用基改益生菌治療 C. difficle 感染

之前有介紹過，量產抗體有幾個選項，可以用動物細胞，可以用大腸桿菌，也可以用酵母，另外還有一種是雞蛋(IgY)。

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這篇研究用的是酵母菌，把基改後可以生產抗體的酵母菌吃下去，讓它在體內製造抗體來對抗 Clostridioides difficile (困難梭狀桿菌)感染。困難梭狀桿菌感染(Clostridioides difficile infection, CDI)通常發生在老年人，尤其是有在服用治療其他感染的抗生素的，抗生素會殺掉很多細菌，包括好的腸道菌，使它們無法對抗 C. difficile，雖然針對 C. difficile 的抗生素大多有效，但有時候會反覆感染，最後造成死亡。

 

Figure / Clostridioides difficile Infection (US CDC)

除了用抗生素治療，另一種就抗體治療，普通的做法是大量生產、純化抗體後，然後靜脈注射至血管內，經由血液進到腸胃道，中和困難梭狀桿菌產生的毒素。這篇研究的團隊，想說與其要經過層層運輸，不如基改益生菌，讓它可以生產抗體，吃下去後直接進入腸胃道，不是更方便？而且如果可以讓益生菌(probiotics)在體內生產抗體，還省掉了純化抗體需要的時間和金錢。

目前用來生產抗體的酵母菌以 Saccharomyces 和 Pichia 為主，Saccharomyces 是 baker's yeast，Pichia 則是 brewer's yeast，比較常用來大量生產蛋白。S. cerevisiae 可能大家比較常用，通常做 yeast 2-hybrid 就是用這株，這篇研究用的是 Saccharomyce boulardii。關於 S. boulardii 的研究不多，不過它和 S. cerevisiae 是同種，照理說基改後應該也可以生產抗體，中和困難梭狀桿菌的毒素 TcdA, TcdB。

這篇研究用來中和 TcdA, TcdB 的是小抗體 VHH，他們把四個可以中和 TcdA, TcdB 的 VHH 接在一起，之間用 GSSS linker 接在一起成為 ABAB，然後測試它們的中和效力，並且和 Merck 的抗體藥 actoxumab & bezlotoxumab 相比，老鼠實驗(腹腔注射)的結果顯示，效果比 Merck 的抗體藥好一千倍，接下來要解決的就是怎麼把 VHH 用非注射的方式送到腸胃道。研究團隊選擇用益生菌，在益生菌中選擇用 S. boulardii，原因有幾個：安全性已知道，也有治療 CDI 的基本效用，並可和抗生素一起使用。雖然沒有用 S. boulardii 表現抗體的研究，但同種的 S. cerevisiae 已被廣泛用來表現抗體。他們先試著在 S. cerevisiae 裡表現 ABAB，看用哪個 secretion signal 表現最好，然後在放到 S. boulardii，經過一些 optimization 之後，表現量可以增加四倍，然後測試 S. boulardii 生產的 ABAB 是否仍具有中和效用，細胞實驗的結果顯示是可以的，再來就是測試安全性了。

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他們讓接受抗生素的老鼠每天吃一劑的 S. boulardii (10^9 CFU)，看看是否有副作用，結果顯示老鼠除了變胖之外，沒有明顯的副作用。除此之外，老鼠的糞便中還可測到持續表現 ABAB 的益生菌，重要的是從腸胃道取出的 gut fluid 仍保有抑制 TcdB-induced toxicity 的效用，沒有被餵食基改益生菌的老鼠糞便則沒有抑制 toxicity 的效用。

通常在治療細菌感染或是術前準備時，會給病患吃抗生素，但服用抗生素會增加 CDI 的感染風險，那表現 ABAB 的益生菌可以解決這個困擾嗎？在預防性治療實驗中，他們讓接受抗生素的老鼠先吃七天表現 ABAB 的基改益生菌，或是沒表現 ABAB 的益生菌，然後再讓他們感染 C. difficle，結果發現沒吃益生菌或是吃沒表現 ABAB 益生菌的老鼠出現CDI 感染症狀，糞便裡有 C. difficle 和其毒素，而吃表現 ABAB 益生菌的老鼠則症狀輕微或是無症狀，糞便裡的 C. difficle 也相對少。用在急性感染治療上的效果如何呢？老鼠在感染後八到十二個小時內出現症狀，有的在 48 小時內死亡，存活率大概五成，而被餵食表現 ABAB 基改益生菌的老鼠存活率有八成，而且復原力也較高。

在臨床上，病患在停止抗生素治療後，有時會出現反覆感染的狀況。在預防反覆感染的實驗中，老鼠在接受感染的一天後開始每天吃基改益生菌，連吃十三天。沒接受表現 ABAB 益生菌或沒表現 ABAB 益生菌的老鼠在停止 vancomycin 後出現再度感染的情況，像是腹瀉、體重減輕或死亡，而服用表現 ABAB 益生菌的老鼠再度感染的狀況顯著降低，只有輕微腹瀉，也沒有體重降低的狀況。

好好奇糞便裡的基改益生菌是否仍有抑制 toxicity 的效用。哦，對了，反基改人士會不會說他們寧願吃抗生素，也不要吃基改益生菌呢？XD



Articles:

US CDC: Nearly half a million Americans suffered from Clostridium difficile infections in a single year

Science / Antibody-producing yeast vanquishes deadly gut infection in mice (Oct 2020)


Paper:

