CRISPR-Cas9 基因治療（下）-- 遺傳性澱粉樣蛋白疾病 hATTR

CRISPR-Cas9 大家應該都不陌生吧，此技術的發明者 Dr. Doudna 和 Dr. Charpentier 因此技術得了2020 年的諾貝爾化學獎。Dr. Doudna 和 Dr. Charpentier 在 2012 年的時候先於 Science 發表了用 CRISPR-Cas9 基因編輯的成果，之後在 2013 年要把這個技術申請專利的時候，所屬的 Berkeley 大學和 MIT 的 Dr. Zhang 開始了專利之戰。接著，2014 年時 Dr. Doudna 成立了 Intellia Therapeutics，而 Dr. Charpentier 也已於 2013 年在瑞士成立了生技公司 CRISPR Therapeutics。

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CRISPR-Cas9 用於治療上，CRISPR Therapeutics 似乎搶先了一步，它和 Vertex Pharmaceuticals 合作研發了用於治療血液疾病的 CTX001，並於 2018 年開始了臨床試驗，2019 年五月時宣佈了用於治療鐮刀型紅血球疾病(sickle cell disease, SCD)的乙型地中海貧血(transfusion-dependent β thalassemia, TBT)的第一、二期臨床試驗結果，那時最先是兩個臨床試驗各一位患者，兩位患者的臨床試驗結果也於今年一月發表在 NEJM [1]。

CTX001 治療是把造血幹細胞(hematopoietic stem cells, HSP)抽出來，利用 CRISPR-Cas9 調控血紅蛋白，再把修正過後的紅血球輸回病患體內。TBT 患者在治療前每年需要接受多次輸血，而在接受治療九個月後便不再需要輸血。SCD 患者在治療前每年會發生多次 vaso-occlusive crises (VOCs)，在治療後便不再出現 VOCs。兩位病患在治療後觀察一年的期間內，HbF 都持續穩定的增加，雖然治療中都出現不適的情況，不過診斷過後排除是治療造成的 [1]。CTX001 已於 2019 四月拿到 FDA Fast Track Designation，Vertex 計劃在未來兩年內送 FDA，並於今年四月宣布給 CRISPR Therapeutics $900M 在研發、量產和上市上 [2]。

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相較於 CRISPR Therapeutics，Dr. Doudna 的 Intellia Therapeutics 今年六月才在 NEJM 上發表了其 NTLA-2001 的第一期臨床試驗結果 [3]。NTLA-2001 是用來治療 hereditary transthyretin amyloidosis (hATTR)。ATTR 有兩種，一種是隨著年齡增長得病機率越大的 wild-type (senile) ATTR，另一種是罕見且會致命的遺傳性 ATTR (hATTR)。TTR (transthyretin, 轉甲狀腺素蛋白)是個只有 14 kDa 的小蛋白，主要功能是運送甲狀腺素(thyroxine)和視黃醇(retinol)，在肝臟中和成後，通常以 tetramer (55 kDa) 的型態遊走在腦脊液(cerebrospinal fluid, CSF)和血液中。

Wild-type ATTR 是因為正常的 TTR 隨著年齡增長而變得不穩定，使得蛋白容易出現摺疊錯誤(misfold)的情況。摺疊錯誤的 TTR 無法組合成 tetramer，而是以 monomer 或 dimer 的型態存在，並且當這些 misfold monomer 碰在一起時，會變成 aggregates，跟造成阿茲海默症的 β-amyloid aggregates 一樣會堆積在組織細胞或神經細胞中，導致細胞死亡，稱為 amyloidogenesis [4]。hATTR 則是因為 TTR 基因突變而造成的，突變的 TTR 比正常的 TTR 更不穩定，更容易摺疊錯誤和堆積。

ATTR 主要發生在心臟和神經系統，目前用來治療 ATTR 的基因療法有兩個，皆已於 2018 年拿到美國 FDA 許可：Alnylam (Nasdaq: ALNY) 的 Onpattro (patisiran) [5] 和 Ionis Pharmaceuticals, Inc. (NASDAQ: IONS) 的 TEGSEDI (inotersen) [6]。Onpattro 用的是 small interfering RNA (siRNA, aka RNA interference, RNAi)，是第一個得到 FDA 許可的 RNA 療法，是利用 NLP (lipid nanoparticles) 把 siRNA 直接送進肝臟裡，使 TTR 的 mRNA 不能被轉譯成蛋白質，TTR 表現可以降低 80% [5-8]。TEGSEDI 則是 antisense oligonucleotides (ASO)，一樣是針對 TTR mRNA，使正常和突變的 TTR mRNA 被降解，無法轉譯成蛋白，同樣可以降低 TTR 表現 80% [6]。

Intellia Therapeutics 和 Regeneron Pharmaceuticals 合作研發的 NTLA-2001 也是利用 NLP 把 CRISPR-Cas9 送進體內，使 CRISPR-Cas9 進入肝臟細胞後可以造成 indels (insertions or deletions) 阻斷 TTR 基因，降低 TTR 的表現和血液裡的 TTR 含量。Intellia 於於去年十月底宣布他們將在英國和紐西蘭開始第一期臨床試驗，參與人數為 38 人，主要是檢測其安全性和有效性 [7]。

今年六月底，Intellia 在 Peripheral Nerve Society (PNS) Annual Meeting 發表了第一期臨床試驗的期中報告，同時也發表在 NEJM，論文裡的參與人數為六位患者，分為兩組不同劑量：0.1 mg/kg 和 0.3 mg/kg。ATTR 患者以靜脈注射的方式接受了一劑 NTLA-2001，然後在 28 天後測量其血清中 TTR 含量。結果顯示接受低劑量(0.1 mg/kg)的患者，其血清的 TTR 減少了 52%，而高劑量組(0.3 mg/kg)的血清 TRR 則減少了 87% [8-11]，比 Onpattro 和 Tegsedi 的 80% 還要好一些，不過 NTLA-2001 的優勢在於它只需一劑，Onpattro 則需每三週施打一次，Tegsedi 也要每週一次 [6, 8]。副作用方面，只有三個人出現輕微副作用，沒有觀察到嚴重副作用。臨床結果發表當週也是他們的 IPO，以每股 $145 的價格上市 [12]。



CTX001 和 NTLA-2001 不同的地方在於 CTX001 是把目標細胞抽出來基因編輯，NTLA-2001 則是需要把 CRISPR-Cas9 送進體內，因此如何讓它到準確地達目標器官或細胞是需要克服的瓶頸。雖說 Intellia 第一期臨床試驗目前看來頗為成功，但因為目標器官是肝臟，大多經由靜脈施打的 liposomes 都會先被肝臟吸收。Dr. Doudna 日前在 CNBC 訪問時表示，CRISPR 基因治療能有局限，要如何把 CRISPR-Cas9 送進目標器官裡仍是個需要解決的難題 [13]，不過要是能克服這個瓶頸，未來便可應用在更多疾病治療上。


Clinical trial: NCT04601051


[2022-09-29 update]

Intellia 研發的、用來治療遺傳性澱粉樣蛋白疾病(hereditary transthyretin amyloidosis, hATTR)的 CRISPR 基因療法 NTLA-2001 的最新報告顯示，只需一劑就夠了。在靜脈施打一劑 NTLA-2001(0.7-mg/kg) 的 28 天後，TTR 降了 93%。

而他們的另一個藥物 NTLA-2002 正在第 1/2 期臨床試驗中，是用來治療罕見疾病 hereditary angioedema (HAE, 遺傳性血管性水腫)，病徵是血液中的 bradykinin (緩激肽, 血管擴張劑)上升，血管外部的體液堆積擠壓到血管，造成血液流通或淋巴液流通不順暢，導致手腳和臉部等部位水腫。HAE 是一種顯性的遺傳疾病，因此只要父母其中之一有這個突變的基因，小孩就有 50% 的機會得到。HAE 是由於 C1 inhibitor (C1-INH) 不足所引起的，C1 inhibitor 是一種 serine protease inhibitor，由基因 SERPING1 表現，SERPING1 的突變會導致 C1 inhibitor 無法表現或是功能缺失。後來研究發現，除了 SERPING1 外，factor XII (F12), plasminogen (PLG) and angiopoietin 1 (ANGPT 1) 的突變也會造成 HAE，95% 的 HAE 是由 SERPING1 突變造成的。C1 inhibitor 主要是抑制 F12 和 kallikrein，因此 C1-INH 不足或功能不正常會導致 F12 和 kallikrein 無法被調控，進而造成 bradykinin 上升。NTLA-2002 即是針對 kallikrein，最新的臨床節果顯示 75 mg 的劑量可以在施打八週後降低血液中 92% 的 kallikrein。



