萬用流感疫苗的可能性

相信大家都得過流感，可能覺得流感沒什麼，不過全球每年因流感重症的人口高達三百五十萬人，超過四十萬人死亡。雖說目前有疫苗，但流感病毒是 RNA 病毒，突變率高，所以每年都需要新疫苗，而且因為不知道來年病毒會突變成什麼，只能用預測的，只能做到 best match，無法做到 perfect match。

目前流感疫苗用的大多是去活性的病毒蛋白來引起免疫反應，產生大量對抗病毒的抗體。疫苗主要用的蛋白是 HA (hemagglutinin) 和 NA (neuraminidase)，位於流感病毒的表面，這兩個蛋白的基因常常突變，如果預測的不夠準的話，疫苗的效用可能就大為降低。與其每年都需要預測和更新疫苗，科學家們希望能夠研發一個萬用的 universal vaccines，一支可以對抗所有流感病毒的疫苗，近年來的策略是讓免疫系統產生各種針對流感的抗體，於是標靶蛋白須為所有流感病毒株都有、變化較少的蛋白或其片段，例如 HA 的 stalk region。

註：流感病毒的 HA 分成兩個 domains (下圖)，上面的 head domain 是基因突變較頻繁的部分，頂端是 receptor binding site，下面是 stalk domain，相較起來突變較不頻繁。


Figure / Structure and classification of influenza virus hemagglutinins (E Kirkpatrick et al, Scientific Reports 2018)

人類的免疫系統，除了抗體之外，還有免疫細胞，引發免疫細胞反應，也是另一種方法。這篇研究是是想利用 cGAMP (2’,3’-cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate) 啟動肺部內的免疫細胞 CD8+ resident memory T cells (T RM cells) 對抗流感病毒。Type I interferons (IFN-Is) 是啟動免疫系統對抗病毒感染主要媒介，STING (stimulator of interferon genes)是啟動肺泡表皮細胞和免疫細胞裡 IFN 表現的訊息因子，cGAMP 則是 STING agonist。在這篇研究裡，他們用 PS (pulmonary surfactant) 作為載體把 cGAMP 和去活性的 H1N1 疫苗一起送進肺部的巨噬細胞(macrophages)，再由巨噬細胞把 cGAMP 送進肺泡的表皮細胞 AECs (alveolar epithelial cells)和 APC (antigen-presenting cells)，進而啟動免疫系統。


Figure / Strengthening influenza virus vaccination (Herold & Sander, Science 2020)

他們把 PS-cGAMP 和去活性的流感病毒(PS-GAMP adjuvant H1N1)一起打進老鼠，兩天後便觀察到其效用，除了早期大量增加的 NK cells 和之後強烈的 CD8+ T cells 反應，施打後兩週也觀察到大量的抗體產生，比疫苗本身引起的抗體量多十倍以上，而產生的抗體針對的不只是 H1N1 而已，還包括其他三種 -- H3N2, H5N1, H7N9。最後，PS-GAMP adjuvant H1N1 疫苗在施打兩天就可產生保護作用，引起的免疫反應還可維持至少六個月，施打疫苗一個月後還可測到 CD8+ T RM cells，保護老鼠不再受到 H1N1 和其他流感病毒株的感染。

嗯，如果在人體上也有同樣效用的話，應該也可以應用在新冠病毒的疫苗上。



Papers:

S Herold & L Sander, Toward a universal flu vaccine. Science (2020)

J Wang et al, Pulmonary surfactant-biomimetic nanoparticles potentiate heterosubtypic influenza immunity. Science (2020)

E Kirkpatrick et al, The influenza virus hemagglutinin head evolves faster than the stalk domain. Scientific Reports (2018)

有記憶的先天免疫系統

先天免疫系統是可以學習、訓練的嗎？

關於新冠病毒，目前知道的就是大多數人都是無症狀或是輕症，只有少數人會進展到重症，而且大多數是老年人或慢性病患者，這是否和免疫能力有關？

人體的免疫系統有兩種，一種是 innate immune system，一種是 adaptive immune system。Innate immune defense 是先天的免疫反應，沒有針對特定外來物，通常是免疫系統和某個外來物(細菌或病毒)的第一次見面。Adaptive immune system 則是改進過後的免疫反應，是免疫系統跟外來物第一次見面後學習來的，有記憶性，會針對某個外來物。例如說大家第一次感染到新冠病毒的時候，身體對抗的免疫反應是 innate immue system，在這一戰的時候，主要打仗者是各種白血球們(e.g., monocytes, macrophages, natural killer cells)，他們在打仗的過程中得到新冠病毒的蛋白資料(抗原)，然後用這些資料產生對抗它的免疫細胞 (T cells, B cells)和抗體，進化成 adaptive immune defense，當再次感染的時候，adaptive immune system 就可以立刻叫喚出針對新冠病毒的免疫細胞和抗體，快速消滅病毒。（有興趣的可以看工作細胞第三集）



