2018 諾貝爾生醫獎：免疫系統中的檢測點 PD-1 和 CTLA-4

今年的諾貝爾生醫獎得主是免疫療法，分別為德州大學安德生癌症中心(University of Texas MD Anderson Cancer Center)的 James Allison 和日本京都大學的本庶佑。免疫細胞中有一種是 T -cells [註 1]，它的細胞膜上有接受器(T cell receptors, TCR)和其他輔助蛋白質會辨識非自體蛋白（例如細菌的或病毒的）和傳送訊息。要全面啟動 T cells 需要兩個訊息 ，一個是 T cells 上面的 TCR 和抗原的接合 [註 2]，另一個是 T cells 上面的 CD28 和 APC 表面的 B7 結合，CD28 表現在 naive T cells 上面。



Figure / M Alegre et al, Nature Reviews Immunology (2001)

註 1：T cells 又分成 helper T-cells (Th cells, CD4+ T cells) 和 cytotoxic T-cells (Tc cells, CTLs, CD8+ T cells)

註 2：抗原被 APC (antigen presenting cells) 收進細胞內後會變成小片段，然後再由過 MHC (major histocompatibility complex)呈現在 APC 表面讓 T cells 辨識，準確來說和 TCRs 結合的是 MHC:Ag。

Allison 發現 CTLs 上面的 CTLA-4 有抑制免疫反應的作用。如果說 TCR 和 CD28 是兩把鎖，MHC:Ag 和 B7 是鑰匙，解開後才會全面啟動免疫反應，那 CTLA-4 就像是安全鎖，防止 CD28 那個鎖被解開，因為它接合的對象是 B7，因此大多數人想到的是用 CTLA-4 去治療自體免疫性疾病(autoimmune disease)。不過 Allison 想到的是相反的方向，他發現 CTLA-4 的抗體會抑制 T-cell 的功能功能，並且增加免疫反應。他們把直腸癌腫瘤細胞打入老鼠裡，其中有部分老鼠同時和之後的第三天和第六天又各打入一劑 CTLA-4 抗體，結果發現沒打抗體的老鼠如預期長出腫瘤，並且持續變大，而同時也打入 CTLA-4 抗體的老鼠則是打入腫瘤細胞後的五天內長出小小腫瘤後又漸漸萎縮，然後消失了。他們給這些腫瘤長出後又消失的老鼠二次挑戰，看看之前打入的 CTLA-4 抗體的效果有沒有持續，結果這些老鼠並沒有再長出腫瘤。

CTLA-4 的抗體藥為 Bristol-Myers Squibb 的 Ipilimumab (品牌名為 Yervoy)，用來治療黑色素瘤(melanoma)。

讓京都大學的本庶佑得獎的是 PD-1，他發現這個蛋白質會表現在快死掉的 T-cells 的細胞膜表面，因此稱它為 programmed death 1 (PD-1)。PD-1 是 B7 家族的成員之一，其配位基(ligand)為 PD-L1 和 PD-L2。本庶佑和其團隊發現 PD-L1 和 B7 會一同表現在 APC 表面上外，其包括了被活化了的 blood monocytes。他們也發現，除了被活化的 APC 會表現 PD-L1，非免疫細胞的心臟和肺的組織細胞也會表現 PD-L1，它和 PD-1 結合會抑制淋巴細胞活化和繁衍；PD-L2 表現在正常的 dendritic cells 表面，和 PD-1 結合則會抑制 T cell 活化。

後來，他們和另一組研究團隊發現癌細胞也會表現 PD-L1，並且因此逃過免疫系統的偵測。之後，本庶佑和其團隊發現黑色素癌細胞(melanoma cells)無法在沒有 PD-1 的老鼠(PD-1 -/-)體內擴散，在沒有 PD-1 的情況下，CTLs 聚集在癌細胞，並且其活動力也加強了。他們同時也用了抗 PD-1 的抗體測試，發現 anti-PD1 mAb 抑制了老鼠肝臟裡癌細胞的生長，在大腸和肺的測試也得到同樣效果，阻斷 PD-1 和 PD-L1 之間的 interaction 可以抑制癌細胞生長。

雖然這兩個蛋白質都被稱為免疫機制裡的 checkpoint，然而目前臨床上的結果顯示 anti-PD-1 抗癌效果比 anti-CTLA-4 還要好。



Articles:

2018 Nobel Prize in Physiology and Medicine

Science / Cancer immunotherapy pioneers win medicine Nobel (Oct 2018)

Technology Networks / James P. Allison & Tasuku Honjo Win 2018 Nobel Prize for Medicine (Oct 2018)


Papers:

DR Leach et al, Enhancement of Antitumor Immunity by CTLA-4 Blockade. Science (1996)

M Alegre et al, T-cell regulation by CD28 and CTLA-4. Nature Reviews Immology (2001)

