不用手術就可以把藥送進大腦的新技術

不管是什麼大腦的疾病，把藥送進大腦都是一個挑戰，因為 BBB (blood-brain barrier)。侵入性的方式通常是動手術，在腦部開一個洞，然後從洞口注射，因此只能治療一小區，而且風險較高。不過，這兩年有兩篇論文，分別用了類似的方法打開 BBB 把藥送進去。雖然大多數人可能會比較希望用非侵入性的方法，但非侵入性的效果不佳。

用脈衝雷射打開 BBB

德州大學(University of Texas)和其西南醫學中心(Southwestern Medical Center)的研究團隊發明了一個方法，可以把藥送進大腦。他們針對的疾病是大腦的惡性膠質母細胞瘤(glioblastoma, GBM)，通常被診斷為該癌症後的存活時間只有 15 到 18 個月，且目前的治療方式，包括手術、化療和放射治療的效果都不好，化療藥物因為 BBB 很難進入大腦。

德州大學的研究團隊利用針對血管緊密型連結(tight junction)的黃金奈米粒(gold nanoparticles, AuNPs)把藥物送進腦部，他們先把黃金奈米粒輸入血液中後，再用脈衝雷射(laser pulses)去激化黃金奈米粒，脈衝雷射可以穿過頭殼，黃金奈米粒再被激化後會產生熱機械波(thermomechanical waves)，短暫地讓 BBB 產生縫隙，使藥物可以滲透進大腦。在他們的老鼠實驗中，用治療卵巢癌、乳癌和肺癌的化療藥物 paclitaxel (Taxol) 做實驗，因為這個藥物無法穿過 BBB，但在用了脈衝雷射後，它順利進入大腦，老鼠腦中的腫瘤變小了，存活率也增加了。

他們用了兩種基改的母鼠模型做實驗，皆帶有膠質母細胞瘤的兩個重要病徵，包括分散浸潤性腫瘤(diffusely infiltrative tumor margin)和血管增生核心(angiogenic core)。在浸潤式腫瘤老鼠模型中(diffuse single-cell infiltration)，雷射脈衝加藥物的治療方式讓腫瘤變小了 5-7 倍，只有黃金微粒、沒有藥物和脈衝的腫瘤是 47 mm3，只有藥物沒有脈衝的是 44 mm3，脈衝加藥物則是變小到只剩 4 mm3，存活率也增加了 50%，壽命從 40 天延長到 60 天。在血管增生腫瘤老鼠模型中(rapidly expanding angiogenic mass)，雷射脈衝加藥物的治療方式讓腫瘤變小了 2.2-2.6 倍，只有黃金微粒、沒有藥物和脈衝的腫瘤是 90 mm3，只有藥物沒有脈衝的是 77 mm3，脈衝加藥物則是變小到只剩 36 mm3，存活率增加了 33%，生命也從 18 天延長到 24 天。

用超音波打開 BBB

雖然目前已知集中超音波開洞術(FUS-BBBO, focused ultrasound blood-brain barrier opening)可以短暫打開 BBB，但即使打開了，AAV 還是不容易進去，需要使用大量的病毒，而且也沒有精準性，無法控制它去需要治療的地方。

美國米大學(Rice University)由 Jerzy Szablowski 帶領的研究團隊開發了一個非侵入性治療的方法，是透過改造 AAV 改變病毒外層的殼蛋白(capsid protein)，使它可以去指定的地方，再用超音波打開那個區域的 BBB，透過這個方式可以降低病毒劑量，並且有效的讓它們去該去的地方。

他們先建立一個帶有各種 AAV9 殼蛋白的病毒庫，把它們打進老鼠裡，兩個禮拜後解剖老鼠大腦分析，看哪個突變進入大腦的效果最好，再看其大腦區域性，挑出 35 個精準度最好的，再從中挑出 5 個最常見的蛋白序列，然後和沒有突變的 AAV9 做比較。

