未來.... 我們可以把皮膚細胞變成小寶寶嗎？

自從日本京都大學的山中伸彌教授找出把已經分化的細胞變回幹細胞的方法後，好像沒什麼不能發生了。有唸過 developmental biology 的都知道，卵子受精後成為 zygote (這時候是 totipotent)，會經過幾次細胞分裂，中間歷經 murula 的階段(約 10-30 個細胞)，之後繼續分裂變成 blastocyst (這時候是 pluripotent)。在 totipotent 和 pluripotent 的階段，細胞都屬於 embryonic stem cells (ES cells)，這時候的細胞可以自我複製(self-renewal)，也可以繼續分化(differentiation)成各種細胞，例如表皮細胞。

Blastocyst 階段的初期主要是兩種細胞：pluripotent inner cell mass (ICM) 和外層的 trophectoderm (TE)。之後 ICM 之後會分化成 epiblast (primitive ectoderm) 和 hypoblast (primitive endoderm)。在 blastocyst 後期，epiblast 會分化生殖細胞(primordial germ cells, PGCs)，而 hypoblast 和 TE 則會變成 extra-embryonic endoderm。PGCs 在雄性動物體內會變成精子(spermatozoa)，在雌性動物體內則會變成卵母細胞(oocyte)。


Figure: W Tang et al, Nature Reviews Genetics 2016 (doi:10.1038/nrg.2016.88)

ES cells 可以說是生命的起頭，而分化後的細胞則是終端，無法變成其他種細胞。Blastocyst 裡面的 ICM 可以被挑出來體外培養，也就是研究常用的胚胎幹細胞(embryonic stem cells, ESCs)。而山中伸彌的研究，則是利用四個 transcription factors (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) 把分化後的細胞重新設定(reprogram)，使它變回 pluripotent ES cells，這些被重新設定的人造幹細胞就是 iPS cells (induced pluripotent stem cells)。當細胞被變回幹細胞後，你可以誘導它分化成你想要的細胞，例如卵子或精子。


Figure: modified from M. Berdasco et al, Stem Cell Research & Therapy 2011 (doi: 10.1186/scrt83). EE: extra-embryonic tissue, ICM: inner cell mass.

在老鼠的生長過程中，約在胚胎期第六天(embryonic day 6, E6)時，extra-embryonic ectoderm 會釋放出訊號蛋白 Bmp4 (bone morphogenetic protein 4)，誘導 epiblast 生成生殖細胞。Epiblast 跟 ICM 同樣可以體外培養，由 epiblast 培養出來的則是 epiblast stem cells (EpiSCs)。

2011 年的時候，日本京都大學的斎藤通紀(Mitinori Saitou)和九州大學的勝彥林(Katsuhiko Hayashi)嘗試在體外(in vitro)誘導由公鼠胚胎取出的 ESCs，使其分化成 epiLCs (induced epiblast-like cells)，之後再把 epiLCs 誘導分化成 PGCLCs (PGC-like cells)。他們也試著把三株山中彌伸的 iPSCs (20D17, 178B5, 492B4) 轉成 PGCLCs，這三株是由老鼠的 embryonic fibroblasts 轉成的。他們把這些 ESC-derived 和 iPSC-derived PGCLCs 放進公鼠體內(testes, 睪丸)後，這兩種從體外誘導生成的 PGCLCs 都成功變成可受精的精子(spermatogenesis)，和卵子受精後長成的小鼠也都一切正常 [3, 10]。隔年 2012 年，他們嘗試是否也可以體外誘導母鼠胚胎的 ESCs，使其分化成有功能的 epiLCs 和 PGCLCs。同樣的，他們把母鼠胚胎的 ESCs 在體外分化成 PGCLCs，然後放入母鼠體(ovaries, 卵巢)內，這些從 PGCLCs 分化成的可受精的卵子(oogenesis)被放入母鼠體內後，也長成的正常的小鼠 [1-3, 11]。不過，由體外 ESCs 和 iPSCs 誘導分化成的精子和卵子雖然可以順利受精和生長，但在分化成卵子的階段成功率並不高，有的卵子很脆弱，有的染色體數目不正常 [2, 3, 11]。