GJ Freeman et al, Engagement of the PD-1 Immunoinhibitory Receptor by a Novel B7 Family Member Leads to Negative Regulation of Lymphocyte Activation. JEM (2000)

Y Iwai et al, PD-1 blockade inhibits hematogenous spread of poorly immunogenic tumor cells by enhanced recruitment of effector T cells. Int Immunology (2004)

餓死癌細胞

據說之前仿間謠傳不吃東西可以餓死癌細胞，不知道最後是人先被餓死，還是癌細胞先被餓死呢？XD

這個研究也是餓死癌細胞(這是四年前的 TED Talk)，不過是靠吃東西餓死癌細胞。血管是體內運送養分和氧氣的交通工具，長多長少是受到調控的，透過釋放出 stimulators 或是 inhibitors，例如受傷可能造成傷處血管變少，這時候就會長出新血管讓它恢復到原本的狀況，血管新生的過程叫做 angiogenesis，過多或不足的血管新生都會造成疾病。

癌細胞要增生變成腫瘤需要很多養份和氧氣，於是它們會釋放出 stimulators 來刺激血管增生，好用來運送養份和氧氣給癌細胞們，於是針對這點，anti-angiogenic therapy (抗血管增生療法)被用來治療癌症，例如當 VEGF (vascular endothelial growth factor)和它的接受器(VEGF receptor)結合後會產生促使血管增生的訊號，於是就有抗體是針對 VEGF 或 VEGFR，用來阻斷下面的訊息傳遞，抑制不正常的血管增生，使癌細胞得不到養分繼續生長。

Dr. William Li 和他的團隊把抗血管增生的抑制劑塗抹在動物的腫瘤處，抑制血管新生，結果腫瘤消掉了。2004 到 2009 年間的 anti-angiogenic drug 有十二個，目前美國 NIH 網站上列的抗血管增生藥物(angiogenesis inhibitors)有十四個。不過，有時候發現癌症的時候已經太晚了，如果可以預防的話不是更好？大多數人認為預防癌症的發生的方法就是不要吃會致癌的食物，但是 Dr. Li 想的相反，他認為可以吃減少血管增生的食物，於是他們測試了有哪些食物裡的成分可以抑制不正常的血管增生，例如他們發現紫葡萄或紅酒裡的 resveratrol 可以抑制血管增生。他有列了哪些食物可以抗血管增生，有興趣的自己看。是說我覺得如果已經確診有癌症了，靠食療實在太慢，直接給 anti-angiogenic drug 比較快，食物大概就是吃一吃用來預防吧。

NIH - Angiogenesis inhibitors

ps. 不過有的癌細胞是可以在無氧的狀態下生長的，所以很難處理，記得我研究所畢業時申請的一個博士後研究就是做 tumor hypoxia，有興趣的可以孤狗 tumor hypoxia，或是看下面連結的 review papers。



Review papers:

A Albini et al, Cancer prevention by targeting angiogenesis. Nature Reviews Clinical Oncology (2012)

V Petrova et al, The hypoxic tumour microenvironment. Oncogenesis (2018)

Phage display 和小抗體製造

之前聊過抗體的一些知識，這篇來介紹如何用 phage display (噬菌體展示)來製造抗體，這邊說的抗體是奈米抗體 VHH，也就是 nanobodies (Nbs)。如果還記得之前說過的，駱駝除了正常的 IgG 抗體外，還有一種只有 heavy chain 的小抗體(HCAbs)，而 VHH 就是它的 variable region，很小，只有 14kDa 左右。和用老鼠產生抗體的方式類似，只是這是把抗原打到羊駝(llama, alpaca, 屬於駱駝科 Familiy: Camelidae)體內。

奈米抗體(nanobodies)的開發流程

整個用 phage display 研發小抗體的步驟大概是：

1. Purify antigen (純化抗原)
2. Immunization (把抗原打到動物體內讓他們產生抗體)
3. Library building (製造抗體 library)：整個過程包括抽取動物的免疫細胞(lymphocytes)，從免疫細胞裡抽取 RNA，把 RNA 轉成 cDNA，PCR amplification，clone 到 phagemid 裡面後再 transform 到細菌裡做成細菌的 library。之後用 phage 去感染細菌，轉成 phage library。
4. Biopanning & phage amplification: 從含有各種抗體基因的 phage library 裡面把不跟抗原反應的抗體洗掉，抓出和抗原抓出相對應的抗體。
5. Phage ELISA: 利用 ELISA 釣出 positive clones，這個步驟是要從 biopanning 出來的一堆 phage 裡一個個挑出真的會和抗原反應的抗體。
6. Sequencing of positive clones：定序從 phage library 釣出來的抗體，知道序列後就可以大量生產。
7. Cloning into expression vector & purification: 把抗體的基因轉到 expression expression vector 後就可以大量表現和純化抗體。