References:

1. H Frangoul et al, CRISPR-Cas9 Gene Editing for Sickle Cell Disease and β-Thalassemia. NEJM (2020)

2. Vertex / Vertex Pharmaceuticals and CRISPR Therapeutics Amend Collaboration for Development, Manufacturing and Commercialization of CTX001™ in Sickle Cell Disease and Beta Thalassemia (April 2021)

3. JD Gillmore et al, CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis. NEJM (2021)

4. GY Park et al, Diagnostic and Treatment Approaches Involving Transthyretin in Amyloidogenic Diseases. Int J Mol Sci (2019)

5. US FDA / FDA approves first-of-its kind targeted RNA-based therapy to treat a rare disease (Aug 2018)

6. Ionis / Akcea and Ionis Receive FDA Approval of TEGSEDI™ (inotersen) for the Treatment of the Polyneuropathy of Hereditary Transthyretin-Mediated Amyloidosis in Adults

7. Gene Online / Intellia Trials CRISPR Drug as Permanent Cure to Fatal Hereditary Disease (Oct 2020)

8. MedCity News / Intellia’s early CRISPR trial data validate a drug pipeline and the gene-editing field (June 2021)

9. CRISPR News / Clinical Trial Update: Positive Data for First Ever In Vivo CRISPR Medicine (June 2021)

10. Clinical Trials Arena / Intellia and Regeneron report positive data of CRISPR therapy for ATTR (June 2021)

11. Intellia and Regeneron Announce Landmark Clinical Data Showing Deep Reduction in Disease-Causing Protein After Single Infusion of NTLA-2001, an Investigational CRISPR Therapy for Transthyretin (ATTR) Amyloidosis (June 2021)

12. BioSpace / Intellia Tops Busy Period with $600 Million IPO

13. CNBC / How CRISPR gene editing will treat diseases in future: Nobel-winning Intellia co-founder Jennifer Doudna

14. Intellia / Intellia Therapeutics Announces Positive Interim Clinical Data for its Second Systemically Delivered Investigational CRISPR Candidate, NTLA-2002 for the Treatment of Hereditary Angioedema (HAE) (Sept 2022)

15. FIERCE Biotech / Intellia's gene editing therapies both post early successes as evidence grows for CRISPR potential

16. Biopharma Dive / Intellia offers first look at CRISPR drug for rare swelling disorder

CRISPR-Cas9 基因治療（上）-- 遺傳性血液疾病

CRISPR-Cas9 是由美國 Berkeley 大學的 Dr. Doudna 和德國 MPUSP 的 Dr. Charpentier 合作研發的，兩位並於 2020 年得到諾貝爾化學獎。2023 年年底，美國 FDA 核准了用於兩個鐮刀型紅血球疾病(sickle cell disease, SCD)的基因治療：Vertex Pharmaceuticals 和 CRISPR Therapeutics 合作的 Casgevy (exagamglogene autotemcel, exa-cel) 和 Bluebird Bio 的 Lyfgenia (lovotibeglogene autotemcel, lovo-cel)。而後於 2024 年一月，FDA 也核准 Casgevy 用於治療乙型地中海貧血(transfusion-dependent β thalassemia, TBT)。

乙型地中海貧血(TBT)的成因

這兩種病是因為血紅蛋白基因突變而造成的，血紅蛋白(hemoglobin, Hb) 是由四個蛋白組成的：兩個 α-globin (HbA) 和兩個 β-globin (HbB)。TBT 是因為 HbB 突變而造成的，致病的突變有很多種，常見的突變是 β0/IVS-I-110 (G→A)(上圖紅色箭頭)，是一個在 intron 裡的突變，這個突變會使 mRNA splicing 不正常(splicing mutation)，無法轉譯成 HBB。如果突變是造成不正常 mRNA，無法轉譯成 HBB，導致無法組成血紅蛋白，紅血球無法運送氧氣，為 β0-thalassemia (thalassemia major)。如果突變是減少 HBB ，則是較輕微的 β+ thalassemia (thalassemia minor)，這種情形是還是可以生產血紅蛋白，但是量比正常人少，但需要長期接受輸血。

註：IVS = intervening sequences，IVS1 表示在第一個 intron 裡面。


Figure / β globin gene and mRNA. (G Breveglieri et al, Biomed Res Int. 2015; doi: 10.1155/2015/687635)

鐮刀型紅血球疾病(SCD)的成因

SCD 也是因為 HBB 突變造成，最常見的突變是 HbS，第六個氨基酸的 glutamic acid 突變成 valine (GAG → GTG)：βE6V。這個突變會使血紅蛋白黏在一起，結塊在一起，如果兩個 HBB 基因都帶有這種突變的話，結塊的程度會讓紅血球變成鐮刀的形狀。


Figure / HBB IVS-I-110 (G→A) mutation (G Feriotto et al, Lab Inves 2004; doi: doi.org/10.1038/labinvest.3700106)

2013 年的時候，Boston Children's Hospital 和 Dana-Farber Cancer Institute 的研究團隊發現 BCL11A 控制著 HbF (fetal Hb) 的表現。HbF 是胚胎時期的血紅蛋白，和成人的 Hb 不同的地方在於它是由兩個 α-globin 和兩個 γ-globin 組成，γ-globin 則和 β-globin 相似，嬰兒出生後，血紅蛋白的 γ-globin 會被 β-globin 取代，不過有極少數人一生都會不停的生產 HbF，被稱為 hereditary persistence of fetal hemoglobin (HPFH)。有 HPFH 的人基本上都很健康，但是極少數有 HPFH 的 SCD 患者，他們的 SCD 症狀非常輕微，因此學者們就開始研究要怎麼讓 SCD 患者體內可以大讓生產 HbF。BCH 和 Dana-Farber 的研究團隊發現，成人紅血球內有大量的 BCL11A，當他們把 BCL11A 表現降低後，HbF 就會大量增加 [5]。

CASGEVY™ 的治療方式

2019 年十一月時，Dr. Charpentier 創立的瑞士的生技公司 CRISPR Therapeutics 和美國波士頓的 Vertex Pharmaceuticals 公佈了他們 CRISPR-Cas9 基因治療 CTX001 的第一、二期臨床試驗結果 [1-3]。這個試驗的兩位病患分別患有鐮刀型紅血球疾病(sickle cell disease, SCD)和乙型地中海貧血(transfusion-dependent β thalassemia, TBT)，患有地中海貧血的病患在今年初開始接受治療，SCD 病患則在今年年中接受治療，而 CTX001 也在四月底時拿到用來治療 TBT 的 FDA Track Designation [4]。

CTX001 治療是把造血幹細胞(hematopoietic stem cells, HSPs)抽出來，用電擊(electroporation)把 CRISPR-Cas9 送進細胞裡，利用 CRISPR-Cas9 的編輯功能阻斷 BCL11A 的表現，使紅血球能夠生成 HbF，再把編輯過後的紅血球輸回病患體內 [1, 2]。2020 年年底，他們把追蹤一年後的臨床結果發表在 NEJM。他們先是抽了十位健康個體的 CD34+ HSPs 做基因編輯，看修正率和 off-target editing 有多少。分析後的結果是修正率有 80±6%，編輯過後 HSP 的 HbF 增加了 29.0±10.8%，沒編輯過的則是 10.5±5.2%，他們也沒發現有 off-target editing 的情況。TBT 患者在治療前每年需要接受多次輸血，而在接受治療九個月後便不再需要輸血。SCD 患者在治療前每年會發生多次 vaso-occlusive crises (VOCs)，在治療後便不再出現 VOCs。兩位病患在治療後觀察一年的期間內，HbF 都持續穩定的增加，雖然治療中都出現不適的情況，不過診斷過後排除是治療造成的。研究中表示，之後有六位 TBT 和兩位 SCD 患者參與 CTX001 治療，在追蹤了至少三個月後，治療效果和前兩位患者一樣。不過，雖然所有患者在治療後 HbF 持續增加，不過有件令人擔憂的事。之後在 ASH 發表其中七位的病患資料中顯示，正常的成人版 Hb 似乎有下降的趨勢，HbF 和成人版 Hb 似乎會競爭 [6, 7]。

