不知道大家在研究某個蛋白質的時候都是從哪方面著手呢？除了它的 subcellular localization 之外，我通常都是從 protein-protein interactions 著手，如果已經知道是和哪個蛋白質 interact，就會看它是用哪個 domain 和其他蛋白質 interact。
最常用(?)的方法大概是把它切成幾個片段，然後用這些片段去做 co-IP，看哪個片段和其他蛋白質 interact。那要如何決定要怎麼切蛋白質呢？通常我是把氨基酸序列丟到 PROSITE 去看它有哪些 functional domain，如果已經有其他人發表關於這個蛋白質的研究的話，可以先看一下其他人怎麼切的，如果還沒有其他人做，那就丟進 PROSITE 去看看。不過呢，PROSITE 能做的就是看它的 secondary structure。
上個禮拜學到另一個方法，就是看蛋白質的 tertiary structure，找出和它類似結構的蛋白質。這個方法可以用在純化某個蛋白質的時候，你找不到關於純化這個蛋白質的論文，丟進 PROSITE 後只顯示出它是屬於某個 superfamily，但是沒有特別的 domain，這時候可以丟進 Phyre2 去找有類似結構的蛋白質，它會找出在 Protein Data Bank (PDB) 裡結構和你要找的蛋白相似的蛋白質，當然不可能是整個蛋白質的結構都和你要的相同，可能只是某個片段，他會告訴你那些片段和你要找的蛋白質的相似度是多少，然後你再自己判斷你要以哪個蛋白質結構為依據來研究你的蛋白質。
不知道這樣解釋夠不夠清楚，目前手邊沒有可以做示範的蛋白質，如果有人有想要研究的蛋白質的話，可以留言一下，我再示範出來。
也歡迎大家分享自己的研究方法唷~ 😄
其他有用的網站：
European Bioinformatics Institute: 我常用的是它的 Clustal Omega
ExPASy Bioinformatics Resources Portal: 我常用的是它的 ProtParam
UniProt: 可以找到蛋白的結構資訊
Protein Secondary Structure: 各種線上資源的連結
NCBI COBALT: multiple alignment for protein sequences
Cold Spring Harbor (CSH) Protocols: 免費的各種 protocols
CSH Recipes: 各種 buffers 的配方
SnapGene Viewer: 用來看 DNA sequences 的軟體，有些 vector map 會有人已經標好各種 primers 或是 tag，不用自己找自己標，很方便。（有付費版本，可以自己剪貼，但我都用免費只有觀看和標示功能的。）這個也可以用來看定序圖哦，也可以手動改 ATCG。
2018年12月29日 星期六
2018年12月14日 星期五
實驗法｜純化蛋白
這篇只是把之前在臉書上寫的整理一下，關於純化帶有 6xHis tag 的蛋白質。
關於真正的純化蛋白，我是今年才學到的，之前做的都只過一個 gravity column，例如 Glutathione column，這篇介紹的是用 Ni-NTA column 來純化 6xHis tag protein，但原理是一樣的。
通常純化蛋白時都會在蛋白的前面加一個 tag，不管是 6xHis, GST 還是 MBP，在 tag 和蛋白中間會有一個 TEV cleavage site (ENLYFQ\S) 是給 TEV protease 切的，它會切在 Q 和 S 中間。
(TEV: Tobacco Etch Virus)
舉例來說，蛋白質可以是這樣：MBP-HHHHHH-ENLYFQ\S-Protein
這邊要注意的是如果要過 His column (也就是 nickel column)，你的蛋白需要帶 6xHis tag。先讓蛋白過 Ni-NTA 把不要的蛋白洗掉，只剩下你的 MBP-6xHis-Protein 會留在 column，然後再用 imidazole 把你的蛋白 elute 出來。
之後加入 TEV protease 把前面的 MBP-6xHis 切掉，然後再過一次 His column 把 MBP-6xHis 挑出來，MBP-6xHis 會留在 column 裡面，而你的蛋白會在出現在 flow-through。
通常蛋白在過了兩次 Ni-NTA 後會乾淨不少，之後想再更乾淨的話可以過 ion exchange column (IEX)，依照蛋白的 pI 質可以過 cation exchange 或是過 anion exchange，通常過到這邊以後已經滿乾淨惹，想再更更更純、更乾淨的話，可以過 size exclusion column (SEC)。
註：之前我都以為 TEV protease 需要用買的，後來到現在的公司後才知道 TEV protease 是可以自己做的呢。把 TEV protease 在 E. coli 裡大量表現後再自己純化，通常只要過一個 His column 後就可以用惹。
上網孤狗也可以找到很多 TEV purification 的 protocol，可以參考 Berkeley University QB3 的步驟，他們是先過一個 Ni-NTA，去鹽後再過 cation exchange column。去鹽的部分可以用 desalting column，也可以用 dialysis，不過我上次純化的時候，在過夜去鹽 dialysis 之後出現 precipitation 的現象，不過我那時也忘了在 dialysis buffer 裡加 BME，不知道跟這有沒有關係。
關於真正的純化蛋白，我是今年才學到的，之前做的都只過一個 gravity column，例如 Glutathione column，這篇介紹的是用 Ni-NTA column 來純化 6xHis tag protein，但原理是一樣的。
通常純化蛋白時都會在蛋白的前面加一個 tag，不管是 6xHis, GST 還是 MBP，在 tag 和蛋白中間會有一個 TEV cleavage site (ENLYFQ\S) 是給 TEV protease 切的，它會切在 Q 和 S 中間。
(TEV: Tobacco Etch Virus)
舉例來說，蛋白質可以是這樣：MBP-HHHHHH-ENLYFQ\S-Protein
這邊要注意的是如果要過 His column (也就是 nickel column)，你的蛋白需要帶 6xHis tag。先讓蛋白過 Ni-NTA 把不要的蛋白洗掉，只剩下你的 MBP-6xHis-Protein 會留在 column，然後再用 imidazole 把你的蛋白 elute 出來。