打入抗原、讓牠產生抗體後，就可以採集牠的 lymphocytes，從中抽取 mRNA，再轉成 cDNA。之後用可以 amplify VHH 的 primers 和 PCR 去 amplify，再把這些 amplified 出來 VHH fragments subclone 到 phagemid。這些 amplified 出來的 VHH fragments 就是抗體的 DNA library。


Figure / Phagemid pMECS. VHH gene is fused to gIII gene of bacteriophage. (Vincke et al 2002)

噬菌體的構造

Phagemid 本身有包含 bacteriophage (噬菌體)的一些東西(e.g., f1 origin)，所以除了會複製外，在 helper phage M13 的加入下 [註1]，會在細菌裡 package 成一個個的 phage particles。把 VHH 的 DNA library subclone 進 phagemid 裡面是為了讓它和 phage 的 gene III 連結在一起 [註2]，gene III 的蛋白質 product 是噬菌體的外層蛋白 g3p (g3 protein)，也就是 coat protein [註3]。把 VHH 的 DNA library 和 gene III 連結在一起的話，那當 phagemid 在複製和 package 成 phage 的時候，就會和 g3p 一起表現在 phage 的表面（下圖 P3 的地方），這就是 phage display (噬菌體展示)，把抗體展示在噬菌體表面。


Figure / Microbiology: Chapter 11 - Molecular Biology of Viruses (W. W. Norton)

註1：f1 和 M13 phage 都屬於 inovirus (ssDNA virus)，M13 有十個 genes，gene I 到 gene X，它們的 protein products 即是 g1p 到 g10p。Phage display 裡常用的 helper phage 是 M13KO7，可以幫助噬菌體把 phagemid 包進 phage particle 裡面。

"M13KO7 is able to replicate in the absence of phagemid DNA. In the presence of a phagemid bearing a wild-type M13 or f1 origin, single-stranded phagemid is packaged preferentially and secreted into the culture medium.This allows easy production of single-stranded phagemid DNA for mutagenesis or sequencing." （摘自 NEB 的產品網頁）

註2：下面提供的 protocol 裡用的 phagemid 是 pMECS，它帶有 f1 origin 和 gene III。
註3：如果對病毒還算熟悉的話，就是類似病毒的 capsid proteins 或是 envelope proteins。M13 的 g3p 是在的尾端，Expasy 的 ViralZone 有不錯的介紹：Inovirus - M13 phage。

要讓噬菌體把 VHH 表現在它的表面，需要把 phagemid 轉入細菌中，這樣它才有辦法在細菌裡面 package 成一個個的 phage，並且在細菌中大量繁殖，而這些會表現 VHH 的 phage 就是 phage library。

怎麼釣出你要的奈米抗體？

因為一隻羊駝裡可以打入好幾種抗原，所以產生的抗體是對抗不同抗原的混合，因此上面做出來的 phage library 其實是各種抗體的混合。例如你在一隻駱駝裡打入 A, B, C 三個抗原，牠體內就會產生 anti-A, anti-B 和 anti-C 的奈米抗體，你的 phage library 也就會是這三種抗體的混合，如果你要從中挑出 anti-A 的 nanobodies，這時候就要做 biopanning 。

那要怎麼挑出來呢？

就是用 A 抗原去挑，把 A 固定在盤子上後，加入 phage library，這時候表現有 anti-A nanobodies 的 phage 就會 bind A，然後把其他不會 bind A 抗原的 phage 都洗掉，再把會 bind A 抗原的 phage 洗出來(elution)，就是你的 anti-A phage library 惹。Anti-B 和 anti-C 的 phage 也可以用同樣方法挑出來，這個步驟就是 biopanning。


Figure / Scheme of phage display (T Schirrmann et al, Molecules 2011; doi: 10.3390/molecules16010412)

上圖中可以看到每個 phage 的尾巴都表現不同的抗體，這些抗體會和它可以辨識的抗原結合，然後其他的抗原的抗體或是 non-specific binding 會被洗掉，而可以和抗原結合的抗體則會被挑出來，在 helper phage 的幫助之下再度感染細菌，使這些帶有能夠辨識抗原的抗體的噬菌體 amplify。經過 amplification 的噬菌體再進入下一輪的 biopanning，把 binding 比較弱的和其他的 non-specific binding 再洗掉，這樣重複個兩三輪。

之後這些各別的 anti-A, anti-B 和 anti-C phage library 可以用 ELISA 的方法(i.e., phage ELISA)挑出 individual phage clones，例如找出 affinity 最高、最 specific，或是最 stable 的 nanobodies。挑出來的 phage clones 可以萃取出它們的 phagemid，定序之後就可以知道這些 nanobodies 的 DNA sequences。



詳細的 protocol 可以參考這篇：

C Vincke et al, Generation of Single Domain Antibody Fragments Derived from Camelids and Generation of Manifold Constructs. Antibody Engineering (2012)


延伸閱讀： 關於抗體和抗體藥的一些小知識