Vertex 於 2021 年四月宣布和將給 CRISPR Therapeutics $900M 在研發、量產和上市上，雙方同意在支出和營收上，Vertex 負擔 60% 的支出和在上市後拿 60% 的營收 [8, 9]。2023 年四月，Vertex 和 CRISPR Therapeutics 將藥物申請送 FDA 審核，此療法原本叫 CTX001，以 exa-cel 這個名稱送審，取之於 exagamglogene autotemcel。2023 年年底，FDA 核准該藥用於治療 SCD，以商品名 CASGEVY™ 上市，之後於 2024 年年初獲得核准用於治療 TBT。

另外要提的是 Vertex 的在治療 TBT 上有個競爭對手 bluebird bio，它的 Zynteglo 已在 2019 年六月於歐洲上市，但是尚未拿到美國 FDA 許可。2021 年二月的時候，公司決定停止銷售 Zynteglo，因為它的另一個用來治療 SCD 的基因治療 LentiGlobin 在第一、二期臨床試驗的中，有兩位患者分別得到急性血癌(acute myeloid leukemia, AML)和骨髓增生異常綜合症(myelodysplastic syndrome, MDS)，而 Zynteglo 用的 lentiviral vector 和 LentiGlobin 是相同的 [10, 11]。Zynteglo 在美國的臨床試驗先前也遭到暫停，不過六月時 FDA 讓它恢復 TBT 第三期的臨床試驗，LentiGlobin 目前也在第一、二期臨床試驗中。雖然如此，要申請 FDA 審核也要延到 2022 年年底，因此 Vertex 的 CTX001 可能搶先一步 [12]。


Clinical trials:
NCT03745287 (CLIMB SCD-121) - A Safety and Efficacy Study Evaluating CTX001 in Subjects With Severe Sickle Cell Disease
NCT03655678 (CLIMB THAL-111) - A Safety and Efficacy Study Evaluating CTX001 in Subjects With Transfusion-Dependent β-Thalassemia



Articles:

1. Science | Company claims signs of success with CRISPR-edited stem cell transplants for two genetic diseases (Nov 2019)

2. The Scientist | Early Results Are Positive for Experimental CRISPR Therapies (Nov 2019)

3. VERTEX News | CRISPR Therapeutics and Vertex Announce Positive Safety and Efficacy Data From First Two Patients Treated With Investigational CRISPR/Cas9 Gene-Editing Therapy CTX001® for Severe Hemoglobinopathies

4. GlobeNewswire | CRISPR Therapeutics and Vertex Announce FDA Fast Track Designation for CTX001 for the Treatment of Beta Thalassemia (April 2019)

5. NIH Director's Blog / A CRISPR Approach to Treating Sickle Cell (April 2019)

6. FIERCE Biotech | CRISPR, Vertex show CRISPR/Cas9 gene-editing therapy works in more patients (Nov 2020)

7. 2020 ASH | 4 Safety and Efficacy of CTX001 in Patients with Transfusion-Dependent β-Thalassemia and Sickle Cell Disease: Early Results from the Climb THAL-111 and Climb SCD-121 Studies of Autologous CRISPR-CAS9–Modified CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

8. Vertex | Vertex Pharmaceuticals and CRISPR Therapeutics Amend Collaboration for Development, Manufacturing and Commercialization of CTX001™ in Sickle Cell Disease and Beta Thalassemia (April 2021)

9. GEN News | Vertex Pays $900M Upfront to Lead CTX001 Development with CRISPR Therapeutics (April 2021)

10. FIERCE biotech | Bluebird bio gets FDA green light to restart sickle cell gene therapy trials after rocky few months (June 2021)

11. FIERCE Pharma | Bluebird's Zynteglo trials set to resume, putting gene therapy back on flight path to FDA filing (June 2021)

12. FIERCE Pharma | Bluebird tanks as FDA's LentiGlobin demands in sickle cell delay filing to late 2022 (Nov 2020)

13. BioPharma Dive | Vertex, CRISPR finish US filing for gene editing drug approval (2023)




Papers:

NF Olivieri, The β-Thalassemias. NEJM (1999)

Vijay G Sankaran et al, Human Fetal Hemoglobin Expression Is Regulated by the Developmental Stage-Specific Repressor BCL11A. Science (2008)

H Frangoul et al, CRISPR-Cas9 Gene Editing for Sickle Cell Disease and β-Thalassemia. NEJM (2020)

是否可在哺乳動群中產生 gene-drive？

利用 CRISPR 造成 gene-drive 消滅散播病菌的蚊蟲，可行嗎？如果大家還有印象的話，之前有人提出利用 gene-drive 去消滅散播瘧疾的蚊蟲，但這個做法有爭議，因為這牽扯到整個物種的基因改變，是否會對生態造成影響還不知道。

三年前，UCSD 的 Gantz 和 Bier 先是研發了一個叫做 mutagenic chain reaction (MCR) 的技術，利用細胞本身的 HDR (homology-directed repair) 功能，可以有效的把生物基因體裡的一對基因都突變(homozygous mutations)，使在兩個染色體上的此基因失能。這個技術主要是在一對基因的其中一個中插入了一個 Cas9-gRNA cassette 使其失能外，之後利用細胞本身的 HDR 把另一個基因也切斷並插入 Cas9-gRNA cassette，造成 homozygous mutation，使那一對基因整個失能(loss-of-function)。那要怎麼知道這個方法是否能夠有效的產生 homozygous mutation？假設果蠅本身的某對隱性基因中有一個帶有突變，也就是所謂的 heterozygous mutation，那這個突變並不會表現在外觀上(phenotype)，但透過這個技術，可以有效地使果蠅轉換成一對基因的兩個都帶有突變，使這個突變表現在外觀上。並且，當這個帶有 Cas9-gRNA 的果蠅和野生果蠅交配後，產生的後代也會有 50% 的機會帶有 Cas9-gRNA cassette，使其出現 loss-of-function 的突變，隨之產生 gene-drive 的情況。

照理來說，這個技術應該可以應用在任何生物身上，不只有果蠅。於是，UCSD 的另一個團隊想在老鼠中嘗試 gene-drive，這樣就可以大量生產研究用的基改老鼠。他們讓母鼠帶有 Cas9，讓公鼠帶有 gRNA (guide RNA)，交配後的後代小鼠就會帶有 Cas9 和 gRNA，並且會在不同的染色體上，因為從爸爸來的那個會帶有 gRNA，從媽媽來的則帶有 Cas9。不過這個實驗沒果蠅那麼成功，主要是在公鼠的部分，可能是因為精子會在進行 meiosis (減數分裂) 前現進行普通的 mitosis，而這時期 Cas9 造成的切口會用 NHEJ (non-homologous end joining) 來修復，而不是 HDR。另外就是 Cas8 和 gRNA 是在不同的染色體上，所以如果和野生鼠交配，就會缺少其中一個元素而無法進行突變。


Figure / S Khan et al, J Biomedical Science 2018 (doi: 10.1186/s12929-018-0425-5)


Articles:

Science / ‘Gene drive’ passes first test in mammals, speeding up inheritance in mice (July 2019)


Papers:

VM Gantz & E Bier, The mutagenic chain reaction: A method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science (2015)

HA Grunwald et al, Super-Mendelian inheritance mediated by CRISPR/Cas9 in the female mouse germline. bioRxiv (2019)

預防病毒感染除了打疫苗外還有什麼方法？

上個月刊在 Science Immunology 的一篇研究用的方法是用 CRISPR 改造 B cells。抗體基因分成 heavy chain (IgH) 和 light chain (IgL) 兩個部分，兩個都需要幾過幾次的 splicing 去除掉不需要的 V(D)J regions 才會變成最終的一個抗體。他們在 IgH VDJ 和 C (constant) region 中間的 intronic region 插入了對抗某個病毒(在這個研究裡是 RSV 和 Influenza) 的抗體的 IgL 和 IgH VDJ 的部分，C 的部分用原有(endogenous)的基因以減少需要插入基因的長度，使得改造過的 B cells 可以生產他們想要的抗體。


Figure / Wikipedia - VDJ recombination

他們把改造過的 B cells 植入老鼠體內，然後再輸入後的一個禮拜後，再讓老鼠感染 RSV (respiratory syncytial virus)，感染五天後取其肺臟和胰臟側病毒量，並且和抗體藥 palivizumab 的效果做比較，結果顯示效果和抗體藥一樣好。另外，改造過的 B cells 在老鼠體內可以維持多久也是個問題，所以他們也測試了長期的效果，他們在移植基改 B cells 後的 87 天後才讓老鼠感染 RSV，然後同樣在感染五天後測量胰臟和肺臟的病毒量，結果和移植七天後的效果是一樣的。