之後，他們嘗試讓整個卵子生成的過程都在體外發生，在體外分化(in vitro differentiation, IVDi)、在體外生長(in vitro growth, IVG)和在體外熟成(in vitro maturation, IVM)。他們在培養皿裡製造類似卵巢的環境，也就是讓 PGCLCs 和女性性腺細胞(gonadal somatic cells)混在一起生長，混在一起的細胞團就是 reconstituted ovaries (rOvaries)。培養的最初三個禮拜為 IVDi，可以觀察到初級卵母細胞(primary oocyte)的出現，在第十一天時濾泡(follicles)會出現在卵母細胞周圍。IVDi 期結束後，加了些刺激生長的賀爾蒙到培養液裡，繼續培養了十一天左右，這段時期為 IVG，初級卵母細胞會長成 germ vesicle oocytes (GV oocytes)。經過一天的熟成期(IVM)後，則成為卵子。為了確認這些成熟卵子是可受精的，他們把體外培養出來卵子和正常精子受精後放到母鼠體內，這些受精卵同樣順利長成為小鼠 [5-9, 12]。

為了確認這整套體外卵子生成系統是可行的，他們也試了另外五種細胞株，包括另一株 ESCs (BVSCH14), 兩個由老鼠胚胎 fibroblasts (mouse embryonic fibroblasts, MEFs)轉成的 iPSCs，和兩株由十週大成鼠的尾巴 fibroblasts (tail tip fibroblasts, TTF) 轉成的 iPSCs。結果這五株不管是 ESCs, MEFs, 還是 TTFs，都成功的分化生成為可受精卵子，並且在體外受精、放入母鼠體內後，也順利長成小鼠 [5, 8, 12]。至於這個技術能不能應用在人類身上呢？勝彥和齊藤得到了五年共 1.2 兆日圓(US$1.2M)的經費，預計在未來的五到十年內先試驗在猴子身上 [3]。

2013-2014 年的時候，勝彥和齊藤在英國劍橋大學工作時的指導教 Dr. Surani 和以色列 Weizmann Institute of Science 的教授 Dr. Hanna 用齊藤的方法去誘導人類的 ESCs，也成功使其變成 hPGCLCs，和老鼠不同的地方是人類需要的是 Sox17 (老鼠是要用 Sox2)。雖然他們能夠體外把 ESCs 轉換成 hPGCLCs，但目前還不知道這些 hPGCLCs 能不能夠分化成有功能的精子或卵子，Hanna 說他們之後可能把 hPGCLCs 放到老鼠體內試驗 [4, 13]。

雖然說利用 iPSCs 的技術把人類的表皮細胞變成可受精的卵子或精子，然後生長成嬰兒，好像是並非不可能的事，不過人類的胚胎構造和發展比老鼠複雜很多，加上如果真的能夠成功的話，還得面臨一些人類倫理的問題(想必在法律這關就會拖很久)，所以想要用自己的皮膚製造出一個小孩，可能還要再等等吧。



Articles:

1. The Scientist / Mouse Eggs Made with Stem Cells (October 2012)

2. New Scientist / Mouse eggs created from stem cells for the first time (October 2012)

3. Nature / Stem cells: egg engineers (August 2013)

4. Nature / Rudimentary egg and sperm cells made from stem cells (Dec 2014)

5. The Scientist / From Stem Cell to Oocyte In a Dish (October 2016)

6. Nature / Mouse eggs made from skin cells in a dish (October 2016)

7. Science / Mouse egg cells made entirely in the lab give rise to healthy offspring (October 2016)

8. New Scientist / Eggs made from skin cells in lab could herald end of infertility (October 2016)

9. Scientific American / Healthy Baby Mice Produced from Mouse Mom's Skin Cells (October 2016)



Papers:

10. K Hayashi et al, Reconstitution of the Mouse Germ Cell Specification Pathway in Culture by Pluripotent Stem Cells. Cell (2011)

11. K Hayashi et al, Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell–like Cells in Mice. Science (2012)

12. O Hikabe et al, Reconstitution in vitro of the entire cycle of the mouse female germ line. Nature (2016)

13. N Irie et al, SOX17 Is a Critical Specifier of Human Primordial Germ Cell Fate. Cell (2015)


Other resources:

1. SCQ / Stem Cell Bioengineering

2. BC Open Textbook / Cellular Differentiation (Chapter 3: The Cellular Level of Organization)