之後加入 TEV protease 把前面的 MBP-6xHis 切掉，然後再過一次 His column 把 MBP-6xHis 挑出來，MBP-6xHis 會留在 column 裡面，而你的蛋白會在出現在 flow-through。
通常蛋白在過了兩次 Ni-NTA 後會乾淨不少，之後想再更乾淨的話可以過 ion exchange column (IEX)，依照蛋白的 pI 質可以過 cation exchange 或是過 anion exchange，通常過到這邊以後已經滿乾淨惹，想再更更更純、更乾淨的話，可以過 size exclusion column (SEC)。
註：之前我都以為 TEV protease 需要用買的，後來到現在的公司後才知道 TEV protease 是可以自己做的呢。把 TEV protease 在 E. coli 裡大量表現後再自己純化，通常只要過一個 His column 後就可以用惹。
上網孤狗也可以找到很多 TEV purification 的 protocol，可以參考 Berkeley University QB3 的步驟，他們是先過一個 Ni-NTA，去鹽後再過 cation exchange column。去鹽的部分可以用 desalting column，也可以用 dialysis，不過我上次純化的時候，在過夜去鹽 dialysis 之後出現 precipitation 的現象，不過我那時也忘了在 dialysis buffer 裡加 BME，不知道跟這有沒有關係。
2018年1月14日 星期日
怎樣才算 hard working
對不是我們這個領域的人來說，週末還要到實驗室叫做 hard working，但週末到實驗室其實沒什麼，尤其是如果只是禮拜六來收個實驗，或是禮拜天來用個 inoculation 好隔天可以做 miniprep。真要我週末來待整天，我還無法，會覺得好累，感覺沒放到假，對我就是草莓，我一直都覺得我算是很偷懶的 slacker，尤其跟我們實驗室的中國交換生相比更是(來很久變加拿大人的中國人週末幾乎不會來，除了我老闆)，他們都是週末兩天來一天半的（沒來的半天是因為要買菜），像他們週末還跑 Western 這種事我是不會做的，除非真的有必要（不過到目前為止還沒有）。
但我之前被每天都待到七、八點，週末還都在實驗室待整天的中國人說我真是 hard working 時真是不解我 hard working 在哪？他是說他都快中午才來，他來的時候我做事都做到一半了，但是他待到八、九點，我都六點就走人了啊，而且我週末最多只待半天，除非我真的需要一個人靜一靜才會待比較久。
說到這，想到我研究所時系上同學週末也都是會來的，但也是只待個半天，就是收個實驗或做些簡單的實驗而已。然後從某天開始，隔壁實驗室的兩位同學說，他們覺得週末來實驗並不會做得比較順，做不出來的還是做不出來，並沒有因為週末來就做出來了，做得出來的週末沒來還是做得出來。他們經過比較之後，發現週末有來跟沒來結果並沒有差，實驗進度還是一樣，並沒有變得比較快或比較順，那週末幹嘛來呢？所以之後他們週末就不來了。
又想到我在大學時，在實驗室幫一位博士生做他的 side project，他本來都是早上八、九就點來的，但是從某天開始十點多才來，原因是他發現，他早來是因為想早走，但結果還是待到七、八點才走，那幹嘛早來呢？於是他就改成十點多才進實驗室。
之前 UBC 校長也說，研究生活不用只有工作，還是要有正常人的生活，週末多去交朋友，有些私人時間，多些社交空間，work-life balance 很重要，這也是他的親身經驗，他在研究不順的時候讓自己放鬆一下，過回正常人的生活後，研究就變順了。
好了，其實這篇只是想突然有感而發，覺得其實生活還是很重要的，還是需要 work life balance 才不會 burnout。
#加拿大人真沒競爭力XD
但我之前被每天都待到七、八點，週末還都在實驗室待整天的中國人說我真是 hard working 時真是不解我 hard working 在哪？他是說他都快中午才來，他來的時候我做事都做到一半了，但是他待到八、九點，我都六點就走人了啊，而且我週末最多只待半天，除非我真的需要一個人靜一靜才會待比較久。
說到這，想到我研究所時系上同學週末也都是會來的，但也是只待個半天，就是收個實驗或做些簡單的實驗而已。然後從某天開始，隔壁實驗室的兩位同學說，他們覺得週末來實驗並不會做得比較順，做不出來的還是做不出來，並沒有因為週末來就做出來了，做得出來的週末沒來還是做得出來。他們經過比較之後，發現週末有來跟沒來結果並沒有差，實驗進度還是一樣，並沒有變得比較快或比較順，那週末幹嘛來呢？所以之後他們週末就不來了。
又想到我在大學時，在實驗室幫一位博士生做他的 side project，他本來都是早上八、九就點來的，但是從某天開始十點多才來，原因是他發現，他早來是因為想早走，但結果還是待到七、八點才走，那幹嘛早來呢？於是他就改成十點多才進實驗室。
之前 UBC 校長也說，研究生活不用只有工作，還是要有正常人的生活，週末多去交朋友，有些私人時間，多些社交空間，work-life balance 很重要，這也是他的親身經驗，他在研究不順的時候讓自己放鬆一下，過回正常人的生活後，研究就變順了。
好了，其實這篇只是想突然有感而發，覺得其實生活還是很重要的，還是需要 work life balance 才不會 burnout。
#加拿大人真沒競爭力XD
2017年11月10日 星期五
論文常用字
這篇是之前寫的，這兩天想起來，整理一下後移到這邊來。這裡是一些寫 papers 時常用的字和句型，整理起來以備不時之需。XD
#1. To ____ whether xxx is yyy, we ..... (do what experiments)
determine
examine
test
prove
define
analyze
access
to this end
#2. To ____ that ~~~ (mechanism, etc...)
study
investigate
elucidate
understand
monitor
#3. Previous studies have ____ that ~~; Our data ___ that ~~
show
demonstrate
suggest
indicate
report
find
reveal
implicate
exhibit
support