這個方法如果在人體內可行的話，或許可以取代很難研發的疫苗，不過目前的老鼠實驗只測到 87 天後的效果，是否可以維持年以上的效果還不知道。



Article:

Science / Genetically engineered immune cells fight off deadly virus in mice (May 2019)


Paper:

HF Moffett et al, B cells engineered to express pathogen-specific antibodies protect against infection. Science Immunology (2019)

基因編輯嬰兒 -- 所以 CCR5 到底長怎樣？

關於中國基因編輯嬰兒的新聞大家大概已經看了好幾天了吧。賀建奎改的是 CCR5 (C-C chemokine receptor type 5)，到底是消除這個基因，還是改成它的突變 CCR5 δ32 呢？看了那麼多的資訊，相信很多人都學到 CCR5 和 CXCR4 是免疫 T cells 細胞表面的 co-receptors，HIV 病毒透過其表面的醣蛋白 gp120 和免疫細胞的 CCR5 或 CXCR4（或是兩者）相結合後進入 T 細胞。

CCR5 RefSeq: NP_000570.1
CCR5 UniProtKB: P51681


Figure: CCR5 有七個 TM，三個 ECL (extracellular loop) 和三個 ICL (intracellular loop)，N-terminus 在細胞外，C-terminus 在細胞內。(C Blanpain et al, Blood 2000 [4])

所以 CCR5 δ32 到底是怎樣呢？CCR5 是一個長為 352 個氨基酸的蛋白質，表現在免疫 T 細胞的表面，屬於 GPCR 的一種，有七個 transmembrane (TM) regions。CCR5 δ32 的意思是 CCR5Δ32，Δ 在基因上或蛋白質上的意思就是 deletion 的意思，Δ32 就是有 32 個 bp (base pair) 被 delete 掉了，就是少惹 32 個 bp 的意思(感覺在講廢話 XD)。這會有什麼影響呢？稍微了解 DNA 和 codon 的都知道 condon 是三個 bp 為一組轉成一個氨基酸，所以如果是三的倍數的 bp 被消失的話就是少了幾個氨基酸，但如果是非三的倍數，例如是 32 個 bp 被消失的話則會造成 frame shift，也就是整個氨基酸序列會大挪移。CCR5Δ32 裡被消失的那 32 個 bp 使得 stop codon (TGA) 提早出現了，造成尾端(C-terminal)的 168 個氨基酸消失了，第二個 extracellular loop 只剩一半，連帶著後面的三個 TM regions 不見了 [1]。


Figure: CCR5Δ32 中失去的那 32 個 bp (M Samson et al, Nature 1996 [1])

因為這 32 bp deletion，整個蛋白質只剩一半，無法形成有功能性的 receptor，因此對 HIV 免疫。是說我孤狗了一下，發現 HIV gp120 的 binding site 是 CCR5 的最頭端 N-terminal 細胞外的那一小段 (residue 1-30) [2]，那為什麼帶有 CCR5Δ32 突變的人可以免於 HIV 感染啊？他們的 CCR5 還是有 HIV 的 binding site 啊不是嘛？CCR5 有兩個預測的 disulfide bonds , C20-C269 和 C101-C178，有研究顯示這兩個 disulfide bonds 連結惹 ECL，可以維持 CCR5 的整體結構和功能，C20A, C101A 和 C269A 的突變降低惹 CCR5 的功能和 HIV 感染 [3, 4]。其中的 C269 位於 CCR5Δ32 裡被消失的那一半。另外，CCR5Δ32 在細胞實驗中的表象量也比較低。

>NP_000570.1 MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAARLLPPLYSLVFIFGFVGNMLVILILINCKRLKSMTDIYLLNLAISDLFFLLTVPFWAHYAAAQWDFGNTMCQLLTGLYFIGFFSGIFFIILLTIDRYLAVVHAVFALKARTVTFGVVTSVITWVVAVFASLPGIIFTRSQKEGLHYTCSSHFPYSQYQFWKNFQTLKIVILGLVLPLLVMVICYSGILKTLLRCRNEKKRHRAVRLIFTIMIVYFLFWAPYNIVLLLNTFQEFFGLNNCSSSNRLDQAMQVTETLGMTHCCINPIIYAFVGEKFRNYLLVFFQKHIAKRFCKCCSIFQQEAPERASSVYTRSTGEQEISVGL

>CCR5CCR5-δ32
MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAARLLPPLYSLVFIFGFVGNMLVILILINCKRLKSMTDIYLLNLAISDLFFLLTVPFWAHYAAAQWDFGNTMCQLLTGLYFIGFFSGIFFIILLTIDRYLAVVHAVFALKARTVTFGVVTSVITWVVAVFASLPGIIFTRSQKEGLHYTCSSHFPYIKDSHLGAGPAAACHGHLLLGNPKNSASVSK

（沒有 highlight 的序列是正常和突變不同的地方，紅色 C 是預測會成 disulfide bond。）

然後我剛看了一下賀做的 CRISPR，他是說露露的是 CCR5 K/O，但是他又寫 +1bp/-4bp，是說只有 3bp deletion 嗎？(*) 然後娜娜的是 in-frame 15bp deletion，不知道它的 in-frame 15 bp deletion 是指哪裡到哪裡，所以變成是只少了五個氨基酸的突變種嗎？我覺得這兩個都和天然的 CCR5Δ32 差很多啊。（對了，他展示的定序圖裡，娜娜的訊號也太雜了吧，他竟然能讀出 ATCG 是哪個？是我就會要求重新定序。）

* 後來看了尼安德塔人石器匠的解釋，+1bp/-4bp 是指兩個 alleles，一個是 +1bp，另一個是 -4bp，所以兩個 alleles 都有 frame shift，slides 裡出現的定序圖中那個箭頭不知道是指 +1bp 的還是 +4bp，不知道 frame shift 後整個氨基酸序列變怎樣，真的出現 premature stop codon 而變成 K/O 惹嗎？不管怎樣，我覺得這個情況更糟呀。



然後孤狗的時候，發現在 2016 年的時候中國已經有人做過人類胚胎的 CCR5Δ32，用的是 3PN embryo，發表在 Journal of Assisted Reproduction and Genetics (X Kang et al, 2016)，那個論文裡面編輯成功的胚胎中，其定序結果的確跟天然的 CCR5Δ32 相同，而不是像賀的這樣。那篇是用了兩種，一種是有提供 donor template 的 HDR，一種是沒有的 NHEJ。HDR 的成功率很低，最高只有 15% 的胚胎編輯成功。NHEJ 則滿高的，但是出現其他種類的 mutation 也很高。他們檢測了 28 個他們認為會出現 off-target 的地方，每個出現的 mismatch 大約有 2-4 個，未發現有 indel (insertion & deletion)。這個研究因為用的是 3PN embryo，所以三天後就死了。


Figure: HDR 和 NHEJ 的差別 (JR Guitart Jr. et al, J Inves Derm 2016)

不管賀的基因編輯嬰兒是怎樣，我還是覺得在 off-site target 解決之前不適合用在嬰兒身上，唯一的例外是用在很明顯的基因疾病。另外，就算是 CRISPR 技術很成熟了，我還是反對用在治療以外的地方，例如改善外觀。（雖然我覺得這種非單一基因的很難做到，尤其我們還無法掌握是哪些基因調控這些。）



相關閱讀：關於 CRISPR-Cas9


References:

1. M Samson et al, Resistance to HIV-1 infection in Caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR-5 chemokine receptor gene. Nature (1996)

2. EG Cornier et al, Specific interaction of CCR5 amino-terminal domain peptides containing sulfotyrosines with HIV-1 envelope glycoprotein gp120. PNAS (2000)

3. C Blanpain et al, Extracellular cysteines of CCR5 are required for chemokine binding, but dispensable for HIV-1 coreceptor activity. JBC (1999)

4. C Blanpain et al, Multiple nonfunctional alleles of CCR5 are frequent in various human populations. Blood (2000)

2017 年大家在關注什麼研究？

2017 年最受人關注的前一百篇研究，大家都有發摟到嗎？XD



❖ 1. Associations of fats and carbohydrate intake with cardiovascular disease and mortality in 18 countries from five continents (PURE): a prospective cohort study. The Lancet.