除此之外，他們還分析了病毒的脫靶率(off-target rate)，還有進到肝臟的病毒量，發現其中有 4 個突變病毒的效果最好，而且沒有脫靶效應，進到肝臟的量也很少，其中以 AAV.FUS 3 最少，比 AAV9 少了 6.8 倍。

他們對 AAV.FUS 3 做進一步分析，看低劑量效果如何，發現即使降低了十倍進入神經細胞的量還是 AAV9 高了 4.6 倍 ，另外在標靶大腦特定區域的精準度上也不錯，其中針對海馬迴的效果增加最多。

也就是說，透過這個技術，不但可以增加病毒標靶特定細胞的精準度，還可以在低量的情況下有效地把病毒送進細胞裡，並且沒有脫靶效應，降低最其他器官的傷害。



Articles:

Drug-Delivery Technique for Brain Cancer Shows Growing Promise - News Center | The University of Texas at Dallas

Researchers pioneer noninvasive gene therapy for brain disorders | Rice University


Papers:

Q Cai, X Li, H Xiong et al. Optical blood-brain-tumor barrier modulation expands therapeutic options for glioblastoma treatment. Nat Commun (2023) DOI: 10.1038/s41467-023-40579-1

HR Li, M Harb, JE Heath et al. Engineering viral vectors for acoustically targeted gene delivery. Nat Commun (2024) DOI: 10.1038/s41467-024-48974-y

利用 peptide 檢測早期阿茲海默症

這是一年前的研究了 XD，我在刷臉書的時候看到有興趣但當下沒時間細讀的會先存起來，然後等有時間再打開來看，寫寫分享，然後不知不覺就積了很多沒看的，剛剛翻到這篇才發現竟然已經默默過了一年惹。（淚）

對阿茲海默症有點小了解的大概都知道治療此病的瓶頸主要有兩個，一是無法及早發現，通常發現時，也就是出現輕微失智症狀時(mild cognition impairment, MCI)，已經太晚了，二是藥物無法通過 BBB (blood-brain barrier)，因此目前除了藥物研發的研究，有的是針對如何在症狀未出現時便可即早發現。

動物腦部有一個蛋白是 CTGF (connective tissue growth factor)，主要功能是免疫反應和組織修復，AD 基轉老鼠腦部的 CTGF 會在 Aβ 堆積前出現上升的現象。這篇刊在 Nature Communications 的研究利用 phage display 釣到了一個目標蛋白是 CTGF，長度為九個氨基酸的環形胜肽(cyclic peptide) ，稱為 DAG。

怎麼用 phage display 釣的呢？他們是用 CX7C library，CX7C 是九個氨基酸長的 peptide，第一個和最後一個(也就是第九個)氨基酸是 cysteine，中間七個氨基酸是隨機的，用的是 degenerate codons NNK [註1]。兩端的 Cys 會形成 disulfide bond，使這小段的 peptide 變成一個環狀，用來標靶癌細胞的 iRGD 就是一個例子 [註2]。（iGRD sequence: CRGDKGPDC)

註 1：K = G or T and S = C or G。
CX7C library 製作細節可參考這篇：Tero AH Järvinen 的這篇：Design of Target-Seeking Antifibrotic Compounds

註 2： 之前有不少研究是用 phage display 釣出各個器官的 homing peptides，就是說這些 peptides 只會出現在某些器官，也就是這些器官有其他器官沒有的標靶蛋白或標靶物，可以用來當作器官的 biomarkers。用來穿過癌細胞 iRGD 就是用這個方法找到的，有興趣的可以參考 T Teesalu et al 的這篇：Mapping of Vascular ZIP Codes by Phage Display

關於噬菌體展示 phage display 可以參考之前這篇：Phage display 和小抗體製造

CX7C library 裡的九個氨基酸長的 peptides 會表現在 T7 phage 的表面，研究者們再把這些 T7 phage 靜脈注射到老鼠體內。T7 phage 進到老鼠體內後會到處遊走，其表面的 peptide 其在遊晃的時候便可找尋和它相結合的蛋白質。他們把 T4 library 分別打入正常老鼠(wildtype)和不同階段的 AD 基轉老鼠裡（三個月、五個月、七個月和九個月大的老鼠），然後再取其海馬迴(hippocampus)做比較，看有哪些 peptides 會大量出現在 AD 基轉老鼠的海馬迴裡，但卻沒出現在正常老鼠裡的，表示它的標靶蛋白是 AD 腦部裡的某個蛋白，可用來做為阿茲海默症的 biomarker，或許也可以用在治療上。比較了之後，他們找到惹 DAG (序列為：CDAGRKQKC，通常以前三個氨基酸為名)。