#4. 總結： ___, the data suggest that ~~~
Collectively
Together
Taken together
In conclusion
In summary
Overall
In essence = basically
#5. 增加/減少：The protein levels (adv) ______
significantly / dramatically / drastically / markedly / substantially / sharply / robustly
increased
bolstered
augmented
enhanced
up-regulated
decreased
reduced
down-regulated
#6. 另外/而且：____, our data show that ~~/ previous studies have shown that ~~
In addition
Furthermore
Moreover
Consistent with ~~
In support of ~~
In line with ~~
#7. 然而： ___, the data showed that ~~
However
Nevertheless
Although
Nonetheless
Despite
In contrast
#8. 輔助副詞
Accordingly
Additionally
Amazingly
Alternatively
Admittedly
Curiously
Conceivably
Collectively
Decisively
Interestingly
Intriguingly
Importantly
Notably
Surprisingly
Significantly
Potentially
Remarkably
Conversely
Subsequently
Profoundly
Distinctly
Profoundly
Impressively
#1. To ____ whether xxx is yyy, we ..... (do what experiments)
determine
examine
test
prove
define
analyze
access
to this end
#2. To ____ that ~~~ (mechanism, etc...)
study
investigate
elucidate
understand
monitor
#3. Previous studies have ____ that ~~; Our data ___ that ~~
show
demonstrate
suggest
indicate
report
find
reveal
implicate
exhibit
support
#4. 總結： ___, the data suggest that ~~~
Collectively
Together
Taken together
In conclusion
In summary
Overall
In essence = basically
#5. 增加/減少：The protein levels (adv) ______
significantly / dramatically / drastically / markedly / substantially / sharply / robustly
increased
bolstered
augmented
enhanced
up-regulated
decreased
reduced
down-regulated
#6. 另外/而且：____, our data show that ~~/ previous studies have shown that ~~
In addition
Furthermore
Moreover
Consistent with ~~
In support of ~~
In line with ~~
#7. 然而： ___, the data showed that ~~
However
Nevertheless
Although
Nonetheless
Despite
In contrast
#8. 輔助副詞
Accordingly
Additionally
Amazingly
Alternatively
Admittedly
Curiously
Conceivably
Collectively
Decisively
Interestingly
Intriguingly
Importantly
Notably
Surprisingly
Significantly
Potentially
Remarkably
Conversely
Subsequently
Profoundly
Distinctly
Profoundly
Impressively
2016年9月1日 星期四
Neuron 人物專訪：Gord Fishell
又是一個因為 out of stock 而得到的新發現嗎？XD
Dr. Fishell 的博士後 Jhumku Kohtz 常用的從某實驗室拿到的 recombinant Shh 用光了，於是跟另一個實驗室要新的來用，但卻做不出來了，之後才想到說原本用的 recombinant Shh 是從 Bacalovirus 生產的，後來用的則是在細菌裡生產的，於是 Kohtz 把兩個一起跑 WB，發現 eukaryote-derived Shh 跑的比較慢，她認為是因為 post-translational modification，而這個 post-translational modification 對 Shh 的 function 很重要。後來他們和 Biogen 合作的時候也證實了，發現 Shh 有 palmitoylation，而且對 Shh 的 activity 很重要。（觀微知著啊，觀微知著~~）
"Efforts focused entirely on examining basic mechanisms are always a hard sell for the public. Without an end goal, such efforts are intrinsically hardest to justify but without them everything from CRISPR to the Higgs Boson would remain undiscovered."