第一名這篇我沒發摟到。（原文看這）


❖ 2. Work organization and mental health problems in PhD students. Research Policy

這篇應該被(菸酒生)轉爆惹。XD
我自己是沒看這篇原文，而是看 Science News 的這篇(這篇應該也被轉到爆惹 XD)

Science / Ph.D. students face significant mental health challenges
Nature / Mental health: Degree and depression
Nature / Graduate survey: A love–hurt relationship


❖ 4. Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos. Nature

參考：把 CRISPR 用在人類胚胎上：這次換美國了~


❖ 5. Gender stereotypes about intellectual ability emerge early and influence childrenÍs interests. Science

參考：女孩從六歲開始就覺得男生比較聰明


❖ 10. An extra-uterine system to physiologically support the extreme premature lamb. Nature Comm

參考：人造子宮：Biobag


❖ 23. Pregnancy leads to long-lasting changes in human brain structure. Nature Neuroscience

這篇我有看到，但是沒看原文。是說女人第一次懷孕後大腦的 gray matter 某個部份和海馬迴有縮水了一點。用 fMRI 觀察發現 gray matter 有縮水的部分會在見到自己的小 baby 時特別活躍，顯示這種改變會讓媽媽對周遭環境比較敏感，能夠較快速的接收到嬰兒的訊息，或是感應到環境中的危險，而且這種改變會持續兩年。至於掌管記憶的海馬迴，如果沒有再次懷孕，則在兩年之後恢復。

Science / Pregnancy resculpts women’s brains for at least 2 years


❖ 27. CRISPR-Cas encoding of a digital movie into the genomes of a population of living bacteria. Nature

這篇泛科學有：電影片源哪裡找？科學家利用 CRISPR 把影像儲存在大腸桿菌的DNA！


❖ 43. A female Viking warrior confirmed by genomics

這篇泛科學也有：維京的高階戰士不可能是女生？DNA分析能推翻十九世紀以來的偏見嗎？


❖ 63. A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice. Nature Comm.

參考：3D 列印卵巢


不知各位發摟到了幾篇呢？



Article:

Nature News / The Great Pyramid’s void, deadly heat and more: the most popular science stories of 2017

THE / These are the 10 most popular academic papers of 2017

現在的生技領域在關注什麼？

（這篇是之前寫給台加的，所以很淺很白話。）

隨著科技日新月異，以前沒想過會發生的事，現在飛速前進地快要超越人類的想像，人們也要開始思考這些改變將如何影響生活，例如 Airbnb 和 Uber 帶給旅遊業和計程車業的衝擊。同樣的情況也發生在生物科技，以前以為做不到的事，現在看起來似乎有可能發生，我們也許也要開始思考，人類該如何應變這些進步。這裡介紹幾個目前熱門的技術，在驚嘆它們將如何改變人類生活之餘，它們引起的一些爭議也值得我們思考。

CRISPR-Cas9

CRISPR 的全名是 clustered regularly interspaced palindromic repeats，是古生菌(archaea)的基因體(genome)裡重複的 DNA 片段，當初發現的是西班牙的研究生 FJM Mojica，那時是 1993 年。他從那時起花了近十年的時間持續研這些重複的 DNA 片段的功用，然後在 2012 年的時候正式把它命名為 CRISPR [1]，Cas9 則是其一種切割 DNA 的酵素(endonuclease)。CRISPR-Cas9 是細菌用來對抗病毒感染的一種機制，病毒 DNA 進入細菌後，會嵌入 CRISPR 之間用來偵測之後入侵的病毒，當細菌找到對應的病毒 DNA (跟嵌入 CRISPR 之間為相同的序列)後，Cas9 則會去切碎它，使病毒無法在細菌裡面複製。2012 年，美國柏克萊大學 Dr. Jennifer Doudna 的研究團隊利用這個特性來編輯基因，並把結果發表在 Science 期刊上 [2]，刊出來之後造成轟動。這個技術會引起大量關注除了因為它能用來修正 DNA 裡突變的地方外，它還號稱便宜、快速又好上手，使得科學家們躍躍欲試，想把它應用在自己的研究上。把想要編輯(修正)的基因片段嵌入 CRISPR 之中，Cas9 找到對應的 DNA 序列後會切一個口，這個切口會使 DNA 自行修復，修復的時候會把突變的地方改回正確的，更進一步的技術是可以把它改成你想要的序列。不過，這個技術目前還有個瓶頸需要突破，因為 CRISPR-Cas9 雖然可以把突變的地方修正，但同時也可能會修改到其他地方，把原本正確的地方改成錯誤的，變為其他的突變，或是改到你不想改的地方，而我們不知道可能會被改變的地方是哪裡，只能取一些重要的基因做檢測，因此目前還無法用於人類胚胎上。另外，如何有效地把 CRISPR-Cas9 系統送進體內，讓所有細胞或局部區塊的細胞裡的基因都改正，也是需要繼續研究的地方。

雖然不能用於人類胚胎上，但仍然可用於治療疾病。美國賓州大學的 Dr. Carl June 和其團隊計畫用這個技術來治療 HIV，方法是把病人的免疫細胞 T cells 抽出來後，用 CRISPR-Cas9 插入一個癌症細胞才有的接受器基因 NY-ESO-1，然後阻斷 T cells 表面本來就有的一個蛋白的基因 PD-1，之後再把基因改造過後的 T cells 輸回病人體內，讓它們去殺死癌細胞。這個計畫去年六月已通過美國 NIH 核准，現在在等 FDA 認證，準備在今年年底進入臨床試驗 [3]。

iPS cells

自從日本京都大學的山中伸彌教授找出把已經分化的細胞變回幹細胞的方法後，好像沒什麼不能發生了。卵子受精後成為 zygote，會經過幾次細胞分裂，之後繼續分裂變成 blastocyst，到這個階段的細胞都屬於胚胎幹細胞(embryonic stem cells, ES cells)，這個時期的細胞可以自我複製(self-renewal)，也可以繼續分化(differentiation)成各種細胞，例如表皮細胞。胚胎幹細胞可以說是生命的起頭，而分化後的細胞則是終端，無法再變成其他種細胞。

Blastocyst 的內層細胞通常會被抽取出來體外培養，也就是研究用的 ES cells，這個階段的幹細胞屬於多能性幹細胞(pluripotent ES cells)。而山中伸彌的研究，則是利用四個 transcription factors (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) 把分化後的細胞重新設定(reprogram)，使它變回多能性幹細胞，這些被重新設定的人工多能性幹細胞就是 iPS cells (induced pluripotent stem cells, 誘導性多能幹細胞)。當細胞被變回幹細胞後，你可以誘導它分化成你想要的細胞，例如卵子或精子。這個技術除了避免了使用胚胎幹細胞作為研究用途的爭議，也擴展了治療疾病上的可能性，山中伸彌教授的 iPS cells 研究讓他獲得了 2012 年的諾貝爾生醫獎。

iPS cells 能夠如何應用在治療上面呢？2014 年的時候，日本兵庫縣一位七十歲的女性接受了幹細胞移植手術治療黃斑病(macular degeneration)，地點在鼎鼎有名、位於京都的 RIKEN Centre for Developmental Biology (CBD)。這個手術由三位眼科醫師執行，為首的是任職於神戸市立医療センター中央市民病院的栗本康夫，RIKEN 中心的高橋政代把一位七十歲的女性病患的皮膚細胞轉成 iPS cells 後，再把它轉成 retinal pigment epithelium cells (視網膜色素上皮細胞)，讓它長成一片後，再取一小片細胞植入病患眼中，這是史上第一次用 iPS cells 治療的手術 [4]。 時隔三年後，2017 年三月底，同樣的團隊再度幫另一位病患動同樣的手術治療黃斑病，只是這次用的不是病患自己的細胞，而是別人的，比對過 HLAs (human leukocyte antigens)後可以避免產生免疫反應 [5]。RIKEN 的 iPS cell bank 有人類(HPS)和其他動物(APS)的，每個 iPS cell line 都有詳細的資料，如果可以建立起一個龐大的 iPS cell bank，那使用的用途就會變得比較多，也可以供給更多病患使用（基本上可以變成像幹細胞銀行那樣）。

