關於 CRISPR-Cas9

（這篇只是把之前幫別人寫的整理一下）

CRISPR 的全名是 clustered regularly interspaced palindromic repeats，是古生菌(archaea)的基因體(genome)裡重複的 DNA 片段，當初發現的是西班牙的研究生 Francisco Mojica JM Mojica。1992 年，當他在研究 Haloferax mediterranei 的時候，發現了十四個不尋常的 DNA 片段，每個約 30 bp，從 5' 讀或是從 3' 讀幾乎都一樣(也就是 palindromic)，大概每 35 bp 會重複一次。他對這些重複的 DNA 片段充滿好奇和興趣，並且決定研究這些 DNA 片段，只是研究室缺少 funding (幫 QQ)，不過還是花了近十年的時間持續研這些 DNA 片段的功用。2012 年的時候，這些重複的 DNA 片段正式被命名為 CRISPR。Cas (CRISPR-associated protein) 則是其一種切割 DNA 的酵素(endonuclease)。CRISPR-Cas9 是細菌用來對抗病毒感染的一種機制，病毒 DNA 進入細菌後，會嵌入 CRISPR 之間用來偵測之後入侵的病毒，當細菌找到對應的病毒 DNA (跟嵌入 CRISPR 之間為相同的序列)後，Cas9 則會去切碎它，使病毒無法在細菌裡面複製（如圖）。


Figure: Nature 2017 (doi: 10.1038/541280a)

2012 年，美國柏克萊大學 Dr. Jennifer Doudna 的研究團隊利用這個特性來編輯基因，並把結果發表在 Science 期刊上 (Jinek et al, 2012)，刊出來之後造成轟動。這個技術會引起大量關注除了因為它能用來修正 DNA 裡突變的地方外，它還號稱便宜、快速又好上手，使得科學家們躍躍欲試，想把它應用在自己的研究上。在此之前的基因編輯技術有 ZFN (zinc finger nucleases)，要價超過五千鎂，且費時費力。

把想要編輯(修正)的基因片段嵌入 CRISPR 之中，Cas9 找到對應的 DNA 序列後會切一個口，這個切口會使 DNA 自行修復，修復的時候會把突變的地方改回正確的，更進一步的技術是可以把它改成你想要的序列。不過，這個技術目前還有個瓶頸需要突破，因為 CRISPR-Cas9 雖然可以把突變的地方修正，但同時也可能會修改到其他地方，把原本正確的地方改成錯誤的，變為其他的突變，或是改到你不想改的地方，而我們不知道可能會被改變的地方是哪裡，只能取一些重要的基因做檢測，因此目前還無法用於人類胚胎上。另外，如何有效地把 CRISPR-Cas9 系統送進體內，讓所有細胞或局部區塊的細胞裡的基因都改正，也是需要繼續研究的地方。

只是，雖然技術上還不能用於人類胚胎上，但已經有人躍躍欲試了，中國科學家在 2015 年的時候利用 CRISPR-Cas9 編輯了人類胚胎。他們用人工授精(in vitro fertilization, IVF)後剩下的卵子和精子，把兩個精子和一個卵子結合後，再把 CRISPR-Cas9 打進 86 個胚胎，結果只有四個受精卵有修改到他們想要編輯的地方，成功率只有 4%，而且發現有很多 off-target mutations。他們本把結果先投稿到 Nature 和 Science，但鑑於違反倫理這兩大期刊皆拒絕刊登，於是他們改投到中國國內的期刊，發表出來後便引起爭議，好幾位科學家聯名發文在 Nature，呼籲科學家做研究不能違反倫理，在技術尚未純熟、安全之前，不能應用於人類胚胎上。

是說中國應該是沒在管這些倫理的東西，因為他們又再一次試在人類杯胎上，一樣是用人工授精剩下的卵子和精子，只是這次是正常的一個卵子和一個精子結合的受精卵，精子是帶有治病的突變基因。其中一種是中國常見的，會對蠶豆過敏的突變 G6PD G1376T，用的兩個受精卵有一個胚胎成功，另一個只有部分細胞有成功改正突變，其他的細胞有的是 knock down 而已，並沒有改正突變。另一種則是會造成地中海貧血(beta-thalassemia)的 beta41-42，四個試驗的胚胎中有兩個胚胎沒改成，一個不但沒改成，還製造了其他的突變，最後一個是只有部分細胞有成功改正突變。嚴格說起來，六個試驗的胚胎只有一個成功，成功率雖然比第一次高，但也只有 16% 左右。

雖然不能用於人類胚胎上，但仍然可用於治療疾病。美國賓州大學的 Dr. Carl June 和其團隊計畫用這個技術來治療 HIV，方法是把病人的免疫細胞 T cells 抽出來後，用 CRISPR-Cas9 插入一個癌症細胞才有的接受器基因 NY-ESO-1，然後阻斷 T cells 表面本來就有的一個蛋白的基因 PD-1，之後再把基因改造過後的 T cells 輸回病人體內，讓它們去殺死癌細胞。這個計畫去年六月已通過美國 NIH 核准，現在在等 FDA 認證，準備在今年年底進入臨床試驗。


延伸閱讀：CRISPR-Cas9 的專利大戰和爭議



Articles:

Nature / CRISPR, the disruptor (2015)

Nature / Chinese scientists genetically modify human embryos (2015)

Nature / Don’t edit the human germ line

Nature / Embryo editing sparks epic debate (2015)

Nature / Gene-editing research in human embryos gains momentum (2016)

Science / CRISPR debate fueled by publication of second human embryo–editing paper (2016)

Nature / Five big mysteries about CRISPR’s origins (2017)

ScienceNews / Gene editing of human embryos yields early results