讓你返老還童的山中因子

一直以來，老化都被認為是因為基因改變造成的，而這改變主要是基因突變，基因因爲突變而無法表現，進而造成細胞組織和器官的衰竭。不過，近幾年開始，有越來越多研究顯示，事情牟那泥甘單。有學者發現，有些突變率很高的人類和老鼠變並沒有很早就出現老化的現象，而很多老化的細胞又幾乎沒有突變，表示突變並不是造成老化的原因，於是有些人就開始懷疑起其他的原因。在一堆可能的原因中，有一個便是表觀遺傳變化(epigenetic changes)，也就是之前很受著注目的表觀遺傳學(epigenetics)。當 DNA 或是組蛋白(histones)被標記，例如 methylation 或 acetylation，就會影響基因的表現。在 1990s 年代末至 2000s 年代初，哈佛大學的 David Sinclair 實驗室發現在酵母菌或人類身上，老化都會伴隨著表觀遺傳變化，但都無法確認兩者之間的關係，直到今年這篇研究。

Sinclair 和他的研究團隊們認為生物會老化是因為不停地喪失表觀遺傳標記(epigenetic marks)，在細胞不停地修復 DNA 的過程中，這些標記被降解了。為了測試這個理論是不是對的，他們基因改造了老鼠，使切割 DNA 的 I-PpoI (endonuclease) 表現可以被泰莫西芬(tamoxifen, TAM)控制，他們稱這株老鼠為 ICE (inducible changes to the epigenome)。當 ICE 老鼠被給予泰莫西芬的時候，就會啟動 I-PpoI，使它切割染色體，造成大量的斷口(DSB, doouble strand break)，模擬細胞每天可能會遭遇的事，例如被陽光照射或是化學物質對 DNA 造成的損害，然後這些斷口又被細胞內的 Sirtuins 機制修復，在不斷的切割修復後，隨之而來的就是 DNA methylation 被改變了，他們認爲這就是是造成老化的主因。

Sirtuins 屬於第三類 HDAC (histone deacetylases)，廣泛存在於生物中，從細菌到人類，在細胞代謝、DNA 修復與延緩老化中扮演著重要的角色。Sirtuins 在細胞內主要負責修復 DNA 損傷，以及將 DNA 緊密捆綁起來，確保該關閉的基因保持靜默、該開啟的基因正常運作，即維持表觀遺傳的穩定性。

隨著我們年齡增長，生活中的各種壓力會讓細胞累積越來越多的 DNA 損傷，這迫使 Sirtuins 必須不斷離開原本負責監控基因靜默的崗位，趕去修補這些 DNA 裂痕。修復完成後，部分因子未能精確回到原位，導致表觀遺傳景觀隨時間平滑化或侵蝕。除此之外，隨著老化，Sirtuins 運作所需的 NAD+ 濃度會大幅下降，降幅最高可達 50%。因為 NAD+ 的減少，加上 Sirtuins 在修復 DNA 與維持基因靜默這兩個任務之間疲於奔命，最終導致表觀遺傳系統失去控制。原本應該被緊緊封閉的基因鬆開並被錯誤地開啟，這引發了身體各方面機能衰退的骨牌效應。

在不影響 NAD+ 的情況下，只要使 DNA 被切割，在年輕老鼠體內製造 DSB 來轉移 Sirtuins 的注意力，使它們停下調節基因表現得的工作去幫助修復，結束後然後再回到原來的工作位置。但時間久了以後，Sirtuins 被這些大量的切割分心了，它們修復了 DNA 後並沒有回去，於是這些用來調節表現的標記就漸漸消失了，例如很多原本標記 DNA 的 methyl group 不見了，這樣下來，短短三週的干擾就足以讓小鼠的衰老速度加快 50%。平常老鼠的壽命大概兩年半，相較於要兩年左右才老化的老鼠，ICE 老鼠在六個月之後就出現老化現象，包括掉毛和掉色，表示他們的理論是對，控制老化的是這些標記。

不過呢，這一切似乎是可以被恢復的。

還記得因為 iPSC 研究而獲得諾貝爾獎的日本京都大學教授山中伸彌嗎？他發現四個 transcription factors (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) 可以把分化後的細胞重新設定(reprogram)，使它變回多能性幹細胞。這四個 TFs 又被稱為山中因子。



