IgG 單株抗體的開發流程

之前有寫過奈米抗體(nanobodies)是怎麼開發的，這篇來介紹目前主流的 IgG 開發流程。

其實整個流程和奈米抗體(nanobodis, VHH)差不多，主要差在用的動物不同，篩選和表達的系統不同。

IgG: 動物是用老鼠，取出老鼠 B 細胞或血液後，做成 hybridoma 後篩選，再用老鼠細胞 CHO 或人類細胞 HEK 表達。

VHH: 動物用駱馬，取出淋巴細胞後，插入噬菌體 phagemid 後篩選，再用細菌表達。

相關閱讀：Phage display 和奈米抗體製造

▋準備抗原 Antigen Preparation

抗原就是打進動物體內，讓牠產生抗體的東西，在做對抗病毒的中和抗體時，通常會用滅毒病毒(inactive viruses)或部分的病毒蛋白(recombinant proteins)。

如果不是做病毒的抗體，而是其他的，例如針對癌症腫瘤細胞的，抗原可能只有一小段胜肽，無法激起大量的免疫反應的話，會需要和其他較易引起免疫反應的東西接在一起，或是加 adjuvant，比較常見的是用在疫苗上。

▋接種 Immunization

就是把抗原打進動物體內，讓牠產生抗體，通常會打三劑，一個 primary injection 和兩個 booster injection，大概分別在第 14 天和第 28 天左右。

在接種約兩個禮拜後(大概是第 42 天時)會取老鼠血液，用 ELISA 測量抗體的產生狀況如何，如果免疫反應不高，抗體濃度低，可能需要加打 booster。如果血液中抗體夠高，會再打最後一劑不加 adjuvant 的抗原，三天後取脾細胞做融合。

▋分離 B 細胞 B cell isolation

在最後一劑接種的三、四天後，通常是血液中的抗體量達到高峰時，取出老鼠的胰臟，從中分離出淋巴細胞。


(點圖可放大)

▋製造融合細胞瘤 Hybridoma creation

這個步驟分成兩個部分，先要準備好骨髓癌細胞(myleoma)，再和 B 細胞做融合。

▍骨髓癌細胞

常用的骨髓癌細胞包括 Sp2/0 或 NS-1，為永生細胞株(mmortalized cells)，將它和 B cells 融合的目的是為了要讓 B 細胞可以無限的生長和產生抗體。

這些骨髓癌細胞缺少 HGPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)，在融合前幾週會被培養在含有 8-azaguanine 的培養液中，8-azaguanine 是 purine analog，在被 HGPRT 轉變成 azaGMP (8-azaguanosine monophosphate)，使細胞無法生成 purine，導致細骨髓癌細胞缺少 HGPRT，因此可以在含有 8-azaguanine 的培養液中存活，這是要確保使用的骨髓癌細胞都缺少 HGPRT。

HAT (hypoxanthine–aminopterin–thymidine) 培養液中的 HAT 在缺少 HGPRT 的情況下則無法合成 DNA，因此骨髓癌細胞無法在 HAT 培養液中存活，除非它們和 B 細胞融合，因為 B 細胞有 HGPRT。

▍細胞融合 Hybridization

把骨髓癌細胞和 B 細胞混合，加入幫助細胞融合的 PEG (polyethylene glycol)，然後在 HAT 培養液中養個 10-14 天左右，通常融合的成功率為 1% - 2%。

