 Aβ 堆積會比正常老鼠的多。

他們也比較了阿茲海默症病患和其他患有神經性疾病的病患做比較，發現只有 AD 病患腦中的 HHV-6A 和 HHV-6 比較高。

HCMV: human cytomegalovirus, aka HHV-5

HHV-6 和 HHV-7 皆屬於皰疹病毒下的 roseoloviruses。HHV-6 有兩種：HHV-6A 和 HHV-6B。HHV-6A 會引發玫瑰疹 (roseola, aka exanthem subitum)，通常發生在幼兒身上，症狀是連續幾日的高燒，身上出現大塊紅疹。HHV-7 也會引發玫瑰疹，這兩種病毒很常見，大概有 90% 的成人都有。感染後病毒會潛伏在體內，HHV-6 會潛伏在免疫細胞 monocytes 和骨髓細胞(bone marrow progenitor cells)，HHV-7 會潛伏在 T cells。

另一個由哈佛醫學院和 MGH 合作的研究則是測試 Aβ 對皰疹病毒 HSV-1, HHV-6A 和 HHV-6B 的反應，他們認為 Aβ 是免疫系統的一環。在這篇研究中 Aβ oligomers 會結合皰疹病毒的表層膜中的醣蛋白(glycoprotein)，使病毒無法繼續活動或感染其他細胞。在神經細胞的實驗中，HHV-1, HHV-6A 和 HHV-6B 會加速 Aβ 的堆積，在感染後的 24 小時內便可觀察到 Aβ 堆積和纖維化(fibrilization)，而且 Aβ 可以抵抗 HSV-1 的感染。在老鼠實驗中也出現類似的結果，阿茲海默的基轉鼠 5XFAD 會在十到十二週大的時候腦中才出現 Aβ 堆積，但是卻在感染 HSV-1 的二十四小時後出現堆積。另外，HSV-1 會使老鼠出現腦炎(encephalitis)的病症，但是感染了 HSV-1 的 5XFAD 老鼠的存活率比感染後的野生鼠高，Aβ 會和 HSV-1 結合避免腦炎發生。HSV-1 的醣蛋白 glycoprotein B (gB) 會和 Aβ 結合，引起 Aβ 的纖維化，使病毒無法進入細胞，不過同時也會增加 Aβ 的堆積。

台灣的一個研究分析健保資料庫裡 2001 年間超過 33000 的病例，比較有無感染到 HSV-1 和得到失智症的比例，和得到 HSV-1 後有無用藥和得到失智症的比例後，發現 HSV-1 的感染使失智的機率增高 2.5 倍。（沒想到這篇文章會找到台灣的研究阿，但我覺得這只是表示兩者間有某種程度上的關聯，並不足以證明 HSV-1 感染會增加失智症的風險。）



Articles:

The Scientist / Herpes Viruses Implicated in Alzheimer’s Disease (June 2018)

NNR / How Herpes and Alzheimer's Disease are Linked (June 2018)

MGH / Amyloid beta protein protects brain from herpes infection by binding to, entrapping viral particles (July 2018)


Papers:

B. Readhead et al., Multi-scale analysis of independent Alzheimer’s cohorts finds disruption of molecular, genetic, and clinical networks by human herpesvirus. Neuron (2018)

W.A. Eimer et al, Alzheimer’s disease-associated β-amyloid is rapidly seeded by herpesviridae to protect against brain infection. Neuron (2018); Corrections: 10.1016/j.neuron.2018.11.043

NS Tzeng et al, Anti-herpetic Medications and Reduced Risk of Dementia in Patients with Herpes Simplex Virus Infections-a Nationwide, Population-Based Cohort Study in Taiwan. Neurotherapeutics (2018)

抗發炎藥物似可預防阿茲海默症

如果阿茲海默症的預防可以這麼簡單，那真是好事。

關於阿茲海默症的一些知識可以先看這篇：阿茲海默症新藥 新進度 Aducanumab
或這篇：利用 ASO 治療阿茲海默症

這個研究是 UBC 的教授做的，重點有兩個：

1. Aβ42 不只出現在腦部，全身上下的器官中都有，包括口水中也有，口水中的是由頷下腺(submandibular glands)產生的。口水中的 Aβ42 可以用 ELISA 就測出來，所以其實可以早期發現早期治療，而不是像現在這樣要等到輕微失憶(mild cognitive impairment, MCI)的症狀出來 [註]。在他們的控制組中沒有 AD 症狀的案例)裡，測出的 Aβ42 可以分成兩組，一組是口水中 Aβ42 量較低的(19-25pg/ml)，一組是較高的(41-60pg/ml)。低的那組是沒有 AD 風險的 ，他們口水中的 Aβ42 量為約 20pg/ml。

註：AD 進展分為六個階段，一期五年，每五年會惡化一倍。通常症狀會在 65+ 歲顯現出來，倒推回去大概是在 55+ 歲左右開始。第二個階段(第二個五年開始)和第三個階段(第三個五年)可以用 PET scan 測出來。第四個階段會開始出現輕微失智(MCI)，海馬迴(hippocampus)的萎縮也可以用 MRI 看出來，這個階段開始，AD 便無法被預防。

AD 的鑑定方法目前有三種：
- CSF (cerebrospinal fluid)裡的 Aβ 和 tau 量是否降低，但因為 CSF 是流動的，這個方法有限制。
- 用 PET scan 看腦中是否有 Aβ 堆積
- 用 MRI 看腦部(尤其是海馬迴的部分)是否有萎縮

2. 普拿疼(Ibuprofen)等的非類固醇抗發炎藥物(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)可以預防阿茲海默症。

相關文章：治療阿茲海默症的另一種可能？

後發性(也就是非基因造成)的阿茲海默症病因一直以來都是個問號，目前皆認同的是因為 Aβ (β-amyloid)和 p-tau 堆積造成腦細胞死亡，進而造成失智。但近來發炎這個現象也被考慮為病因之一，只是還不清楚是因為 Aβ 和 p-tau 堆積才造成發炎，加速惡化，還是因為發炎了才引發堆積。總之，抗發炎這個路徑也在研究治療的範圍之中。

之前就有臨床研究發現，類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)的病患得 AD 的比例較低，但不知道原因。在過去的 25 年間，有很多研究顯示有服用抗發炎藥物的 RA 病患人口，其中有得到 AD 的比例比較低。另外，類風濕性關節炎發作時間比 AD 較早，RA 病患通常在早期就開始吃抗發炎藥物。他們發現服用 NSAIDs 需要在 AD 之前就開始吃，至少吃了半年，最好是已吃了五年以上。



Articles:

NNR / Ibuprofen Can Prevent Alzheimer's Disease -Apparently


Papers:

PL McGeer et al, Alzheimer’s Disease Can Be Spared by Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs. J Alzheimers Disease (2018)

M Lee et al, A Method for Diagnosing Alzheimer’s Disease Based on Salivary Amyloid- Protein 42 Levels. J Alzheimers Disease (2017)

McGeer et al, Inflammation, Antiinflammatory Agents, and Alzheimer’s Disease: The Last 22 Years. J Alzheimers Disease (2016)