相關文章：山中伸彌的 iPS cells

在山中伸彌得到諾貝爾獎的十年之後，美國聖地牙哥的生技公司 Rejuvenate Bio 和 Sinclair 團隊利用山中因子讓老鼠返老還童。

之前已有研究發現，表現山中因子的基改老鼠在成年的時候有出現返老還童的現象。

Sinclair 團隊的這篇研究除了確認老化是因為表觀遺傳標記喪失而造成的之外，他們還想知道這些標記是否可以恢復，便利用 AAV 運送其中三個因子(OCT4, SOX2 和 KLF4，合稱為 OSK)送進老鼠體內，結果的確有些標記被恢復了，ICE 老鼠的器官和組織又回到年輕的狀態惹。不過，OSK 是怎麼做到的？他們目前還不清楚，可能是帶著染色體坐了時光機回去了吧！（誤）

以前曾和 Sinclair 團隊合作過的 Rejuvenate Bio 則想進一步了解是否未來可以應用在人類身上，也是利用 AAV 運送 OSK 進老年老鼠(124 週老)體內，結果這些老鼠又多活了十八個禮拜，相較之下控制組只多活了九個禮拜。雖然有些研究顯示山中因子可能會致癌，但公司表示他們未發現有什麼不良副作用。


Articles:

Science / Two research teams reverse signs of aging in mice (2023)

Harvard Medical School / Loss of Epigenetic Information Can Drive Aging, Restoration Can Reverse It


Publication:

J Yang et al, Loss of epigenetic information as a cause of mammalian aging. Cell (2023)

CC Macip et al, Gene Therapy Mediated Partial Reprogramming Extends Lifespan and Reverses Age-Related Changes in Aged Mice. bioRxiv (2023)

未來.... 我們可以把皮膚細胞變成小寶寶嗎？

自從日本京都大學的山中伸彌教授找出把已經分化的細胞變回幹細胞的方法後，好像沒什麼不能發生了。有唸過 developmental biology 的都知道，卵子受精後成為 zygote (這時候是 totipotent)，會經過幾次細胞分裂，中間歷經 murula 的階段(約 10-30 個細胞)，之後繼續分裂變成 blastocyst (這時候是 pluripotent)。在 totipotent 和 pluripotent 的階段，細胞都屬於 embryonic stem cells (ES cells)，這時候的細胞可以自我複製(self-renewal)，也可以繼續分化(differentiation)成各種細胞，例如表皮細胞。

Blastocyst 階段的初期主要是兩種細胞：pluripotent inner cell mass (ICM) 和外層的 trophectoderm (TE)。之後 ICM 之後會分化成 epiblast (primitive ectoderm) 和 hypoblast (primitive endoderm)。在 blastocyst 後期，epiblast 會分化生殖細胞(primordial germ cells, PGCs)，而 hypoblast 和 TE 則會變成 extra-embryonic endoderm。PGCs 在雄性動物體內會變成精子(spermatozoa)，在雌性動物體內則會變成卵母細胞(oocyte)。


Figure: W Tang et al, Nature Reviews Genetics 2016 (doi:10.1038/nrg.2016.88)

ES cells 可以說是生命的起頭，而分化後的細胞則是終端，無法變成其他種細胞。Blastocyst 裡面的 ICM 可以被挑出來體外培養，也就是研究常用的胚胎幹細胞(embryonic stem cells, ESCs)。而山中伸彌的研究，則是利用四個 transcription factors (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) 把分化後的細胞重新設定(reprogram)，使它變回 pluripotent ES cells，這些被重新設定的人造幹細胞就是 iPS cells (induced pluripotent stem cells)。當細胞被變回幹細胞後，你可以誘導它分化成你想要的細胞，例如卵子或精子。


Figure: modified from M. Berdasco et al, Stem Cell Research & Therapy 2011 (doi: 10.1186/scrt83). EE: extra-embryonic tissue, ICM: inner cell mass.

在老鼠的生長過程中，約在胚胎期第六天(embryonic day 6, E6)時，extra-embryonic ectoderm 會釋放出訊號蛋白 Bmp4 (bone morphogenetic protein 4)，誘導 epiblast 生成生殖細胞。Epiblast 跟 ICM 同樣可以體外培養，由 epiblast 培養出來的則是 epiblast stem cells (EpiSCs)。