基礎科學的心酸，"a hard sell for the public"..... 可能也是個 hard sell for the funding.....（淚）
原文：Neuron (2016) Q&A - Gord Fishell, Professor & Associate Director, NYU Neuroscience Institute
Dr. Fishell 的博士後 Jhumku Kohtz 常用的從某實驗室拿到的 recombinant Shh 用光了，於是跟另一個實驗室要新的來用，但卻做不出來了，之後才想到說原本用的 recombinant Shh 是從 Bacalovirus 生產的，後來用的則是在細菌裡生產的，於是 Kohtz 把兩個一起跑 WB，發現 eukaryote-derived Shh 跑的比較慢，她認為是因為 post-translational modification，而這個 post-translational modification 對 Shh 的 function 很重要。後來他們和 Biogen 合作的時候也證實了，發現 Shh 有 palmitoylation，而且對 Shh 的 activity 很重要。（觀微知著啊，觀微知著~~）
"Efforts focused entirely on examining basic mechanisms are always a hard sell for the public. Without an end goal, such efforts are intrinsically hardest to justify but without them everything from CRISPR to the Higgs Boson would remain undiscovered."
基礎科學的心酸，"a hard sell for the public"..... 可能也是個 hard sell for the funding.....（淚）
原文：Neuron (2016) Q&A - Gord Fishell, Professor & Associate Director, NYU Neuroscience Institute
2016年7月26日 星期二
Neuron 人物專訪：Michael Ehlers
我滿喜歡看一些人物專訪的，因為可以從別人的人生或人生觀裡得到一些啟發。記得之前在研究所時，每週都會有 seminar，結束之後會有半個小時讓研究生和講者對話，那時候大家最愛問的問題是「你是如何走到現在的位置，或得到目前的成就？」
Dr. Ehlers 的這篇專訪有講到一個點，雖然常常很努力的想讓大家知道，但不在這個領域的人好像我們再怎麼解釋，都無法理解這有多難而且是怎樣大的一個錢坑。
"I wish the general public knew more about how important very basic science is as the foundation of innovation, whether it be new medicines, new therapies, or new technologies. I wish the general public understood just how hard it is to make a new medicine—the time, the cost, the many areas of science that must come together. I wish the general public were more aware of the size and scale of the social and economic impact of brain disorders and placed the same urgency around cures as, say, oncology."
好像很多人都以為，錢投下去就一定會研發出藥來、錢能賺得回來，而且能在幾年內賺回來，這種妄想或幻想不知道哪來的，一個藥能在十年內研發出來都算快的，一堆是花了十幾年的時間和金錢，進入 Phase II 或 Phase III 才發現此藥 GG，所以能在十年內賺回來的都算幸運的，很多是像石頭投入水中就消失不見影的那種。投錢在生技股？佛心來著的吧。
而且以上都還是在 translational science 範圍內，可望用在治療上的，一堆 basic science 是連用在治療上都感覺遙遙無期的研究，但又缺少不可的，這些研究需要花的錢和心力不亞於 translational science，卻常常因為無法立刻看見效用(應用在治療上)而被忽略，或是讓人覺得不重要。（淚）
這篇專訪中有一個小故事滿有趣的，是說他在找 NMDAR 的 binding proteins 時發現用來配 buffer 的 EGTA 用完了，那時是週末又很晚了，於是他決定省略 EGTA (配過的都知道配這很煩，我大學實驗課的時候因為配太久還被 TA 白眼)，沒想到意外發現 calmodulin 在有 Ca2+ 的情況下會 bind NMDAR。（所以這是說偷懶也許會讓人有意外的發現嗎？XD）
Dr. Ehlers 給學生和博士後的建議："I usually advise students and postdocs to pick their advisor rather than strictly their project. Selecting an advisor requires a personality match and there is no easy formula, but the right advisor can make even the most seemingly boring project come to life, and vice versa. I tell young scientists to be fearless and take risks, and aim to tackle big questions, because that is the route to real impact. I encourage students and postdocs to challenge dogma and not assume that established scientists in the field have gotten things right. I like to remind students that most experiments fail, but that it only takes one really great experiment to change the world."
其中第一點我之前有說過：找到適合的老闆很重要。他是說與其挑 project，不如挑適合自己的老闆，和自己合得來的好老闆可以讓無聊的 project 變得有趣。我自己的感覺是雖然我研究所的 project 不如現在的有趣，但是我從我老闆那學到很多，而且他也很樂意花時間指導(不是說現在的老闆不樂意，而是他太忙了)，可能有人不喜歡 micromanagement，但我覺得我指導教授帶學生的鬆緊度剛剛好，至少對我而言啦。
Dr. Ehlers 建議的第二點是要勇於嘗試和挑戰前人的觀點或主流學說，不要總覺得現有的認定就一定是對的。最後一點還滿樂觀的，就是雖然大多數的實驗都是失敗的，但幾個好的實驗就可以改變世界。聽起來很樂觀，但我覺得這點最難做到。 T_____T
原文：Neuron (2016) Q&A - Michael Ehlers, Biogen
Dr. Ehlers 的這篇專訪有講到一個點，雖然常常很努力的想讓大家知道，但不在這個領域的人好像我們再怎麼解釋，都無法理解這有多難而且是怎樣大的一個錢坑。
"I wish the general public knew more about how important very basic science is as the foundation of innovation, whether it be new medicines, new therapies, or new technologies. I wish the general public understood just how hard it is to make a new medicine—the time, the cost, the many areas of science that must come together. I wish the general public were more aware of the size and scale of the social and economic impact of brain disorders and placed the same urgency around cures as, say, oncology."
