實驗法｜純化蛋白

這篇只是把之前在臉書上寫的整理一下，關於純化帶有 6xHis tag 的蛋白質。

關於真正的純化蛋白，我是今年才學到的，之前做的都只過一個 gravity column，例如 Glutathione column，這篇介紹的是用 Ni-NTA column 來純化 6xHis tag protein，但原理是一樣的。

通常純化蛋白時都會在蛋白的前面加一個 tag，不管是 6xHis, GST 還是 MBP，在 tag 和蛋白中間會有一個 TEV cleavage site (ENLYFQ\S) 是給 TEV protease 切的，它會切在 Q 和 S 中間。

(TEV: Tobacco Etch Virus)

舉例來說，蛋白質可以是這樣：MBP-HHHHHH-ENLYFQ\S-Protein



這邊要注意的是如果要過 His column (也就是 nickel column)，你的蛋白需要帶 6xHis tag。先讓蛋白過 Ni-NTA 把不要的蛋白洗掉，只剩下你的 MBP-6xHis-Protein 會留在 column，然後再用 imidazole 把你的蛋白 elute 出來。



之後加入 TEV protease 把前面的 MBP-6xHis 切掉，然後再過一次 His column 把 MBP-6xHis 挑出來，MBP-6xHis 會留在 column 裡面，而你的蛋白會在出現在 flow-through。

通常蛋白在過了兩次 Ni-NTA 後會乾淨不少，之後想再更乾淨的話可以過 ion exchange column (IEX)，依照蛋白的 pI 質可以過 cation exchange 或是過 anion exchange，通常過到這邊以後已經滿乾淨惹，想再更更更純、更乾淨的話，可以過 size exclusion column (SEC)。

註：之前我都以為 TEV protease 需要用買的，後來到現在的公司後才知道 TEV protease 是可以自己做的呢。把 TEV protease 在 E. coli 裡大量表現後再自己純化，通常只要過一個 His column 後就可以用惹。

上網孤狗也可以找到很多 TEV purification 的 protocol，可以參考 Berkeley University QB3 的步驟，他們是先過一個 Ni-NTA，去鹽後再過 cation exchange column。去鹽的部分可以用 desalting column，也可以用 dialysis，不過我上次純化的時候，在過夜去鹽 dialysis 之後出現 precipitation 的現象，不過我那時也忘了在 dialysis buffer 裡加 BME，不知道跟這有沒有關係。