基因編輯嬰兒 -- 所以 CCR5 到底長怎樣？

關於中國基因編輯嬰兒的新聞大家大概已經看了好幾天了吧。賀建奎改的是 CCR5 (C-C chemokine receptor type 5)，到底是消除這個基因，還是改成它的突變 CCR5 δ32 呢？看了那麼多的資訊，相信很多人都學到 CCR5 和 CXCR4 是免疫 T cells 細胞表面的 co-receptors，HIV 病毒透過其表面的醣蛋白 gp120 和免疫細胞的 CCR5 或 CXCR4（或是兩者）相結合後進入 T 細胞。

CCR5 RefSeq: NP_000570.1
CCR5 UniProtKB: P51681


Figure: CCR5 有七個 TM，三個 ECL (extracellular loop) 和三個 ICL (intracellular loop)，N-terminus 在細胞外，C-terminus 在細胞內。(C Blanpain et al, Blood 2000 [4])

所以 CCR5 δ32 到底是怎樣呢？CCR5 是一個長為 352 個氨基酸的蛋白質，表現在免疫 T 細胞的表面，屬於 GPCR 的一種，有七個 transmembrane (TM) regions。CCR5 δ32 的意思是 CCR5Δ32，Δ 在基因上或蛋白質上的意思就是 deletion 的意思，Δ32 就是有 32 個 bp (base pair) 被 delete 掉了，就是少惹 32 個 bp 的意思(感覺在講廢話 XD)。這會有什麼影響呢？稍微了解 DNA 和 codon 的都知道 condon 是三個 bp 為一組轉成一個氨基酸，所以如果是三的倍數的 bp 被消失的話就是少了幾個氨基酸，但如果是非三的倍數，例如是 32 個 bp 被消失的話則會造成 frame shift，也就是整個氨基酸序列會大挪移。CCR5Δ32 裡被消失的那 32 個 bp 使得 stop codon (TGA) 提早出現了，造成尾端(C-terminal)的 168 個氨基酸消失了，第二個 extracellular loop 只剩一半，連帶著後面的三個 TM regions 不見了 [1]。


Figure: CCR5Δ32 中失去的那 32 個 bp (M Samson et al, Nature 1996 [1])

因為這 32 bp deletion，整個蛋白質只剩一半，無法形成有功能性的 receptor，因此對 HIV 免疫。是說我孤狗了一下，發現 HIV gp120 的 binding site 是 CCR5 的最頭端 N-terminal 細胞外的那一小段 (residue 1-30) [2]，那為什麼帶有 CCR5Δ32 突變的人可以免於 HIV 感染啊？他們的 CCR5 還是有 HIV 的 binding site 啊不是嘛？CCR5 有兩個預測的 disulfide bonds , C20-C269 和 C101-C178，有研究顯示這兩個 disulfide bonds 連結惹 ECL，可以維持 CCR5 的整體結構和功能，C20A, C101A 和 C269A 的突變降低惹 CCR5 的功能和 HIV 感染 [3, 4]。其中的 C269 位於 CCR5Δ32 裡被消失的那一半。另外，CCR5Δ32 在細胞實驗中的表象量也比較低。

>NP_000570.1 MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAARLLPPLYSLVFIFGFVGNMLVILILINCKRLKSMTDIYLLNLAISDLFFLLTVPFWAHYAAAQWDFGNTMCQLLTGLYFIGFFSGIFFIILLTIDRYLAVVHAVFALKARTVTFGVVTSVITWVVAVFASLPGIIFTRSQKEGLHYTCSSHFPYSQYQFWKNFQTLKIVILGLVLPLLVMVICYSGILKTLLRCRNEKKRHRAVRLIFTIMIVYFLFWAPYNIVLLLNTFQEFFGLNNCSSSNRLDQAMQVTETLGMTHCCINPIIYAFVGEKFRNYLLVFFQKHIAKRFCKCCSIFQQEAPERASSVYTRSTGEQEISVGL

>CCR5CCR5-δ32
MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAARLLPPLYSLVFIFGFVGNMLVILILINCKRLKSMTDIYLLNLAISDLFFLLTVPFWAHYAAAQWDFGNTMCQLLTGLYFIGFFSGIFFIILLTIDRYLAVVHAVFALKARTVTFGVVTSVITWVVAVFASLPGIIFTRSQKEGLHYTCSSHFPYIKDSHLGAGPAAACHGHLLLGNPKNSASVSK

（沒有 highlight 的序列是正常和突變不同的地方，紅色 C 是預測會成 disulfide bond。）

然後我剛看了一下賀做的 CRISPR，他是說露露的是 CCR5 K/O，但是他又寫 +1bp/-4bp，是說只有 3bp deletion 嗎？(*) 然後娜娜的是 in-frame 15bp deletion，不知道它的 in-frame 15 bp deletion 是指哪裡到哪裡，所以變成是只少了五個氨基酸的突變種嗎？我覺得這兩個都和天然的 CCR5Δ32 差很多啊。（對了，他展示的定序圖裡，娜娜的訊號也太雜了吧，他竟然能讀出 ATCG 是哪個？是我就會要求重新定序。）

* 後來看了尼安德塔人石器匠的解釋，+1bp/-4bp 是指兩個 alleles，一個是 +1bp，另一個是 -4bp，所以兩個 alleles 都有 frame shift，slides 裡出現的定序圖中那個箭頭不知道是指 +1bp 的還是 +4bp，不知道 frame shift 後整個氨基酸序列變怎樣，真的出現 premature stop codon 而變成 K/O 惹嗎？不管怎樣，我覺得這個情況更糟呀。



然後孤狗的時候，發現在 2016 年的時候中國已經有人做過人類胚胎的 CCR5Δ32，用的是 3PN embryo，發表在 Journal of Assisted Reproduction and Genetics (X Kang et al, 2016)，那個論文裡面編輯成功的胚胎中，其定序結果的確跟天然的 CCR5Δ32 相同，而不是像賀的這樣。那篇是用了兩種，一種是有提供 donor template 的 HDR，一種是沒有的 NHEJ。HDR 的成功率很低，最高只有 15% 的胚胎編輯成功。NHEJ 則滿高的，但是出現其他種類的 mutation 也很高。他們檢測了 28 個他們認為會出現 off-target 的地方，每個出現的 mismatch 大約有 2-4 個，未發現有 indel (insertion & deletion)。這個研究因為用的是 3PN embryo，所以三天後就死了。


Figure: HDR 和 NHEJ 的差別 (JR Guitart Jr. et al, J Inves Derm 2016)

不管賀的基因編輯嬰兒是怎樣，我還是覺得在 off-site target 解決之前不適合用在嬰兒身上，唯一的例外是用在很明顯的基因疾病。另外，就算是 CRISPR 技術很成熟了，我還是反對用在治療以外的地方，例如改善外觀。（雖然我覺得這種非單一基因的很難做到，尤其我們還無法掌握是哪些基因調控這些。）



相關閱讀：關於 CRISPR-Cas9


References:

1. M Samson et al, Resistance to HIV-1 infection in Caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR-5 chemokine receptor gene. Nature (1996)

2. EG Cornier et al, Specific interaction of CCR5 amino-terminal domain peptides containing sulfotyrosines with HIV-1 envelope glycoprotein gp120. PNAS (2000)

3. C Blanpain et al, Extracellular cysteines of CCR5 are required for chemokine binding, but dispensable for HIV-1 coreceptor activity. JBC (1999)

4. C Blanpain et al, Multiple nonfunctional alleles of CCR5 are frequent in various human populations. Blood (2000)