好像很多人都以為，錢投下去就一定會研發出藥來、錢能賺得回來，而且能在幾年內賺回來，這種妄想或幻想不知道哪來的，一個藥能在十年內研發出來都算快的，一堆是花了十幾年的時間和金錢，進入 Phase II 或 Phase III 才發現此藥 GG，所以能在十年內賺回來的都算幸運的，很多是像石頭投入水中就消失不見影的那種。投錢在生技股？佛心來著的吧。
而且以上都還是在 translational science 範圍內，可望用在治療上的，一堆 basic science 是連用在治療上都感覺遙遙無期的研究，但又缺少不可的，這些研究需要花的錢和心力不亞於 translational science，卻常常因為無法立刻看見效用(應用在治療上)而被忽略，或是讓人覺得不重要。（淚）
這篇專訪中有一個小故事滿有趣的，是說他在找 NMDAR 的 binding proteins 時發現用來配 buffer 的 EGTA 用完了，那時是週末又很晚了，於是他決定省略 EGTA (配過的都知道配這很煩，我大學實驗課的時候因為配太久還被 TA 白眼)，沒想到意外發現 calmodulin 在有 Ca2+ 的情況下會 bind NMDAR。（所以這是說偷懶也許會讓人有意外的發現嗎？XD）
Dr. Ehlers 給學生和博士後的建議："I usually advise students and postdocs to pick their advisor rather than strictly their project. Selecting an advisor requires a personality match and there is no easy formula, but the right advisor can make even the most seemingly boring project come to life, and vice versa. I tell young scientists to be fearless and take risks, and aim to tackle big questions, because that is the route to real impact. I encourage students and postdocs to challenge dogma and not assume that established scientists in the field have gotten things right. I like to remind students that most experiments fail, but that it only takes one really great experiment to change the world."
其中第一點我之前有說過：找到適合的老闆很重要。他是說與其挑 project，不如挑適合自己的老闆，和自己合得來的好老闆可以讓無聊的 project 變得有趣。我自己的感覺是雖然我研究所的 project 不如現在的有趣，但是我從我老闆那學到很多，而且他也很樂意花時間指導(不是說現在的老闆不樂意，而是他太忙了)，可能有人不喜歡 micromanagement，但我覺得我指導教授帶學生的鬆緊度剛剛好，至少對我而言啦。
Dr. Ehlers 建議的第二點是要勇於嘗試和挑戰前人的觀點或主流學說，不要總覺得現有的認定就一定是對的。最後一點還滿樂觀的，就是雖然大多數的實驗都是失敗的，但幾個好的實驗就可以改變世界。聽起來很樂觀，但我覺得這點最難做到。 T_____T
原文：Neuron (2016) Q&A - Michael Ehlers, Biogen
2015年5月25日 星期一
給研究生的建議
這兩天在 Cell Neuron 看到這一篇美國西北大學教授 Dr. Raman 寫的文章 "How to Be a Graduate Advisee"，覺得滿有意思的，在念研究所的可以參考。在大學最後一年，已經一腳踏進來，另一腳還在猶疑要不要踏進來的也可以看看。已經踏進來走到一半，不知道能不能繼續走下去，也沒勇氣走別條路的看了以後也許會有新方向。文章裡面有提到幾點我覺得可以讓在研究領域的人思考看看的，其他的有些我覺得應該大家都知道，例如每個人適合的教授和指導方式不一樣，認識自己後再去找適合自己的之類的，所以有興趣的再自己看全文吧。
On Doing Science (在做科學上)
The science you are doing is the real thing: 你現在在做的就是真正的科學，若有結果出來是可以發表的，即使只是大四的一個小 project。通常加拿大的大四學生可以修一堂整年的研究計劃課，不是每個人都可以修的，要成績夠也要有教授願意指導你，通常教授會給的多是研究生主要計畫的 side project，是有自己的 hypothesis，順利的話一年可以做出來，甚至可以發表在期刊論文中，對於以後申請研究所或 funding 和獎學金，甚至找工作等等都會有幫助。雖然不需要每天全天都到實驗室，但是那就是真實的研究生活，如果你以後要繼續走研究這條路，大四時期的研究經驗其實就已經是未來可預見的研究生活了，所以想做研究的話，大四的時候可以修這堂課來看看，有的學生修了以後就發現這不是他要的。（然後就改唸醫學院？）
Do not get yourself accustomed to failure: 我覺得這是很重要的一點，因為我常常會忘記(羞)。記得以前大四的指導教授說過一句話 -- "Research is 99% of failure and 1% of luck." 那時在場聽的人都深有同感阿，我想大多做研究的人也有這個感覺吧。研究最讓人沮喪的地方就是大多數的時候都是失敗的，然後再一點一點 troubleshooting，想辦法用不同的方法去證明你的理論是對的，或去了解生命的奧秘（我是說真的，不是在說什麼口號阿），也因為太常失敗了，一不注意就習慣了，然後某天才突然發現怎麼努力了這麼久好像還是在原地踏步，這時候就是你該認真思考的時候了，是不是你的 troubleshooting 有問題，該多看看期刊論文了，或是該找人聊聊。
"The worst thing that can happen to you scientifically is to get used to going into the lab, doing a procedure in a fixed way, getting no useful result, and going home, with the sense that that is all that science is. You must see movement on your research, not necessarily as daily data, but as a sense that what you did today gets you closer to an outcome. Stasis is your enemy; movement is your friend."
