簡單檢測新冠病毒抗體

這篇研究提供了簡易的檢測方法，而且有詳細的 protocol，不過還沒有經過 peer-review (這篇之後在五月時刊在 Nature Medicine)，研究團隊是在紐約的 Icahn School of Medicine at Mount Sinai。總之非常簡單，有在純化蛋白和做 ELISA 的實驗室都可以做到，不需要 P3 實驗室，就差能不能自己抽血而已。（好想試 XD）

主要是純化抗原，然後用 ELISA 檢測人體內是否有新冠病毒的抗體，之前澳洲得那篇研究顯示在症狀開始後第七天，患者血液裡可以測到 IgM，這篇則是在症狀開始的第三天就可以檢測到抗體。（如果不懂抗體檢測的，可以去看中研院的那篇解釋。XD）

相關文章：武漢肺炎輕症患者體內的免疫反應

抗原：
1. Spike-thrombin-foldon-6xHis
2. SS-RBD-6xHis

- SARS-CoV-2 Spike protein (full-length): M1-P1213; GenBank MN908947.3
- RBD (receptor-binding domain): R319-F541
- SS: signal peptide (M1-S14)
- thrombin: thrombin cleavage site
- foldon: T4 foldon (trimer)

Expressing vectors:
1. mammalian: pCAGGS; Epi293F cells
2. baculovirus: pFastBacDual

Purification:
1. Ni-NTA (room temp)
2. Buffer exchange to PBS

Human serum samples:
1. 大概五十個血清庫裡的檢體，年齡範圍在 20 到 65 歲以上，應該都是健康個體，是用來檢測 ELISA 的背景訊號的，確認檢測的 specificity。
2. 三位康復患者的血清
3. 十二位新冠病毒急性患者的血清

患者血清檢體：
1. 新冠病毒患者症狀開始後第二、四、六和二十天
2. 新冠病毒患者康復後(同個體)：症狀開始後第三十天
3. 冠狀病毒 NL63 和 229E 的患者：NL63 也是用 ACE2
4. 其他傳染病患者康復後：包括登革熱患者

註：會引起疾病的人類冠狀病毒至少有七種，其中有四種是全球季節性的，未引起輕微的呼吸道疾病，包括有 HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 和 HCoV-229E，其中 NL63 和 229E 為 alphacoronavirus，另外兩個則是 betacoronavirus。會引起重症的 SARS 和 MERS，以及目前的 SARS-CoV-2 也是 betacoronavirus。

ELISA:
1. Coating: 2 ug/ml (in PBS), 50 ul/well, O/N at 4C
2. Blocking: 3% milk (PBS-T), 1h at room temp
3. Serum: diluted in 1% milk/PBS-T, 2 hrs at room temp
4. 2'Ab: goat-anti-human IgG HRP (1:3000, in PBS-T), 1 h at room temp


Figure / Reactivity of control and SARS-CoV-2 convalescent sera to different spike antigens (Amanat et al, medRxiv 2020)


結果：

1. 在 mammalian cells 裡的表現竟然比較好，mRBD (mammalian RBD) 可以達到 25-50 mg/L，mSpike (mammalian Spike) 也有 5 mg/L，RBD 的表現在 insect cells (iRBD) 則只有 1.5 mg/L，iSpike (insect Spike) 也只有 0.5 mg/L。

2. 在 insect cells 裡表現的 RBD 大小比在動物細胞裡較小，可能是因為在動物細胞裡表現的有被醣化，所以在蛋白膠上顯現的 band 會比較高。

3. 症狀出現後第三天就可以測到抗體

4. 所有新冠患者的血清都和 Spike 還有 RBD 有強烈反應，對 Spike 的反應比 RBD 強，其他傳染病患者的血清則沒反應。

5. 用 mRBD 和 mSpike 測出來的康復患者血清和健康個體血清的差距比較大，相較於 iRBD 和 iSpike，差距比較顯著。

6. 冠狀病毒 299E 和 NL63 患者的血清也對新冠病毒的 Spike 和 RBD 沒反應，表示沒有 cross-reactivity。

7. ELISA 的結果也可以分辨出其他傳染病患者和康復後的新冠患者。

8. 抗體 CR3022 對 mSpike 和 mRBD 有強烈反應。（關於 CR3022 可參考這篇：近期和新冠病毒抗體相關的研究）

9. 那五十幾個血清庫裡的血清對 mRBD 和 mSpike 沒反應，但是大多數卻對 229E 和 NL63 的 Spike protein 有強烈反應。

10. 有反應的抗體種類為 IgG3, IgM 和 IgA

11. 基於安全考量，他們也是惹 heat inactive serum，效果和沒有 heat-inactivated treated serum 差不多，一樣可以測到抗體，表示不需要 P3 實驗室就可以做。

12. 有不少新冠病毒康復患者的血清可以中和病毒，實驗結果顯示可以抑制病毒感染，這和 US CDC Okba et al 發表的結果是一致的。



Article:

Science / New blood tests for antibodies could show true scale of coronavirus pandemic (March 2020)


Papers:

F Amanat et al, A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine (2020)

F Amanat et al, A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in human. medRxiv (2020)

Okba et al, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2−Specific Antibody Responses in Coronavirus Disease 2019 Patients. US CDC Emerging Infectious Diseases (2020)

實驗法｜純化蛋白

這篇只是把之前在臉書上寫的整理一下，關於純化帶有 6xHis tag 的蛋白質。

關於真正的純化蛋白，我是今年才學到的，之前做的都只過一個 gravity column，例如 Glutathione column，這篇介紹的是用 Ni-NTA column 來純化 6xHis tag protein，但原理是一樣的。

通常純化蛋白時都會在蛋白的前面加一個 tag，不管是 6xHis, GST 還是 MBP，在 tag 和蛋白中間會有一個 TEV cleavage site (ENLYFQ\S) 是給 TEV protease 切的，它會切在 Q 和 S 中間。

(TEV: Tobacco Etch Virus)

舉例來說，蛋白質可以是這樣：MBP-HHHHHH-ENLYFQ\S-Protein



這邊要注意的是如果要過 His column (也就是 nickel column)，你的蛋白需要帶 6xHis tag。先讓蛋白過 Ni-NTA 把不要的蛋白洗掉，只剩下你的 MBP-6xHis-Protein 會留在 column，然後再用 imidazole 把你的蛋白 elute 出來。



之後加入 TEV protease 把前面的 MBP-6xHis 切掉，然後再過一次 His column 把 MBP-6xHis 挑出來，MBP-6xHis 會留在 column 裡面，而你的蛋白會在出現在 flow-through。

通常蛋白在過了兩次 Ni-NTA 後會乾淨不少，之後想再更乾淨的話可以過 ion exchange column (IEX)，依照蛋白的 pI 質可以過 cation exchange 或是過 anion exchange，通常過到這邊以後已經滿乾淨惹，想再更更更純、更乾淨的話，可以過 size exclusion column (SEC)。

註：之前我都以為 TEV protease 需要用買的，後來到現在的公司後才知道 TEV protease 是可以自己做的呢。把 TEV protease 在 E. coli 裡大量表現後再自己純化，通常只要過一個 His column 後就可以用惹。

上網孤狗也可以找到很多 TEV purification 的 protocol，可以參考 Berkeley University QB3 的步驟，他們是先過一個 Ni-NTA，去鹽後再過 cation exchange column。去鹽的部分可以用 desalting column，也可以用 dialysis，不過我上次純化的時候，在過夜去鹽 dialysis 之後出現 precipitation 的現象，不過我那時也忘了在 dialysis buffer 裡加 BME，不知道跟這有沒有關係。