K Chen et al, A probiotic yeast-based immunotherapy against Clostridioides difficile infection. Science Translational Medicine (2020)

未感染新冠病毒的人也有抗體

之前已有好幾篇研究顯示，未感染者體內有抗新冠病毒的免疫 T cells，有可能是因為和其他的冠狀病毒有 cross-reactivity。這篇研究用 flow cytometry 分析了未感染者和患者抗冠狀病毒 Spike protein 的三種抗體 IgA, IgM 和 IgG，想知道新冠病毒和感冒冠狀病毒之間 cross-reactivity 程度有多少。

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冠狀病毒的 Spike protein 分成 S1 和 S2 兩個 domains，S2 在冠狀病毒間的相似度比較高，叫有可能是 cross-reactivity 的來源。他們的 competitive binding assays 結果顯示，未感染者和患者的血清抗體間的 cross-reactivity 主要在於 S2。跟未感染者的抗體相較，患者血清內的抗體免感度(sensitivity)和專一性(specificity)比較高。

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這種 cross-reactivity 有多普及呢？他們分析了疫情前 2011 年到 2019 年時收集的血清，和新冠病毒患者的血清做比較。結果顯示冠狀病毒間的 cross-reactivity 在年輕族群中比較普遍，2011 年到 2018 年間，十六歲以下的健康個體約有 50% 的血清內有可辨識新冠病毒 Spike 的 IgG，17 - 25 歲之間只有 2%；2019 年採集的中年族群的血清，約有 8% 有低量的、可辨識新冠病毒 Spike 的 IgG。例外，新冠病毒患者血清內同時有可辨識 Spike 的 IgG, IgM 和 IgA，而未感染者的則主要為 IgG，沒有 IgM 和 IgA，重要的是未感染者血清內的抗體具有中和新冠病毒的效力。



Paper:

KW Ng et al, Preexisting and de novo humoral immunity to SARS-CoV-2 in humans. Science (2020)

抗新冠病毒的合成小抗體 sybodies

之前美國德州大學的研究團隊首先發表 Spike protein cyro-EM structure 後不久，又發表了一篇從駱馬身上釣出抗新冠病毒的小抗體 nanobodies。

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nanobodis 是什麼呢？駱馬和鯊魚體內除了有普通的 IgG 之外，還有一種只有 heavy chain 的小抗體 HCAbs，其辨識抗原的 Fv (variable region)為 VHH，又稱為 nanobodies，近幾年因為體積小，相較傳統 IgG 易純化，開始受到注目。

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駱馬和鯊魚體內產生的小抗體是天然的，需要先把抗原打進駱馬體內，等牠們產生抗體後，從牠們的免疫細胞內抽出抗體的基因序列製造成 libraries，再用噬菌體展示(phage display)的技術釣出抗抗原的小抗體，這個普遍抓抗體的方法雖然不難，但費時費力，而且你需要先找到駱馬用 XD。

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2018 年的時候，瑞士蘇黎世大學的研究團隊研發了三個針對細胞膜蛋白(membrane proteins)不同面的人造合成小抗體 libraries，這三個 libraries 的不同主要在於 CDR3 的長度，不同的長度會和蛋白表變不同的地方結合[註1]，而從這些 libraries 釣出來的合成小抗體(synthetic nanobodies) 稱為 sybodies。

註1：他們把這三個 libraries 稱為 concave, loop, convex。Concave 的 CDR3 比較短，只有六個氨基酸長，主要透過它們 concave surface 和抗原結合。 Loop 的 CDR3 則是中長度(12 a.a.)，是一個 loop 的形狀，可以進到接受器(receptor)的 cavity 而結合。Convex 的 CDR3 最長(16 a.a.)，會形成一個 hydrophobic core 和抗原結合。


Figure / Selection of sybodies against membrane proteins within three weeks (Zimmermann et al, eLife 2018)

EMBL Hamburg 的研究團隊這個月在 Nature Comm 發表了他們的研究，他們從三個 sybody libraries 裡共釣出 85 個合成小抗體，純化了其中 62 個後，檢測了它們的 binding affinity，其中有六個和 Spike RBD 結合力很強，Kd 範圍約為 10 nM - 60 nM，其中以 Sb23 這株小抗體最強。

小抗體的結合力強，那是否有抑制病毒的作用呢？他們掃了 36 個小抗體，測試它們的中合力(neutralizaiton activity)，發現其中十一個小抗體的 IC50 < 20 ug/ml，六個的 IC50 < 5 ug/ml，Sb23 的 IC50 則只有 0.6 ug/ml (48 pM)，當它和 Fc 接在一起後，IC50 可達到 0.007 ug/ml (0.56 pM)，未來有望用於治療。

IC50 用 ug/ml 來表示真是不習慣啊，於是我把它換算成 pM 惹。

Sb23 (MW = 12.5 kDa)
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFPVESENMHWYRQAPGKEREWVAAIYSTGGWTLYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAVQVGYWYEGQGTQVTVS



Articles:

EMBL Press release / cientists identify synthetic mini-antibody to combat COVID-19

TN / Synthetic Mini-Antibody Binds to and Neutralizes SARS-CoV-2 (Nov 2020)

Addgene blog / No Llamas Required - Synthetic Nanobodies Against Membrane Proteins (June 2020)



Papers:

 TF Custodio et al, Selection, biophysical and structural analysis of synthetic nanobodies that effectively neutralize SARS-CoV-2. Nature Comm (2020)

I Zimmermann et al, Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife (2018)