當你發現你做了好久都沒有得到有用的結果的時候，就該好好警醒自己一下是不是不小心習慣失敗了。
Don’t worry about worrying: 會緊張是好事，表示你有在警惕自己，你有在用心面對挑戰，無須為自己會緊張而煩惱。
Use your resources: 資源不只是物質或金錢上的，和指導教授、同學或實驗室的其他成員的聊天討論是，Journal Club 也是(如果你沒多餘的精力找其他和自己研究不甚相關的輪文來看，參加 JC 是很好逼自己吸收新資訊的管道)，seminar 更是(通常系上每個禮拜都會有一場)，也許透過這些交流會意外發現解決實驗困境的方法。
Pay attention to unusual: 如果你覺得你的實驗結果哪裡怪怪的，那就是哪個地方真的有問題。要避免這個情況發生，就是在設計實驗的時候清楚了解你做這個實驗的目的是什麼，你預期得到的結果是什麼，可能的其它結果是什麼，這樣當出現不是你要的結果的時候，就比較能夠知道是哪裡出問題。（但根據我的經驗，最常遇到的就是出現不是你預期的結果就算了，而且最該死的是那個結果還是你解釋不出來的，偏偏又問天無語，然後就卡住了。）
On Advisors and Mentorship (在指導上)
Remember that you are interviewing all the time: 這點比較困難，因為隨時隨地都當成自己在面試也太緊繃了，不過至少在做報告和 presentation 上面多做點準備吧，不要人家的問題一問三不知，尤其自己的研究還不知道的話，那真的會給人不好的印象吧。其他大概就是多和人討論交流，至少要做出熱心助人、願意花時間幫人家 troubleshooting 的形象吧，就算是假掰也是有助益的。
Cultivate the ability to get inspired: 這點是指看到實驗室其他成員的成功，要見賢思齊，一間實驗室裡成功是會傳染的，在那個環境氛圍裡，你自然就會變得和大家一樣。而你的成功是實驗室的，實驗室的成功也是你的，怎麼說呢？一間實驗室會有成就，必是大家創造出來的，大家都發了好 paper，於是造就了實驗室的好名聲，而實驗室的好名聲，也等於是證明自己是個好咖，懂吧？不然大家為何想要擠進有名氣的實驗室呢？就好像大家想擠進名校的心理一樣，圖的不就是「阿，你是那間實驗室出來的，那一定很厲害囉！」這個評價吧。
On Perspective on the Scientific Life (在科學這條路上)
Hold your ideals: 莫忘初衷，想想你為什麼會想念研究所或想當科學家，你想從中得到或學習到什麼？你得到或學到了嗎？如果沒有，就做些什麼讓自己更好繼而得到你想到的。
Maintain your humanity: 研究生活是不可能固定朝九晚五的，我想大家都同意吧！但好處是它是彈性的，你可以自己安排自己的實驗時間。重要的是工作的時間認真工作，剩下的時間也不要忘了認真生活。(不管哪個行業都該如此吧！)
Become a scholar: 多唸、多思考、多討論，審慎分析後再做決定。（套它的話也許比較清楚︰"Being a scholar involves learning to reflect deeply before making decisions, evaluating facts and weighing evidence, considering other points of view with minimal bias, and not picking what is gratifying in the moment but selecting what is adaptive in the long run, both for yourself and for others."）
Never be afraid to change your mind in the face of new evidence: 這點我覺得是最難的。科學研究是很多變的，如我之前所說的，很多時候出來的結果不是你要的，或是你無法解釋的，但是作者說，別害怕，"It isn't the end of the world." (那不是世界末日阿~) (只是芥末日而已) (這個當頭耍冷是...？) (阿阿對不起，忍不住就....)
講是這樣講，當面臨到畢業的壓力，尤其是博士研究，我在那個當下覺得那就是世界末日阿阿阿~ 畢竟畢不了業要怎麼辦？那麼多年的時間不就完了嗎？說真的很想哭阿~ （不要跟我說只有我想哭，我才不信！）
作者想說的是，也許那不是你要的結果，但那也是一個結果（套句我前老闆遇到這個情形常說的話 -- "It is what it is."），也許在你仔細分析之後會發現那是個意想不到的新發現。(作者真樂觀阿~) (能繼續做研究還能當上教授的都很樂觀吧？例如我前老闆....）
"Listen to what the data are telling you, even if it is not what you expect."