▋篩選融合細胞瘤 Hybridoma selection

這個步驟是篩選出可以對抗抗原的抗體，由於融合細胞瘤是一群不同的細胞組成，每個細胞產生的抗體都不一樣，要怎麼從中挑出你想要的抗體？

這時候就要稀釋細胞，稀釋到你把細胞加到 96-well 培養盤中時，每個孔都只有一個融合細胞，確保每一個孔都只會有一種抗體。

由於細胞會把抗體分泌到培養液中，這時候就可以用 ELISA 去測這些培養液，看哪個孔裡面的抗體是你想要的，就是會和抗原有反應的抗體。

不過，這個方你看了可能會覺得累吧？現在比較新的技術是用 microfluid 去分細胞，例如 AbCellera 的核心技術 microfluid single-cell screening，或是和它因為這個技術互告的 Berkeley Lights 的 Beacon® Optofluidic System。（剛剛想找 Berkeley Lights 網站，發現它已經變成 Bruker Cellular Analysis，它在 2023 年年初的時候以 $57.8M 鎂買下 IsoPlexis 成為 PhenomeX，年底的時候 Bruker Corporation 則用 $$108M 鎂買下 PhenomeX，然後我剛剛看 Bruker Cellular Analysis 的網站，他們已經從 microfluid 進化成 nanofluid。）

▋繁殖融合細胞瘤 Clonal expansion

這個部分就是大量培養你要的融合細胞，大量的融合細胞才能產生大量的抗體，也可以用來保存以備後用。

到這邊就可以結束了，接著進入從陪養液中純化抗體的部分。

或者是在篩選出融合細胞瘤後，從中萃取出其抗體基因，用另一個細胞系統大量表達抗體。

▋Cloning

就是從 B cell 萃取 DNA 以取得抗體的基因序列，然後轉到 expression vector，再在老鼠或人類細胞中表達。

IgG 抗體結構可分成 heavy chain (HC) 和 light chain (LC)，可以分開在兩個 vectors，或是放在同一個 vector。



Expression vector 通常會包含幾個要素：

• Enhancers: 增加抗體表現
• Promoter: SV40, CMV, EF-1
• Kozak sequence (cap-dependent translation initiation): 放在 start codon 前面，可以促進轉譯開始。
• Secretion signal: 讓抗體可以分泌出 B 細胞的訊號，包括 IL-2 signal peptide。
• MCS: 用來插入抗體基因的地方，包括 HC 和 LC。
• polyA tail
• Selection marker: 用來挑選成功轉進細胞的 plasmid，通常是用抗生素。
• Ori: 讓細胞可以複製 plasmid

▋抗體生產 Antibody production

主要包括幾個步驟：把帶有抗體基因的 plasmid 送入細胞，在細胞中表達抗體，然後純化抗體。

▍送入細胞 Delivery

把 plasmid 送入細胞有幾個方式：

• LNP (lipid nanoparticle) 或其他 lipid-based 的運送系統
• Electroporation
• Viral infection: 如果是用 viral vector 的話
• Calcium phasphate

▍表達細胞系統 Expression System

常用的老鼠細胞有 CHO cells，又包括 CHO-K1 和 CHO-pro3 等等。

或是人類細胞 HEK cells

▍純化抗體 Purification

就是用 FPLC 來純化抗體，常用的 column 包括 affinity (IMAC), ion exchange (IEX) 和 SEC (size exclusion column)。

▍功能測試 Functional tests

純化完之後就要測試抗體功能，因為有可能在純化的過程中，抗體沒有組合好等等情況而喪失該有的功能。

主要測試的方向包括：

• Binding affinity: 和抗原的親和力，或是抓住病毒的效力好不好。
• Specificity: 特異性夠不夠專一，會不會和其他不相干的蛋白結合，影響其功能。
• Functionality & Potency: 是否能消除病毒，或抑制感染。

常用的技術則包括 ELISA, BLI, SPR, flow cytometry 等等。

如果以上其中一個不夠好，可以透過分析其結構，看是否能夠改動某個序列片段或幾個氨基酸，最佳化抗體的功效。


延伸閱讀：精準治療 — 單株抗體藥物在臨床上的應用




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References:

NIH | Monoclonal Antibody Production

Hybridoma Technology - Monoclonal Antibody Production

VectorBuilder | Mammalian Antibody Heavy and Light Chain Coexpression Vector