Genome profile

人類基因體計畫(Human Genome Project)完成於 2003 年，之後 DNA 定序(sequencing)的技術越來越進步，近幾年主要用的技術是次世代定序 NGS (next-generation sequencing)，比原本的定序技術 Sanger sequencing 能定序 DNA 序列的量要大，也讓全基因體定序(whole-genome sequencing, WGS)的價格漸漸降低，從之前的每人要價五千美金降到一千美金左右（和研究計畫合作）。全基因體定序除了能夠幫助科學家們研究各個基因的變異(variations)，也能應用於疾病治療上。目前很夯的 Personalized Medicine (或稱 Precision Medicine)是指針對各個病人做不同的治療，例如乳癌的突變基因除了大家都知道的 BRCA1 和 BRCA2，還有其他種類的突變，不同的突變對藥物的反應不見得一樣，不同的病患也可能對同樣的藥物反應不同，可能這個藥對這個病患有效，但對其他的效果不大。Personalized Medicine 便是對不同的病患設計不同的治療，已達到最大的治療效果。當全基因體定序的資料庫建立起來，便可供大家研究各個基因和其突變間的變異，科學家可以用資料庫裡的基因資料做比對，然後針對某些致病的突變做研究，以利於後面的藥物研發，不同的突變可用不同的治療方式，增加治癒的機率。

註：除了全基因體定序，另有 whole-exome sequencing，是指定序所有已知的 exomes。

關於技術的爭議和需要思考的地方

上面介紹的技術雖然在未來可以解決不少問題，或用來治療目前無法治療的疾病，但仍有些地方是需要考慮的。iPS cells 是目前爭議性最低的，之前科學界用人類的胚胎幹細胞來做研究遭到一些外界的反對，認為違反倫理，而 iPS cells 的出現算是解決了這項爭議，因為可以用 iPS cells 代替人類胚胎幹細胞做研究。不過，類似的爭議同樣浮現在 CRISPR-Cas9 的應用上，例如把 CRISPR-Cas9 用在人類胚胎上面：如果父母對於自己的基因不滿意，我們可以用這個技術去改造胚胎的基因，讓他成為一個完美的小孩嗎？父母有權利用自己主觀的想法去更改小孩的基因嗎？這個例子好像還太遙遠，那如果在父母有遺傳性疾病，我們可以用 CRISPR-Cas9 去編輯受精卵帶有的突變基因嗎？其中的風險有人能幫小孩承擔嗎？當然，要知道自己是否有突變的基因，是否會遺傳給後代，可以做全基因體定序，未來當價格越來越便宜後，是否要為自己的全部基因做定序呢？其中是否會有隱私問題？保險公司是否能因為你帶有高致病風險的基因而提高保費或拒保呢？雖然這些都還沒發生，但隨著科技進步之快速，我們可能要開始思考這其中是否有些界線是不能跨越的，或是當它成為無法阻擋的趨勢時，該如何用法律去規範。



References

1. E Lander. The Heroes of CRISPR. Cell (2016)
2. M Jinek and K Chylinski et al. A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science (2012)
3. First CRISPR clinical trial gets green light from US panel. Nature (2016)
4. Japanese woman is first recipient of next-generation stem cells. Nature (2014)
5. Japanese man is first to receive 'reprogrammed' stem cells from another person. Nature (2017)

把 CRISPR 用在人類胚胎上：這次換美國了~

上禮拜五消息出來後，論文發表在今天的 Nature 上惹。

美國的團隊是 OHSU (Oregon Health and Science University)的胚胎生物學家 Dr. Shoukhrat Mitalipov 帶領的，他之前有做過粒線體移植，不過這個技術目前在美國尚未合法。

關於粒線體移植，請參考這篇：《MRT: 有三個父母的小孩》

他這次做的 CRISPR 編輯胚胎是三年前就跟 OHSU 申請要做的，由於人道因素，美國政府不贊助這個計畫，所以研究經費來自各方，OHSU 是由學校出的，合作實驗室 Salk Institute 則是由慈善機構贊助的。這個計畫的目標基因是 MYBPC3，蛋白質產物為 mMyBP-C (cardiac myosin-binding protein C )，控制肌肉的收縮和放鬆，其突變會造成左心室肥大(hypertrophic cardiomyopathy, HCM)，且是顯性基因，只要有一個 copy 突變就有可能會引起突發性 cardiac arrest，最常發生在年輕的運動選手身上。他把計畫申請送出去後，有些人認為沒做的必要，因為同時帶有兩個突變 copy 的人很少(太嚴重活不久且難存活)，所以至少有 50% 的機會把正常的 copy 傳給下一代，而且如果是人工受孕(IVF, 體外受精)的話，也可以把帶有突變的胚胎挑掉，不過最後 Mitalipov 還是排除眾議做了。

這個研究是用健康的卵子，和帶有 MYBP3 突變(4-bp GAGT deletion)的精子。和之前中國團隊做法不同的地方是他們把 CRISPR-Cas9 和精子一起送進卵子裡，而不是等他們結合成受精卵了之後再送進去，希望能因此增加成功率(也就是所有細胞都被修正，而不是只有部分細胞的基因被修正，造成馬賽克 mosaics 的情況)，而且 Cas9 在細胞中降解(degrade)的很快，所以也可以減少 off-target mutatons (編輯到其他的基因)。結果咧？58 顆受精卵有 42 顆的突變被成功修正(兩個 MYBP3 copy 都是正常的)，只有一顆受精卵是 mosaic 的情況，成功率高達 75%，且沒發現有 off-target mutations 的情形。如果是受精十八小時後才把 CRISPR-Cas9 送進去的話，54 顆受精卵就有 13 顆是 mosaic，成功的則有 36 顆(66.7%)。

中國團隊的 CRISPR 應用結果，請參考這篇：《關於 CRISPR-Cas9》

不知道各位是怎麼想的呢？經過文章裡一提起，才想到說既然都要用 CRISPR-Cas9 惹，就表示一定是人工受孕，也就是說不管是什麼樣的治病突變都是可以被挑掉的，所以其實胚胎的基因編輯好像沒那麼必要，除非是父母雙方其中一位的兩個 copy 都帶有突變，不管怎樣都會帶給小孩，才有編輯修正的必要性。而且，我覺得沒有 off-target mutations 這件事很難被證實，因為你沒發現不代表沒有，有可能只是你沒掃到而已，除非你把所有的基因都定序了，才能確定沒有 off-target mutations。如果真的要用在臨床上，可能就要看父母想不想賭了吧。（是說小孩有想賭嗎？）（我個人是屬於「如果帶有疾病，拜託別生下我」這種。）



Articles:

Science / First U.S.-based group to edit human embryos brings practice closer to clinic (2017)

Nature / CRISPR fixes disease gene in viable human embryos (2017)


Paper:

H Ma et al, Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos. Nature (2017)

關於 CRISPR-Cas9

（這篇只是把之前幫別人寫的整理一下）

CRISPR 的全名是 clustered regularly interspaced palindromic repeats，是古生菌(archaea)的基因體(genome)裡重複的 DNA 片段，當初發現的是西班牙的研究生 Francisco Mojica JM Mojica。1992 年，當他在研究 Haloferax mediterranei 的時候，發現了十四個不尋常的 DNA 片段，每個約 30 bp，從 5' 讀或是從 3' 讀幾乎都一樣(也就是 palindromic)，大概每 35 bp 會重複一次。他對這些重複的 DNA 片段充滿好奇和興趣，並且決定研究這些 DNA 片段，只是研究室缺少 funding (幫 QQ)，不過還是花了近十年的時間持續研這些 DNA 片段的功用。2012 年的時候，這些重複的 DNA 片段正式被命名為 CRISPR。Cas (CRISPR-associated protein) 則是其一種切割 DNA 的酵素(endonuclease)。CRISPR-Cas9 是細菌用來對抗病毒感染的一種機制，病毒 DNA 進入細菌後，會嵌入 CRISPR 之間用來偵測之後入侵的病毒，當細菌找到對應的病毒 DNA (跟嵌入 CRISPR 之間為相同的序列)後，Cas9 則會去切碎它，使病毒無法在細菌裡面複製（如圖）。


Figure: Nature 2017 (doi: 10.1038/541280a)

2012 年，美國柏克萊大學 Dr. Jennifer Doudna 的研究團隊利用這個特性來編輯基因，並把結果發表在 Science 期刊上 (Jinek et al, 2012)，刊出來之後造成轟動。這個技術會引起大量關注除了因為它能用來修正 DNA 裡突變的地方外，它還號稱便宜、快速又好上手，使得科學家們躍躍欲試，想把它應用在自己的研究上。在此之前的基因編輯技術有 ZFN (zinc finger nucleases)，要價超過五千鎂，且費時費力。