如果不是你預期的結果但帶給你新發現，那就不要害怕去改變你的方向，這是作者想說的。然後他也說了，這也可以應用到其他方面，例如你發現這個實驗室不適合你，那就換一個，以後你會感謝自己做了這個決定；如果你覺得有比唸博士對你未來更好的事，那就去做。(這是我在唸博士期間最想做的事啊，只可惜我還沒找到那是什麼事就匆匆忙忙結束了，但是肯定有！) (其實我那時很想改做服務業阿，只是找不到方向，又不敢冒險換條路走(畢竟我的一技之長就只有做實驗阿)，我是俗辣，嗚嗚~) (其實現在還是滿想找個 part-time 的服務業嘗試看看的，搞不好更適合我啊，誰知道呢~) (結果只是實驗室待悶了想來個大爆炸？)
最後，想以過來人的經驗跟想(或考慮)踏進這條不歸路的人說︰在連一腳都還沒踏進來之前，先找一間實驗室認真做一個 project 試試看，如果真的覺得好玩再進來，怎樣叫覺得好玩？就是你每天都想進實驗室，看看你今天有沒有辦法成功證明你的假設，你有足夠的熱情去讓一次次的失敗和沮喪給消磨，你會想唸很多 papers 只是為了想要尋求可能的解答。如果不是這樣，你就再多想想吧。博士這條路，沒事還是不要隨便進來比較好，因為花的不只是金錢，還有時間，而且花了那麼多時間畢不畢得了業還不知道，尤其是在最後一年，如果還得不到你想要的結果，你真的會覺得那是世界末日，而不是只是芥末日。（作者的樂觀也許在博士研究的前兩年還會有，到後面兩年就樂觀不起來了，但是如果你是個極度樂觀的人，那你也許是適合做研究的例外。）
On Doing Science (在做科學上)
The science you are doing is the real thing: 你現在在做的就是真正的科學，若有結果出來是可以發表的，即使只是大四的一個小 project。通常加拿大的大四學生可以修一堂整年的研究計劃課，不是每個人都可以修的，要成績夠也要有教授願意指導你，通常教授會給的多是研究生主要計畫的 side project，是有自己的 hypothesis，順利的話一年可以做出來，甚至可以發表在期刊論文中，對於以後申請研究所或 funding 和獎學金，甚至找工作等等都會有幫助。雖然不需要每天全天都到實驗室，但是那就是真實的研究生活，如果你以後要繼續走研究這條路，大四時期的研究經驗其實就已經是未來可預見的研究生活了，所以想做研究的話，大四的時候可以修這堂課來看看，有的學生修了以後就發現這不是他要的。（然後就改唸醫學院？）
Do not get yourself accustomed to failure: 我覺得這是很重要的一點，因為我常常會忘記(羞)。記得以前大四的指導教授說過一句話 -- "Research is 99% of failure and 1% of luck." 那時在場聽的人都深有同感阿，我想大多做研究的人也有這個感覺吧。研究最讓人沮喪的地方就是大多數的時候都是失敗的，然後再一點一點 troubleshooting，想辦法用不同的方法去證明你的理論是對的，或去了解生命的奧秘（我是說真的，不是在說什麼口號阿），也因為太常失敗了，一不注意就習慣了，然後某天才突然發現怎麼努力了這麼久好像還是在原地踏步，這時候就是你該認真思考的時候了，是不是你的 troubleshooting 有問題，該多看看期刊論文了，或是該找人聊聊。
"The worst thing that can happen to you scientifically is to get used to going into the lab, doing a procedure in a fixed way, getting no useful result, and going home, with the sense that that is all that science is. You must see movement on your research, not necessarily as daily data, but as a sense that what you did today gets you closer to an outcome. Stasis is your enemy; movement is your friend."