Innate immunity 和 adaptive immunity 的差別主要在前者沒有記憶性，後者則是依靠前者的經驗學習記憶後得來的 immunity，不過近期有研究認為，innate immunity 也是可以被訓練成有記憶性的，也就是 trained immunity，而這靠的是改變基因表現，也就是 epigenetic reprogramming。Trained immunity 和原本的 adaptive immunity 不同點在於 [3]：

1. 參與 trained immunity 的免疫細胞有 monocytes, macrophages, natural killer cells (NK cells) 等等，adaptive immunity 則是 T cells 和 B cells。

2. adaptive immunity 是有目標性的，靠的是基因重組(gene rearrangement)後產生的、針對不同抗原的抗體，trained immunity 改變的不是基因本身，而是基因的表現(epigenetic)。有意思的是之前有研究顯示 NK cells 和 CD8+ T cells (CTLs) 有相似的基因表現機制，可能是讓 NK cells 有記憶性的的原因 [4]。

3. trained immunity 改變免疫細胞功能是短期的，只有幾個月，adaptive immunity 的改變則是長期的，可達幾年。


Figure / Schematic representation of the concept of "training immunity" (Kar & Joosten, Nature Immunology 2020)

這一篇文章要說的便是 innate immunity 是否可以被訓練，進而展現 adaptive immunity 的部分功能 [5]，也就是說在初次感染時，白血球等等習得了要產生哪些蛋白對抗，當後來再次感染的時候，不需要受到相同的病菌感染，innate immunity 的免疫細胞就會立刻產生某些 cytokines 去對抗，就是所謂的 trained immunity。之前有研究顯示卡介苗(bacillus Calmette-Guérin; BCG vaccine)可以產生 trained immunity，卡介苗是去掉毒性的活細菌疫苗，雖然針對的是造成肺結核(tuberculosis)的細菌(Mycobacterium bovis)，但是它引起的 trained immunity 有降低其他病菌感染的效用，例如流感和皰疹病毒，稱為 off-target effects 或是 non-specific effects (NSEs)。另外，健康人施打卡介苗會增加 pro-inflammatory cytokines，得到呼吸道感染的機率比沒打過卡介苗的低了 73%。

之前有研究觀察到有施打卡介苗的國家，新冠病毒確診病例和重症率比較低 [1]，可能是因為它產生的 trained immunity 的效用，對抗病菌的免疫力增強了，因而降低了新冠病毒的感染率。不過，雖然在台灣施打卡介苗是 mandatory，但是在北美並不是，根據加拿大 Health Canada 網站的資訊 [2]，卡介苗的效用不高，而且會干擾診斷，有施打過卡介苗的在肺結核的皮膚測試(TST; tuberculin skin testing)會顯示為陽性，需要病人告知是否施打過卡介苗，不然不知道陽性反應是因為卡介苗還是因為真的感染，所以並不鼓勵施打卡介苗。

"Clinical trials have demonstrated conflicting results regarding BCG vaccine's efficacy. Meta-analytic reviews have estimated the vaccine efficacy in preventing any TB disease at approximately 51%. The protective effect of BCG vaccine against disseminated TB in the newborn is estimated to be 78%.

The duration of BCG vaccine protection is not well-established. Although generally thought to have declining protection over time, one follow up study demonstrated a protective effect for as long as 60 years. BCG vaccine will not prevent the development of active TB in individuals who are already infected with M. tuberculosis. TB disease should be considered as a possible diagnosis in any vaccinee who presents with a suggestive history, or signs or symptoms of TB, regardless of immunization history."

回到卡介苗是否真的的降低新冠病毒感染或重症，因為都還只是觀察到的相關性，所以需要臨床上的確認，目前有幾個國家開始臨床試驗，預計要到今年十月才知道結果。除了卡介苗外，麻疹疫苗也被認為可以產生 trained immunity。



References:

1. JSatoNotes / If I were North American/West European/Australian, I would take BCG vaccination now against the novel coronavirus pandemic

2. Gov of Canada / Bacille Calmette-Guérin (BCG) vaccine: Canadian Immunization Guide

3. MG Netea et al, Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science (2016)

4. UK Kar & L Joosten, Training the trainable cells of the immune system and beyond. Nature Immunology (2020)

5. M Netea et al, Trained Immunity: a Tool for Reducing Susceptibility to and the Severity of SARS-CoV-2 Infection. Cell (2020)