把想要編輯(修正)的基因片段嵌入 CRISPR 之中，Cas9 找到對應的 DNA 序列後會切一個口，這個切口會使 DNA 自行修復，修復的時候會把突變的地方改回正確的，更進一步的技術是可以把它改成你想要的序列。不過，這個技術目前還有個瓶頸需要突破，因為 CRISPR-Cas9 雖然可以把突變的地方修正，但同時也可能會修改到其他地方，把原本正確的地方改成錯誤的，變為其他的突變，或是改到你不想改的地方，而我們不知道可能會被改變的地方是哪裡，只能取一些重要的基因做檢測，因此目前還無法用於人類胚胎上。另外，如何有效地把 CRISPR-Cas9 系統送進體內，讓所有細胞或局部區塊的細胞裡的基因都改正，也是需要繼續研究的地方。

只是，雖然技術上還不能用於人類胚胎上，但已經有人躍躍欲試了，中國科學家在 2015 年的時候利用 CRISPR-Cas9 編輯了人類胚胎。他們用人工授精(in vitro fertilization, IVF)後剩下的卵子和精子，把兩個精子和一個卵子結合後，再把 CRISPR-Cas9 打進 86 個胚胎，結果只有四個受精卵有修改到他們想要編輯的地方，成功率只有 4%，而且發現有很多 off-target mutations。他們本把結果先投稿到 Nature 和 Science，但鑑於違反倫理這兩大期刊皆拒絕刊登，於是他們改投到中國國內的期刊，發表出來後便引起爭議，好幾位科學家聯名發文在 Nature，呼籲科學家做研究不能違反倫理，在技術尚未純熟、安全之前，不能應用於人類胚胎上。

是說中國應該是沒在管這些倫理的東西，因為他們又再一次試在人類杯胎上，一樣是用人工授精剩下的卵子和精子，只是這次是正常的一個卵子和一個精子結合的受精卵，精子是帶有治病的突變基因。其中一種是中國常見的，會對蠶豆過敏的突變 G6PD G1376T，用的兩個受精卵有一個胚胎成功，另一個只有部分細胞有成功改正突變，其他的細胞有的是 knock down 而已，並沒有改正突變。另一種則是會造成地中海貧血(beta-thalassemia)的 beta41-42，四個試驗的胚胎中有兩個胚胎沒改成，一個不但沒改成，還製造了其他的突變，最後一個是只有部分細胞有成功改正突變。嚴格說起來，六個試驗的胚胎只有一個成功，成功率雖然比第一次高，但也只有 16% 左右。

雖然不能用於人類胚胎上，但仍然可用於治療疾病。美國賓州大學的 Dr. Carl June 和其團隊計畫用這個技術來治療 HIV，方法是把病人的免疫細胞 T cells 抽出來後，用 CRISPR-Cas9 插入一個癌症細胞才有的接受器基因 NY-ESO-1，然後阻斷 T cells 表面本來就有的一個蛋白的基因 PD-1，之後再把基因改造過後的 T cells 輸回病人體內，讓它們去殺死癌細胞。這個計畫去年六月已通過美國 NIH 核准，現在在等 FDA 認證，準備在今年年底進入臨床試驗。


延伸閱讀：CRISPR-Cas9 的專利大戰和爭議



Articles:

Nature / CRISPR, the disruptor (2015)

Nature / Chinese scientists genetically modify human embryos (2015)

Nature / Don’t edit the human germ line

Nature / Embryo editing sparks epic debate (2015)

Nature / Gene-editing research in human embryos gains momentum (2016)

Science / CRISPR debate fueled by publication of second human embryo–editing paper (2016)

Nature / Five big mysteries about CRISPR’s origins (2017)

ScienceNews / Gene editing of human embryos yields early results

CRISPR-Cas9 的專利大戰和爭議 (updated)

要說現在生科當紅的技術是什麼，大概有 90% 的人會說是 CRISPR-Cas9（欸是 CRISPR 不是 CASPER 哦雖然長得有點像）（現在有人知道 CASPER 是什麼嗎？），不過 CRISPR-Cas9 至今引起的爭議不少，不論是在專利上面，還是在應用上的倫理問題。CRISPR 的全名是 clustered regularly interspaced palindromic repeats，當初發現的是西班牙的研究生 FJM Mojica，那時是 1993 年。他從那時起花了近十年的時間持續研究古生菌(archaea)裡這些重複的 DNA 片段，2012 年的時候正式把它命名為 CRISPR [10]，Cas9 則是其一種切割 DNA 的酵素(endonuclease)，CRISPR-Cas9 是細菌用來對抗病毒感染的一種機制。（持續二十年耶都在研究同樣的東西沒變心，好有毅力真佩服，這就是真愛阿！而且這是基礎研究，Mojica 當初研究的時候可能沒有想到後來會被拿來當 gene editing 的工具，說不定還有人覺得為什麼要花納稅人的錢研究這些感覺沒什麼用的 archaea。）

"Efforts focused entirely on examining basic mechanisms are always a hard sell for the public. Without an end goal, such efforts are intrinsically hardest to justify but without them everything from CRISPR to the Higgs Boson would remain undiscovered." -- Dr. Gord Fishell, Professor and Associate Director of the NYU Neuroscience Institute (Neuron 2016, doi: 10.1016/j.neuron.2016.07.045)

（.... a hard sell for the public..... 基礎科學的心酸啊~~ QQ）

2007，Montana State University 的博士生 Blake Wiedenheft 因為讀到關於 CRISPR 的研究覺得很有趣，便找到 UC Berkeley 的分子生物學家 Jennifer Doudna，之後加入她的團隊，接下來的五年，他在 Doudna 的實驗室研究 CRISPR [1]，2012 年二月的時候在 Nature 發表了一篇 review 解釋 CRISPR-Cas9 的機制 [11]，接著同年六月，Doudna 實驗室和 Charpentier 的團隊合作發表了一篇在 Science [12]，說他們可以使 Cas9 在他們指定的地方做一個切割的動作，就是讓 Cas9 在他們想要它切的地方把 DNA 切開。

隔年三月，Doudna 和 Charpentier 送件把這項技術申請專利，不過同年包括 Doudna 團隊在內，共有三篇關於 CRISPR-Cas9 的研究被發表，然後 MIT Broad Institue 的合成生物學家 Feng Zhang 也在十月送件申請專利，不過呢，因為 MIT 是用特急件申請，隔年也就是 2014 年的四月就得到 CRISPR-Cas9 的專利權，而最先申請的 Doudna 和 Charpentier 反而到現在還在審查當中 [2]。（好慘，幫 QQ。）

想也知道 Doudna 和 Charpentier 對於 Zhang 先拿到專利權不服(要是我也不服阿)，便在去年向 USPTO 申請調查，看到底誰才第一個發展這個技術的，於是現在變成 CRISPR-Cas9 專利權爭奪大戰，最後會落到誰家還不知道。這個專利權如果成立，則會變成 patent interference，將會對所有相關研究產生影響，因為用到這項技術的研究或實驗室都要付專利費用。不過在目前專利權還沒判決出來之前，已經有公司在賣這項技術了，像是無所不在的 Thermo Fisher。XD（不過這項技術號稱便宜又簡單，連笨蛋新手都可以輕易上手。）

"A final “nuclear option” if the Doudna/Charpentier application is not granted, Sherkow said, would be a patent dispute in court that could potentially leave both parties empty-handed. He estimates it could be three to five years before the CRISPR IP landscape will be fully settled. In the meantime, researchers and companies are employing a variety of strategies to make use of the hot technology now." (The Scientist, 2015)

（私心覺得這是最好的結果，大家可以免費使用這項技術，至於誰該得諾貝爾獎.... 那就讓評審們去傷腦筋吧。XD）

除了專利上的爭議外，MIT Broad Institue 的院長 Eric Lander 在國際三大期刊之一的 Cell 發表的一篇文章也引起爭議 [3, 10]，有裝 PubPeer 外掛的可以看到這篇文章下面吵得很精彩 XD（或點這個連結 https://goo.gl/OjdxKM）。因為 Lander 本身是 Broad Institute 的院長，而 Broad Institute 目前還在 CRISPR-Cas9 專利權爭奪戰中，他發這篇文章有利益衝突(conflict-of-interest)之嫌，加上有些人覺得他的文章忽略了一些人的貢獻，排除這些之外，這篇文章倒是講述了 CRISPR-Cas9 這二十幾年來的歷史。

"The lengths to which Lander goes to downplay Doudna's contribution are stunning. Virtually all major players are introduced with their own paragraph except Doudna, whose name appears mid-way through a paragraph about Charpentier (compare with introductions of e.g. van der Oost, Marrafini, Siksnys, Zhang). He also omits the fact that Doudna had already published 10 papers on CRISPR before her paper with Charpentier. "She had been using crystallography and cryo-EM to solve structures...." - no mention of any of the many insights from her work, in striking contrast to the detailed accounting of virtually all other investigators. The intended impression seems to be that she was a minor player, putting out a couple of technical observations, before her chance meeting with Charpentier."