當你發現你做了好久都沒有得到有用的結果的時候，就該好好警醒自己一下是不是不小心習慣失敗了。
Don’t worry about worrying: 會緊張是好事，表示你有在警惕自己，你有在用心面對挑戰，無須為自己會緊張而煩惱。
Use your resources: 資源不只是物質或金錢上的，和指導教授、同學或實驗室的其他成員的聊天討論是，Journal Club 也是(如果你沒多餘的精力找其他和自己研究不甚相關的輪文來看，參加 JC 是很好逼自己吸收新資訊的管道)，seminar 更是(通常系上每個禮拜都會有一場)，也許透過這些交流會意外發現解決實驗困境的方法。
Pay attention to unusual: 如果你覺得你的實驗結果哪裡怪怪的，那就是哪個地方真的有問題。要避免這個情況發生，就是在設計實驗的時候清楚了解你做這個實驗的目的是什麼，你預期得到的結果是什麼，可能的其它結果是什麼，這樣當出現不是你要的結果的時候，就比較能夠知道是哪裡出問題。（但根據我的經驗，最常遇到的就是出現不是你預期的結果就算了，而且最該死的是那個結果還是你解釋不出來的，偏偏又問天無語，然後就卡住了。）
On Advisors and Mentorship (在指導上)
Remember that you are interviewing all the time: 這點比較困難，因為隨時隨地都當成自己在面試也太緊繃了，不過至少在做報告和 presentation 上面多做點準備吧，不要人家的問題一問三不知，尤其自己的研究還不知道的話，那真的會給人不好的印象吧。其他大概就是多和人討論交流，至少要做出熱心助人、願意花時間幫人家 troubleshooting 的形象吧，就算是假掰也是有助益的。
Cultivate the ability to get inspired: 這點是指看到實驗室其他成員的成功，要見賢思齊，一間實驗室裡成功是會傳染的，在那個環境氛圍裡，你自然就會變得和大家一樣。而你的成功是實驗室的，實驗室的成功也是你的，怎麼說呢？一間實驗室會有成就，必是大家創造出來的，大家都發了好 paper，於是造就了實驗室的好名聲，而實驗室的好名聲，也等於是證明自己是個好咖，懂吧？不然大家為何想要擠進有名氣的實驗室呢？就好像大家想擠進名校的心理一樣，圖的不就是「阿，你是那間實驗室出來的，那一定很厲害囉！」這個評價吧。
On Perspective on the Scientific Life (在科學這條路上)
Hold your ideals: 莫忘初衷，想想你為什麼會想念研究所或想當科學家，你想從中得到或學習到什麼？你得到或學到了嗎？如果沒有，就做些什麼讓自己更好繼而得到你想到的。
Maintain your humanity: 研究生活是不可能固定朝九晚五的，我想大家都同意吧！但好處是它是彈性的，你可以自己安排自己的實驗時間。重要的是工作的時間認真工作，剩下的時間也不要忘了認真生活。(不管哪個行業都該如此吧！)
Become a scholar: 多唸、多思考、多討論，審慎分析後再做決定。（套它的話也許比較清楚︰"Being a scholar involves learning to reflect deeply before making decisions, evaluating facts and weighing evidence, considering other points of view with minimal bias, and not picking what is gratifying in the moment but selecting what is adaptive in the long run, both for yourself and for others."）
Never be afraid to change your mind in the face of new evidence: 這點我覺得是最難的。科學研究是很多變的，如我之前所說的，很多時候出來的結果不是你要的，或是你無法解釋的，但是作者說，別害怕，"It isn't the end of the world." (那不是世界末日阿~) (只是芥末日而已) (這個當頭耍冷是...？) (阿阿對不起，忍不住就....)
講是這樣講，當面臨到畢業的壓力，尤其是博士研究，我在那個當下覺得那就是世界末日阿阿阿~ 畢竟畢不了業要怎麼辦？那麼多年的時間不就完了嗎？說真的很想哭阿~ （不要跟我說只有我想哭，我才不信！）
作者想說的是，也許那不是你要的結果，但那也是一個結果（套句我前老闆遇到這個情形常說的話 -- "It is what it is."），也許在你仔細分析之後會發現那是個意想不到的新發現。(作者真樂觀阿~) (能繼續做研究還能當上教授的都很樂觀吧？例如我前老闆....）
"Listen to what the data are telling you, even if it is not what you expect."
如果不是你預期的結果但帶給你新發現，那就不要害怕去改變你的方向，這是作者想說的。然後他也說了，這也可以應用到其他方面，例如你發現這個實驗室不適合你，那就換一個，以後你會感謝自己做了這個決定；如果你覺得有比唸博士對你未來更好的事，那就去做。(這是我在唸博士期間最想做的事啊，只可惜我還沒找到那是什麼事就匆匆忙忙結束了，但是肯定有！) (其實我那時很想改做服務業阿，只是找不到方向，又不敢冒險換條路走(畢竟我的一技之長就只有做實驗阿)，我是俗辣，嗚嗚~) (其實現在還是滿想找個 part-time 的服務業嘗試看看的，搞不好更適合我啊，誰知道呢~) (結果只是實驗室待悶了想來個大爆炸？)
最後，想以過來人的經驗跟想(或考慮)踏進這條不歸路的人說︰在連一腳都還沒踏進來之前，先找一間實驗室認真做一個 project 試試看，如果真的覺得好玩再進來，怎樣叫覺得好玩？就是你每天都想進實驗室，看看你今天有沒有辦法成功證明你的假設，你有足夠的熱情去讓一次次的失敗和沮喪給消磨，你會想唸很多 papers 只是為了想要尋求可能的解答。如果不是這樣，你就再多想想吧。博士這條路，沒事還是不要隨便進來比較好，因為花的不只是金錢，還有時間，而且花了那麼多時間畢不畢得了業還不知道，尤其是在最後一年，如果還得不到你想要的結果，你真的會覺得那是世界末日，而不是只是芥末日。（作者的樂觀也許在博士研究的前兩年還會有，到後面兩年就樂觀不起來了，但是如果你是個極度樂觀的人，那你也許是適合做研究的例外。）
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