新冠肺炎患者體內的抗體有哪些

這篇研究分析了六十幾位 COVID-19 患者體內的抗體，想知道他們在感染後的產生時間和其 neutralizing 的功效。

摘要：

1. 用 ELISA 實驗的結果，發現用 Spike RBD (receptor-binding domain) 來測試患者體內抗體的 specificity 和 sensitivity 比較高。

2. 幾乎沒有患者在症狀出現後八天內有測到中和抗體(neutralizing antibodies)，然後在第 21 天時有 91% 的患者測得到低量的 neutralizing antibodies，只有 73% 的患者體內有保護作用的中和抗體含量高於 1:80。

3. 大約有 32% 在症狀出現 21 天後，體內中和抗體的量依然很低，有的甚至沒有。

4. 大部分的人在出現症狀七天後，體內才測到較高的 IgG 和 IgM 抗體。

5. 症狀出現九天後，體內 IgG 抗體較為普遍，大多數感染過的人都有 IgG 抗體(94%)，七成的患者有 IgM。

6. FDA 建議用血清來治療的 titre 是 1:160，目前只收症狀持續兩個禮拜的康復患者捐獻的血液用於治療。

7. RBD-binding 的抗體量和保護作用(neutralizing)呈現正相關：體內 anti-RBD 的抗體越多，保護作用越大。

8. 患者體內 IgM 的量也和體內的中和抗體(neutralizing antibodies)的量呈現正相關。

註：中和抗體為可結合病毒，進而抑制其感染細胞的抗體。

相關文章：武漢肺炎輕症患者體內的免疫反應



Publication

L Premkumar et al, The receptor binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science Immunology (2020)

新冠病毒的哪個部分最能引起免疫反應呢？

知道這個有什麼用呢？可以用來做疫苗研發，如果我們知道病毒的哪個蛋白或蛋白的哪個片段可以引起有效的免疫反應，那就可以用來作為疫苗，比起打入整顆的病毒，只打入病毒的某個蛋白或某個蛋白片段會相對安全，有人想研發 DNA- 或 RNA-based 疫苗的部分原因也在此，因為它們只會在體內表現病毒的蛋白或蛋白片段，而不是整個病毒。

這個研究主要是用 Spike protein，他們把 Spike protein 依照目前所知的 domains 分成幾個片段試驗。

1. S-ectodomain (S1+S2), aa 16-1213
2. S1, aa 16-685
3. RBD, aa 319-541
4. S2, aa 686-1213

相關文章：近期和新冠病毒抗體相關的研究

他們把這些蛋白片段打入兔子體內，第一次和第一次施打隔了兩個禮拜，然後在打入後第八天取血清分析，看看哪個可以引起強烈的免疫反應。他們用 ELISA 測試血清裡的 IgG 和四種抗原的反應，結果顯示所有的血清都有可和 S-ecto 產生強烈反應的 IgG，而和其他三個抗原的反應則滿 specific，打入 S2 兔子的血清只對 S2 產生反應，對 S1 和 RBD 則沒反應。

因為 ELISA 分析的是 IgG binding，他們另外也用 SPR 分析其他 Ig binding，結果顯示在二次施打後，所有取得的血清裡，anti-Spike 的抗體中有 80% 是 IgG，10-15% 是 IgA，以及少量的 IgM。專一性的話呢， S-ecto 兔子的血清裡，大多數抗體都和 S-ecto 結合，再來是和 S1，最後是 RBD 和 S2，大概是 S-ecto 的三分之一。S1 兔子血清裡和 S-ecto, S1 以及 RBD 結合的抗體都差不多多，沒有和 S2 結合的。RBD 兔子血清裡的抗體一樣是和 S-ecto, S1 以及 RBD 結合的量都差不多，但是量都是 S1 兔子的三倍，而且這些抗體對抗原的 affinity 是其他兔子抗體的五倍。

再來就是看這些抗體的保護力了，他們用 RBD-hACE2 binding competition SPR assay 和 neutralization 測試抗體抑制病毒的功效。因為新冠病毒進入細胞靠的是 RBD 和宿主細胞 hACE2 的結合，competition SPR assay 便是測試抗體阻斷 RBD 和 hACE2 的功效如何，結果顯示 S1 兔子和 RBD 兔子的血清阻斷的效能最好，分別為 84% 和 94%，而 S1+S2 的只有 44%。那這些抗體是否可以阻止細胞被病毒感染呢？實驗結果顯示 RBD 兔子的血清抑制病毒感染的效果最好，再來是 S1 兔子的血清，最後才是 S1+S2 兔子的血清。

結論：用病毒 Spike protein RBD 產生出來的抗體對抗原的 affinity 最高，最能有效阻斷 RBD-hACEII binding，抑制病毒感染細胞的效果也最好。



Publication:

S Ravichandran et al, Antibody signature induced by SARS-CoV-2 spike protein immunogens in rabbits. Science Translational Medicine (2020)