利用 peptide 檢測早期阿茲海默症

這是一年前的研究了 XD，我在刷臉書的時候看到有興趣但當下沒時間細讀的會先存起來，然後等有時間再打開來看，寫寫分享，然後不知不覺就積了很多沒看的，剛剛翻到這篇才發現竟然已經默默過了一年惹。（淚）

對阿茲海默症有點小了解的大概都知道治療此病的瓶頸主要有兩個，一是無法及早發現，通常發現時，也就是出現輕微失智症狀時(mild cognition impairment, MCI)，已經太晚了，二是藥物無法通過 BBB (blood-brain barrier)，因此目前除了藥物研發的研究，有的是針對如何在症狀未出現時便可即早發現。

動物腦部有一個蛋白是 CTGF (connective tissue growth factor)，主要功能是免疫反應和組織修復，AD 基轉老鼠腦部的 CTGF 會在 Aβ 堆積前出現上升的現象。這篇刊在 Nature Communications 的研究利用 phage display 釣到了一個目標蛋白是 CTGF，長度為九個氨基酸的環形胜肽(cyclic peptide) ，稱為 DAG。

怎麼用 phage display 釣的呢？他們是用 CX7C library，CX7C 是九個氨基酸長的 peptide，第一個和最後一個(也就是第九個)氨基酸是 cysteine，中間七個氨基酸是隨機的，用的是 degenerate codons NNK [註1]。兩端的 Cys 會形成 disulfide bond，使這小段的 peptide 變成一個環狀，用來標靶癌細胞的 iRGD 就是一個例子 [註2]。（iGRD sequence: CRGDKGPDC)

註 1：K = G or T and S = C or G。
CX7C library 製作細節可參考這篇：Tero AH Järvinen 的這篇：Design of Target-Seeking Antifibrotic Compounds

註 2： 之前有不少研究是用 phage display 釣出各個器官的 homing peptides，就是說這些 peptides 只會出現在某些器官，也就是這些器官有其他器官沒有的標靶蛋白或標靶物，可以用來當作器官的 biomarkers。用來穿過癌細胞 iRGD 就是用這個方法找到的，有興趣的可以參考 T Teesalu et al 的這篇：Mapping of Vascular ZIP Codes by Phage Display

關於噬菌體展示 phage display 可以參考之前這篇：Phage display 和小抗體製造

CX7C library 裡的九個氨基酸長的 peptides 會表現在 T7 phage 的表面，研究者們再把這些 T7 phage 靜脈注射到老鼠體內。T7 phage 進到老鼠體內後會到處遊走，其表面的 peptide 其在遊晃的時候便可找尋和它相結合的蛋白質。他們把 T4 library 分別打入正常老鼠(wildtype)和不同階段的 AD 基轉老鼠裡（三個月、五個月、七個月和九個月大的老鼠），然後再取其海馬迴(hippocampus)做比較，看有哪些 peptides 會大量出現在 AD 基轉老鼠的海馬迴裡，但卻沒出現在正常老鼠裡的，表示它的標靶蛋白是 AD 腦部裡的某個蛋白，可用來做為阿茲海默症的 biomarker，或許也可以用在治療上。比較了之後，他們找到惹 DAG (序列為：CDAGRKQKC，通常以前三個氨基酸為名)。

DAG 出現在所有階段的 AD 基轉老鼠腦內，包括皮質(cortex)和海馬迴(hippocampus)，表示早期的 AD 老鼠腦部就有可以作為 biomarker 的蛋白。接著，他們把 DAG 打入基轉 AD 老鼠裡後做了一連串的螢光染色，試圖找出 DAG 的標靶細胞和標靶蛋白，發現它出現在鄰近有 Aβ 的神經星狀膠質細胞(astrocytes)。另外，DAG 也出現在大腦皮質(cerebrocortex)的血管內皮細胞(biomarker: CD31)，而它標靶蛋白是血管內皮細胞上的 CTGF。這個蛋白質表現在人類和老鼠的腦中，功能是啟動發炎反應和組織修復，腦部受傷後 CTGF 的表現量會上升。他們研究了 CTGF 在腦部的表現，發現和正常老鼠相比，它同樣大量表現在 AD 基轉老鼠的大腦皮質和海馬迴，而且也是出現在 astrocytes，他們也做惹 binding 測試，確認 DAG 的標靶的確是 CTGF。

之後，他們檢測了三、四個月大、Aβ 尚未出現的年輕 AD 基轉老鼠腦部，發現 DAG 大量出現在大腦皮質和海馬迴，主要在其血管內皮細胞，表示 DAG 的標靶是 CTGF 而不是 Aβ。為了確認 DAG 不只作用在老鼠腦部細胞，他們用 AD 患者的幹細胞做 binding 測試，是用 DAG-conjugated Ag-nanoparticle (DAG-AgNP) 去染細胞組織，發現可以看到 DAG。用病患的腦部切片測試的話，DAG-AgNP 則出現在含有大量 Aβ 的海馬迴，用螢光染色的話也可以看到 CTGF 同樣出現在海馬迴，表示 DAG 的標靶蛋白是 CTGF。看到這裡可能會覺得證據不夠有力，不過當他們在 DAG-AgNP 之前先加了 anti-CTGF 的抗體後，DAG-AgNP 的訊號就消失了，表示抗體阻斷惹 DAG-CTGF 的結合。 這裡有一點是我想知道，但是文章裡沒提到的，CTGF 在很多神經性疾病中都被發現表現量升高，而在這篇裡顯示疾病初期就可偵測到大量的 CTGF，我的話會想看到在正常老鼠和 AD 基轉老鼠裡，DAG, CTGF 和 Aβ 在三到九個月大的時候，表現量變化的比較。

最後就是 AD 治療的瓶頸，如何把 DAG 送進腦部？他們把 DAG 和帶有氧化鐵 (iron oxide) 的 nanoparticle 結合後，靜脈注射進九個月大的 AD 基轉老鼠裡，發現它可以進入到老鼠的大腦皮質和海馬迴。文章裡提到，這點可以用來做影像檢測 AD，但是 DAG 如果接了染劑或顯影劑後還能進到腦部嗎？



References:

NNR / Potential Biomarker for Early Detection of Alzheimer's (Nov 2017)

AP Mann et al, Identification of a peptide recognizing cerebrovascular changes in mouse models of Alzheimer’s disease. Nature Communications (2017)
https://www.nature.com/articles/s41467-017-01096-0

Tero AH Järvinen, Chapter 12 - Design of Target-Seeking Antifibrotic Compounds. Methods in Enzymology (2012); doi: 10.1016/B978-0-12-391858-1.00013-7

T Teesalu et al, Chapter 2 - Mapping of Vascular ZIP Codes by Phage Display. Methods in Enzymology (2012)