降解蛋白質的密碼

不知道大家對 degron 的了解有多少。細胞內的蛋白質經過一段時間後會被降解(degradation)，降解的方式有兩種：proteasomal 和 lysosomal。顧名思義，proteasomal 就是被 proteasome 降解，lysosomal 就是被 lysosome 降解。（廢話 XD）

大家可能已經知道的蛋白質被送到 proteasome 降解前，會被 E3 ligase 加一個標籤，就是 ubiquitin。E3 ligase 的輔助蛋白(adaptors)會幫它找到要降解蛋白質，怎麼找呢？就是辨識蛋白質尾端(C-terminus)的幾個氨基酸，那幾個氨基酸就是 degron。而不同的 adaptors 辨識的氨基酸也不同。我會知道 degron 是因為之前的研究，當你在蛋白質後面加上 degron，它就會被降解。如果說你知道 A 蛋白和 B 蛋白的某個片段 interact，你可以在 B 蛋白的那個片段後面加上 degron，利用加惹 degron 的片段去 knock down 蛋白 A。（想了解如何應用 degron 的話可以參考我前實驗室老闆發表的這篇： X Fan et al, Nature Neuroscience 2014; doi: 10.1038/nn.3637）

這篇研究做了一些分析，找出當蛋白質尾端是哪幾個氨基酸時，會被 adaptors 辨識出來，然後讓 E3 ligase 幫它標籤後送去降解。他們分析了兩種 E3 ligase：CRL2 和 CRL4。

CRL2 的其中一個 adaptor KLHDC3 辨識的是最尾端(-1 position)是否為 glycine，還有倒數第二(-2 position)是否為鹼性(basic)氨基酸，像是 arginine (R) 和 lysine (K)，也就是說 KLHDC3 辨識的最後兩氨基酸主要為 -RG 和 -KG。另一個 adaptor KLHDC2 辨識的則是 -GG，而 LKHDC10 辨識的是 -WG, -PG 和 -AG。另外，APPBP2 辨識的 -RxxG 不需要在最後，比較常見的是 RxxGx 和 RxxGxx。

他們分析的另一個 E3 ligase Cul4 (CRL4)，其 adaptors 辨識的氨基酸又不同。它的 DCAF12 辨識的是 -EE，而它的 TRPC4AP 辨識的是倒數第三個的 arginine (R-3 motif)。

除了以上的規則外，當最後一個氨基酸是 glycine 的時候會被送去降解，但是當倒數第二(-2 position)和第三個(-3 position)氨基酸是酸性(acidic)或是避水性(hydrophobic)的時候，像是 aspartic acid (D), glutamic acid (E), isoleucine (I) 或是 valine (V) 的時候，則會使蛋白質避免掉降解，例如當尾端是 -DG 或是 -EG 的時候。另外，當酸性氨基酸配上 lysine 的時候，也就是 -DK 和 -EK 的時候，也會使蛋白質穩定，避免被降解。

看到這裡，可能會有個疑問，那這樣不是會有一堆蛋白質被降解掉嗎？有趣的是他們分析後發現，大多數的蛋白質尾端都不是 glycine，而且這個現象只出現在 eukaryotic 和病毒的蛋白，細菌的蛋白質尾端是 glycine 明顯多很多，可能是因為細菌並沒有 proteasome。

Degron 的應用有其優缺點，優點是你只要知道 interaction site，就可以 knock down (K/D) 任何蛋白，而且它很短，所以容易製作。缺點則是並非所有的 interaction site 都可以拿來用，需要 affinity 夠強，有些 papers 雖說用 co-IP 找到和確認 binding motifs，但是裝上 degron 後發現它不夠強到可以 K/D 蛋白質，另外就是它不夠 stable。



原論文：

I Koren et al, The Eukaryotic Proteome Is Shaped by E3 Ubiquitin Ligases Targeting C-Terminal Degrons. Cell (2018)