2011 年的時候，日本京都大學的斎藤通紀(Mitinori Saitou)和九州大學的勝彥林(Katsuhiko Hayashi)嘗試在體外(in vitro)誘導由公鼠胚胎取出的 ESCs，使其分化成 epiLCs (induced epiblast-like cells)，之後再把 epiLCs 誘導分化成 PGCLCs (PGC-like cells)。他們也試著把三株山中彌伸的 iPSCs (20D17, 178B5, 492B4) 轉成 PGCLCs，這三株是由老鼠的 embryonic fibroblasts 轉成的。他們把這些 ESC-derived 和 iPSC-derived PGCLCs 放進公鼠體內(testes, 睪丸)後，這兩種從體外誘導生成的 PGCLCs 都成功變成可受精的精子(spermatogenesis)，和卵子受精後長成的小鼠也都一切正常 [3, 10]。隔年 2012 年，他們嘗試是否也可以體外誘導母鼠胚胎的 ESCs，使其分化成有功能的 epiLCs 和 PGCLCs。同樣的，他們把母鼠胚胎的 ESCs 在體外分化成 PGCLCs，然後放入母鼠體(ovaries, 卵巢)內，這些從 PGCLCs 分化成的可受精的卵子(oogenesis)被放入母鼠體內後，也長成的正常的小鼠 [1-3, 11]。不過，由體外 ESCs 和 iPSCs 誘導分化成的精子和卵子雖然可以順利受精和生長，但在分化成卵子的階段成功率並不高，有的卵子很脆弱，有的染色體數目不正常 [2, 3, 11]。

之後，他們嘗試讓整個卵子生成的過程都在體外發生，在體外分化(in vitro differentiation, IVDi)、在體外生長(in vitro growth, IVG)和在體外熟成(in vitro maturation, IVM)。他們在培養皿裡製造類似卵巢的環境，也就是讓 PGCLCs 和女性性腺細胞(gonadal somatic cells)混在一起生長，混在一起的細胞團就是 reconstituted ovaries (rOvaries)。培養的最初三個禮拜為 IVDi，可以觀察到初級卵母細胞(primary oocyte)的出現，在第十一天時濾泡(follicles)會出現在卵母細胞周圍。IVDi 期結束後，加了些刺激生長的賀爾蒙到培養液裡，繼續培養了十一天左右，這段時期為 IVG，初級卵母細胞會長成 germ vesicle oocytes (GV oocytes)。經過一天的熟成期(IVM)後，則成為卵子。為了確認這些成熟卵子是可受精的，他們把體外培養出來卵子和正常精子受精後放到母鼠體內，這些受精卵同樣順利長成為小鼠 [5-9, 12]。

為了確認這整套體外卵子生成系統是可行的，他們也試了另外五種細胞株，包括另一株 ESCs (BVSCH14), 兩個由老鼠胚胎 fibroblasts (mouse embryonic fibroblasts, MEFs)轉成的 iPSCs，和兩株由十週大成鼠的尾巴 fibroblasts (tail tip fibroblasts, TTF) 轉成的 iPSCs。結果這五株不管是 ESCs, MEFs, 還是 TTFs，都成功的分化生成為可受精卵子，並且在體外受精、放入母鼠體內後，也順利長成小鼠 [5, 8, 12]。至於這個技術能不能應用在人類身上呢？勝彥和齊藤得到了五年共 1.2 兆日圓(US$1.2M)的經費，預計在未來的五到十年內先試驗在猴子身上 [3]。

2013-2014 年的時候，勝彥和齊藤在英國劍橋大學工作時的指導教 Dr. Surani 和以色列 Weizmann Institute of Science 的教授 Dr. Hanna 用齊藤的方法去誘導人類的 ESCs，也成功使其變成 hPGCLCs，和老鼠不同的地方是人類需要的是 Sox17 (老鼠是要用 Sox2)。雖然他們能夠體外把 ESCs 轉換成 hPGCLCs，但目前還不知道這些 hPGCLCs 能不能夠分化成有功能的精子或卵子，Hanna 說他們之後可能把 hPGCLCs 放到老鼠體內試驗 [4, 13]。

雖然說利用 iPSCs 的技術把人類的表皮細胞變成可受精的卵子或精子，然後生長成嬰兒，好像是並非不可能的事，不過人類的胚胎構造和發展比老鼠複雜很多，加上如果真的能夠成功的話，還得面臨一些人類倫理的問題(想必在法律這關就會拖很久)，所以想要用自己的皮膚製造出一個小孩，可能還要再等等吧。



Articles:

1. The Scientist / Mouse Eggs Made with Stem Cells (October 2012)

2. New Scientist / Mouse eggs created from stem cells for the first time (October 2012)

3. Nature / Stem cells: egg engineers (August 2013)

4. Nature / Rudimentary egg and sperm cells made from stem cells (Dec 2014)

5. The Scientist / From Stem Cell to Oocyte In a Dish (October 2016)

6. Nature / Mouse eggs made from skin cells in a dish (October 2016)

7. Science / Mouse egg cells made entirely in the lab give rise to healthy offspring (October 2016)

8. New Scientist / Eggs made from skin cells in lab could herald end of infertility (October 2016)

9. Scientific American / Healthy Baby Mice Produced from Mouse Mom's Skin Cells (October 2016)



Papers:

10. K Hayashi et al, Reconstitution of the Mouse Germ Cell Specification Pathway in Culture by Pluripotent Stem Cells. Cell (2011)

11. K Hayashi et al, Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell–like Cells in Mice. Science (2012)

12. O Hikabe et al, Reconstitution in vitro of the entire cycle of the mouse female germ line. Nature (2016)

13. N Irie et al, SOX17 Is a Critical Specifier of Human Primordial Germ Cell Fate. Cell (2015)


Other resources:

1. SCQ / Stem Cell Bioengineering

2. BC Open Textbook / Cellular Differentiation (Chapter 3: The Cellular Level of Organization)

日本的再次突破：用 iPS cells 於臨床治療(黃斑病)

2014 年的時候，日本兵庫縣一位七十七歲的女性接受了幹細胞移植手術治療因年齡而導致的黃斑病(age-related macular degeneration, AMD)，地點在鼎鼎有名的 RIKEN Centre for Developmental Biology (CBD)。這個手術由三位眼科醫師執行，為首的是任職於神戸市立医療センター中央市民病院的栗本康夫，RIKEN 的高橋政代把一位七十七歲的女性病患的皮膚細胞轉成 iPS cells (induced pluripotent stem cells)後，再把它轉成 retinal pigment epithelium cells (視網膜色素上皮細胞)，讓它長成一片後，再取一片大小為 1.3mm x 3.0mm 的細胞植入病患眼中，這是史上第一次 iPS cells 的手術。時至今日，手術雖然沒有改善婦人的視力，但也不需要再繼續用藥物治療，手術抑制了黃斑病繼續惡化。

時隔三年後，2017 的三月底(也就是前幾天)，同樣的團隊再度幫另外五位病患動同樣的手術治療黃斑病，只是這次用的不是病患自己的細胞，而是別人的，比對過 HLAs (human leukocyte antigens)後可以避免產生免疫反應。

有在關注諾貝爾獎的應該都知道，iPS cells 是日本京都大學的山中伸彌教授的研究成果，讓他於 2012 年得到諾貝爾生醫獎，也是從研究成果出來後，最快拿到諾貝爾獎的人。（研究成果出來到得諾貝爾獎中間應該不到十年吧？）之後，山中在京都大學的 Center for iPS Cell Research and Application 建立了一個 iPS cells 銀行，只要七十五株 iPS cells 就可以涵蓋日本人口約 80% 的 HLAs，也就是說 80% 的日本人可以從銀行裡找到符合的 HLA 做移植手術。高橋政代在 2000 年就開始研究治療 AMD 的方法，當山中公布他的 iPS cells 成果後，高橋便開始研究如何用 iPS cells 來治療黃斑病。而山中彌伸在京都大學的同事高橋淳(高橋政代的老公)，也計畫在兩年內用 iPS cells 治療帕金森氏症。

RIKEN 的 iPS cell bank 有人類(HPS)和其他動物(APS)的，每個 iPS cell line 都有詳細的資料(像 ATCC 上面那樣)，如果可以建立起一個龐大的 iPS cell bank，那使用的用途就會變得比較多，也可以供給更多病患使用。（基本上就可以變成像幹細胞銀行那樣）

不用限於使用自己的細胞有幾個好處：

- 黃斑病的病人通常年紀較大，年紀較大通常基因出現的問題比較多，很有可能轉成 iPS cells 後也無法使用，如果用 iPS cell bank 裡面儲存的細胞，可以選擇年輕的細胞來使用。
- 用自己的細胞轉成 iPS cells 後在轉成需要用的細胞型態需要時間，無法馬上使用，如果有 iPS cell bank 的 ready-made cells 的話就可以省下等待的時間，加快治療的時程。
- 使用自己的細胞來轉成 iPS cells 除了費時外，也需要大筆費用(第一位病患的手術花了約 $900,000)，但是如果用 iPS cell bank 裡面現成的，就可以省掉前面準備 iPS cells 的費用。

另外，最重要的也許就是用 iPS cells 不會像用 ES cells (embryonic stem cells) 那樣有一堆爭議，或被一堆衛道人士反對。



Articles:

Nature / Japanese woman is first recipient of next-generation stem cells (Sept 2014)

Nature / Japanese man is first to receive 'reprogrammed' stem cells from another person (March 2017)

Science / Cutting-edge stem cell therapy proves safe, but will it ever be effective?

Nature / Pioneering cell transplant shows vision and promise

Nature / Stem cells: 5 things to know before jumping on the iPS bandwagon (2008)