然後連 Doudna 和 Charpentier 本人也加入戰局，在 PubMed 底下留言。XD

Charpentier: "I regret that the description of my and collaborators’ contributions is incomplete and inaccurate. The author did not ask me to check statements regarding me or my lab. I did not see any part of this paper prior to its submission by the author. And the journal did not involve me in the review process."

Doudna: ""…the author engaged in substantial fact checking directly with the relevant individuals." However, the description of my lab’s research and our interactions with other investigators is factually incorrect, was not checked by the author and was not agreed to by me prior to publication."

（跳一下）

這篇文章的最後說 Zhang 的專利 filed date 是 2012 十二月，但是根據專利號碼 US8697359（https://www.broadinstitute.org/files/shared/osap/pdf/US8697359.pdf）查到上面是寫 2013 十月，而且專利權的 references cited 部分，Wiedenheft 的那篇是 2011 年的 review [11]，而不是 Jinek 2012 的那篇 [12]，另外比他前面的兩篇也都是 review 而已，只有跟他同年發表，Haurwitz (Doudna Lab) 2013 年的 PNAS 那篇不是 review，感覺 Lander 的最後幾段有點刻意想強調這些都是 2012 年發生的哦，比 Jinek 2012 那篇還早。（關於時間序這點 PubPeer 上面也有人質疑）

3/2010 Sontheimer et al --> 這篇是 review
8/2011 Terns et al --> 這篇也是 review
9/2011 Wiedenheft et al --> Doudna Lab 的這篇還是 review
5/2013 Haurwitz et al --> 只有 Doudna Lab PNAS 的這篇不是 review，但是 Zhang 申請專利的的那篇(Cong et al)也是 2013 年的。

"A lot of claims, no references. How could anybody verify that Feng Zhang indeed observed the described effects in April 2011? Many other claims that are not verifiable, as no references are provided. Not very scientific, Dr. Lander."

（跳回來）

*08.20.2016 updated*

不過呢，嘖嘖~ 現在精彩了，前兩天公佈 Doudna 的一封 e-mail，是 Zhang 之前的學生 Shuailiang Lin 在 2015 年二月時寫給 Doudna 的，說他們當時一直都失敗，直到看了她們 2012  的那篇 paper (Jinek et al, Science 2012 [12])才成功，所以專利應該是屬於 Doudna 他們的，他只是想闡述事實。MIT Broad 的回應是 Lin 說的不是事實，而且他寫那封 e-mail 是在工作簽證到期、急著找下一份工作之時，信裡有部分是說希望去 Doudna 的實驗室工作 [13, 14]。到底真相是什麼呢？

MIT 和 UC Berkley 目前都花了約 5M 鎂在打專利官司上面，預估會花超過 10M [15]，不過拿到專利之後賺的錢應該會遠遠超過 10M，而且還有可能得到諾貝爾獎，花這錢值得啊，不知道最後專利權會判給誰。是說上個月看到一篇財經報導說，CRISPR 已經引起投資者關注，預估會吸引到超過 1B 鎂的投資，在 2019 年的時候 gene-editing 的市場可以達到 3.5B 鎂的價值，但是目前連專利權到底會是誰的都不知道，所以現在丟錢是在賭誰會贏嗎？XD

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雖說學界知道 CRISPR 這個東西已經有 20 年了，不過真的可以應用在 gene-editing 上面的話，第一篇發表的 paper 應該是 Jinek 2012 那篇吧，到現在也不到五年的時間，今年六月已通過美國 NIH 核准，現在在等 FDA 認證，準備在今年年底進入 clincial trial，用來治療 HIV [4]，這項技術的發展真的超神速。這個臨床試驗是由 UPenn 的 Carl June 領導，把病人的免疫細胞 T cells 抽出來後，用 CRISPR-Cas9 插入一個癌症細胞才有的接受器基因 NY-ESO-1，然後阻斷 T-cells 表面本來就有的一個蛋白的基因 PD-1，之後再把基因改造過後的 T-cells 輸回病人體內。CRISPR-Cas9 目前最大的瓶頸就是會出現 off-site target editing，不過 June 說他們檢測了 148 個他們擔心會被 Cas9 切掉的基因，發現都是切在沒有影響的地方 [5]。聽起來好像滿安全的，不過只檢測了 148 個基因感覺有點少。

除了上面說的專利權爭議外，就是應用上的爭議，像是用在人類胚胎上有倫理上的問題，之前吵比較大的大概就是中國有研究團隊把 CRISPR-Cas9 用在人類胚胎上，他們本來是想把那篇研究發表在 Nature 或 Science 上的，結果這兩大期刊都覺得這在倫理上有問題便退了他們的稿 [9]，沒想到中國團隊就把它發表在某個小期刊上，之後就有好幾位科學家聯名在 Nature 上發了一篇文章請大家正視這個問題 [6]，Nature 也一連發了好幾篇相關新聞 [7-9]。

（題外話）今天實驗室聊到 CRISPR-Cas9 的臨床試驗，我們實驗室有人知道 CRISPR-Cas9 進入臨床後覺得沮喪，原因是他認為這樣看來 CRISPR-Cas9 似乎可以取代任何藥物治療，那他以後就沒工作了。（哭哭 XD）


2017 updated news [16-20]:

MIT Broad 贏了美國的專利，因為法官認為 MIT 和 UBC Berkeley 的專利不衝突，MIT 申請的專利並不涵蓋在 UC Berkeley 的之下，但是歐盟給了專利給 UC Berkeley，認為 UC Berkeley 的發明就已經包括 prokaryotic 和 eukaryotic，所以專利應該是屬於 UC Berkeley。


2022 updated news [21-23]:

Dr. Doudna 和 Dr. Charpentier 雖然得到 2020 Nobel Prize 的化學獎，但卻在 2022 年年初打輸了打了七前的 CRISPR 專利權官司，真是令人桑心。QQ



延伸閱讀：

關於 CRISPR-Cas9

把 CRISPR 用在人類胚胎上：這次換美國了~


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Articles:

1. H Ledford. The unsung heroes of CRISPR. Nature, News (2016)

2. Bitter fight over CRISPR patent heats up. Nature (Jan 2016)

3. The Scientist: “Heroes of CRISPR” Disputed

4. S Reardon. First CRISPR clinical trial gets green light from US panel. Nature, News (2016)

5. J Kaiser. First proposed human test of CRISPR passes initial safety review. Science, News (2016)

6. E Lanphier et al. Don’t edit the human germ line. Nature (2015)

7. D Cyranoski. Scientists sound alarm over DNA editing of human embryos. Nature, News (2015)

8. D Cyranoski. Ethics of embryo editing divides scientists. Nature, News (2015)

9. D Cyranoski and S Reardon. Chinese scientists genetically modify human embryos. Nature, News (2015)

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Publications:

10. E Lander. The Heroes of CRISPR. Cell (2016)

11. B Wiedenheft et al. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature (2011)

12. M Jinek and K Chylinski et al. A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science (2012)

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Updated news:

13. MIT Technology Review / In CRISPR Fight, Co-Inventor Says Broad Institute Misled Patent Office (Aug 17, 2016)

14. STAT / Lies, damn lies, and CRISPR: the legal battle escalates (Aug 17, 2017)

15. STAT / CRISPR patent fight: The legal bills are soaring (Aug 16, 2016)

16. Science / Round one of CRISPR patent legal battle goes to the Broad Institute (Feb 2017)

17. Nature / Broad Institute wins bitter battle over CRISPR patents (Feb 2017)

18. The Scientist / Broad Wins CRISPR Patent Interference Case (Feb 2017)

19. Science / Europe says University of California deserves broad patent for CRISPR (March 2017)

20. The Scientist / UC Berkeley Receives CRISPR Patent in Europe (March 2017)

21. Science / The latest round in the CRISPR patent battle has an apparent victor, but the fight continues (Sept 2020)

22. Science / New CRISPR patent hearing continues high-stakes legal battle (Feb 2022)

23. Science / CRISPR’s Nobel Prize winners defeated in key patent claim for genome editor (March 2022)


補充：Doudna's TED Talk