戒酒藥可以殺死癌細胞

有意思哩！六十年來被用來當戒酒藥的 disulfiram（商品名 Antabuse / Antabus / 戒酒硫）也可以抗癌。在 1971 年的時候有篇臨床報告說一位 38 歲的乳癌病患因為癌細胞擴散到脊髓無法醫治而開始酗酒，醫生為了讓她戒酒便給她吃戒酒藥。十年後病患過世了，沒想到解剖後發現，她的腫瘤消失了，脊髓裡只剩一點癌細胞而已。在那之後，有幾個臨床研究和老鼠實驗也顯示 disulfiram 可以阻止癌細胞生長，雖然如此，disulfiram 並沒有因此受到很大個關注。

Drug Bank: disulfiram (tetraethylthiuram disulfide, DSF)

Disulfiram (DSF) 作用在 aldehyde dehydrogenase (ALDH)，ALDH 是酒精代謝過程中需要的酵素(如圖)，負責把 acetaldehyde 轉換成 acetate，disulfiram 抑制了 ALDH 後會造成 acetaldehyde 堆積在體內，會讓人感到極度的不適。



在這期的 Nature 中有篇由美國、捷克和丹麥合作的研究，檢視了在 2000 年到 2013 年間 240,000 位癌症患者和他們的用藥，發現在三千位有用 Antabuse 的患者中，有持續用藥的患者死亡率比後來停用的患者低惹 34%。這研究中檢視的不只是乳癌，還有攝護腺癌、直腸癌和其他種癌症，disulfiram 對它們的效果都是一樣的。此研究也顯示 disulfiram 可以減緩老鼠體內乳癌腫瘤的生長，並且和銅(copper, Cu)一起使用的話效果更好，喂有 disulfiram 的老鼠其腫瘤比沒有吃的小 57%，而和銅(DSF/Cu)一起吃的老鼠其腫瘤比沒吃的小 77%。他們也比較了這兩種飲食在老鼠體內代謝情形，disulfiram 在體內的主要代謝物 ditiocarb (diethyldithiocarbamate, DTC)會和銅結合成 CuET。吃了 DSF/Cu 的老鼠，CuET 在肝臟和血清(plasma)的含量比只吃 DSF 的高(感覺是廢話 XD)，但有趣的是吃 CuET 的老鼠其腫瘤細胞裡的 CuET 量比其他器官高(只吃 DSF 的老鼠也有同樣的情形，但沒有高那麼多)，而在細胞株上的檢測也顯示 CuET 的毒性(toxicity)比代謝物 DTC 本身還高。

他們發現 CuET 會和 NPL4 結合，NPL4 是 ATPase p97 (VCP) 的 adaptor protein，它通常會和另一個 cofactor, Ufd1, 一起和 p97 結合變成一個 complex (Npl4-Ufd1-p97)。p97 有很多不同的 cofactors，和不同的 cofactor 結合會執行不同的功能，其中主要的是把被 ubiquitin (Ub) 標記的蛋白質(Ub-proteins)從細胞內的細胞膜(i.e., ER membrane)中或是 protein complex 中抓出來，讓其能夠被降解(degradation)，它參與的蛋白質降解管道有 proteasomal degradation 和 ERAD (ER-associated degradation)，而和 NPL4 合作後的功用是負責 Ub-proteasome-mediated degradation，但是 CuET 和 NPL4 結合的話便會抑制它的功能。p97 和 NPL4 都是 cytosolic proteins，但當把 CuET 加到細胞上後，NPL4 無法執行功能，Ub-proteins 無法被降解而堆積在細胞中，引起後續的死亡反應。他們發現 CuET 會引發細胞的 UPR (unfolded protein response) 和 HSR (heat-shock response)。

所以目前可能的情況是 disulfiram 的代謝物 DTC 和銅結合後會抑制 p97-NPL4-Ufd1 參與的蛋白質降解功能，大量無法被降解的 Ub-proteins 在細胞裡堆積，引發癌細胞的死亡反應。因為 CuET 只會堆積在癌細胞腫瘤，所以這也可能是為什麼正常人吃 disulfiram 除了不適外沒有其他問題，只是 ..... 為什麼 CuET 只會堆積在癌細胞腫瘤中，原因還不清楚。

另外一個我覺得有趣的點是根據 Drug Bank 的資料，disulfiram 還有一個功能是：inhibits the peripheral benzodiazepine receptor.



Article:

Science / An old drug for alcoholism finds new life as cancer treatment


Paper:

Z Skrott et al, Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature (2017)