DAG 出現在所有階段的 AD 基轉老鼠腦內，包括皮質(cortex)和海馬迴(hippocampus)，表示早期的 AD 老鼠腦部就有可以作為 biomarker 的蛋白。接著，他們把 DAG 打入基轉 AD 老鼠裡後做了一連串的螢光染色，試圖找出 DAG 的標靶細胞和標靶蛋白，發現它出現在鄰近有 Aβ 的神經星狀膠質細胞(astrocytes)。另外，DAG 也出現在大腦皮質(cerebrocortex)的血管內皮細胞(biomarker: CD31)，而它標靶蛋白是血管內皮細胞上的 CTGF。這個蛋白質表現在人類和老鼠的腦中，功能是啟動發炎反應和組織修復，腦部受傷後 CTGF 的表現量會上升。他們研究了 CTGF 在腦部的表現，發現和正常老鼠相比，它同樣大量表現在 AD 基轉老鼠的大腦皮質和海馬迴，而且也是出現在 astrocytes，他們也做惹 binding 測試，確認 DAG 的標靶的確是 CTGF。

之後，他們檢測了三、四個月大、Aβ 尚未出現的年輕 AD 基轉老鼠腦部，發現 DAG 大量出現在大腦皮質和海馬迴，主要在其血管內皮細胞，表示 DAG 的標靶是 CTGF 而不是 Aβ。為了確認 DAG 不只作用在老鼠腦部細胞，他們用 AD 患者的幹細胞做 binding 測試，是用 DAG-conjugated Ag-nanoparticle (DAG-AgNP) 去染細胞組織，發現可以看到 DAG。用病患的腦部切片測試的話，DAG-AgNP 則出現在含有大量 Aβ 的海馬迴，用螢光染色的話也可以看到 CTGF 同樣出現在海馬迴，表示 DAG 的標靶蛋白是 CTGF。看到這裡可能會覺得證據不夠有力，不過當他們在 DAG-AgNP 之前先加了 anti-CTGF 的抗體後，DAG-AgNP 的訊號就消失了，表示抗體阻斷惹 DAG-CTGF 的結合。 這裡有一點是我想知道，但是文章裡沒提到的，CTGF 在很多神經性疾病中都被發現表現量升高，而在這篇裡顯示疾病初期就可偵測到大量的 CTGF，我的話會想看到在正常老鼠和 AD 基轉老鼠裡，DAG, CTGF 和 Aβ 在三到九個月大的時候，表現量變化的比較。

最後就是 AD 治療的瓶頸，如何把 DAG 送進腦部？他們把 DAG 和帶有氧化鐵 (iron oxide) 的 nanoparticle 結合後，靜脈注射進九個月大的 AD 基轉老鼠裡，發現它可以進入到老鼠的大腦皮質和海馬迴。文章裡提到，這點可以用來做影像檢測 AD，但是 DAG 如果接了染劑或顯影劑後還能進到腦部嗎？



References:

NNR / Potential Biomarker for Early Detection of Alzheimer's (Nov 2017)

AP Mann et al, Identification of a peptide recognizing cerebrovascular changes in mouse models of Alzheimer’s disease. Nature Communications (2017)
https://www.nature.com/articles/s41467-017-01096-0

Tero AH Järvinen, Chapter 12 - Design of Target-Seeking Antifibrotic Compounds. Methods in Enzymology (2012); doi: 10.1016/B978-0-12-391858-1.00013-7

T Teesalu et al, Chapter 2 - Mapping of Vascular ZIP Codes by Phage Display. Methods in Enzymology (2012)