小分子就是化學物質，大分子則是生物製劑(biologics)，例如蛋白質或抗體藥，細胞治療則包括 CAR-T 或基因治療等等。
蛋白質藥物包括胰島素或各種激素等等，抗體藥開始較大眾所知就是疫情時出名的 Regeneron 開發的新冠抗體藥。
抗體藥分為很多種，除了傳統的 IgG 外，還有分子較小的 scFv (single-chain fragment variable) 和只有鯊魚和駱馬才有的 VHHs，又稱 nanobodies。
有興趣的可以看這篇：關於抗體和抗體藥的一些小知識
抗體藥物有哪些？
抗體藥物主要用於精準醫療(precision medicine)，目前大多為癌症藥物。這篇想整理的是抗體改造或加料過後的應用，大部分也都是針對癌症而開發的，包括雙特異性抗體(bi-specific)和多特異性抗體(multi-specific)，以及抗體藥物複合體(ADCs, antibody-drug conjugates)和放射性同位素抗體(RACs)等等。
Bi-specpfic / Multi-specific Abs
天然的抗體本身只能抓住一種抗原，但是經改造過後，可以把它的兩個 binding sites，也就是 Fab 的部分改成抓不同的抗原。
這個概念最早由 Nisonoff 和他同事提出來，並於 1960 發表在 Science 期刊上，不過近五十年後的 2009 年才有第一個 FDA 核准的 bispecific (bsAb) 抗體藥，為德國生技公司 Fresenius Biotech GmbH 研發的 catumaxomab (Removab®)。
為什麼要做這種抗體呢？因為如果能和不同的抗原結合，可以應用的地方就更多了，大致可以分為三種：
1. 連結免疫細胞和癌細胞(in-trans binding)，藉此召喚免疫細胞過來殺癌細胞，通常都是透過 T 細胞受體 TCR (T cell receptors) 的 CD3。召喚 T 細胞來殺死癌細胞的又叫 T-cell engagers (TCEs)，Removab 即屬於這種，一邊抓的是 T 細胞的 CD3，另一邊抓的是癌細胞的 EpCAM，不過它的 Fc 是第三個 binding site，會和其他的免疫細胞的 Fcγ 受體結合，例如巨噬細胞(macrophage)和自然殺手細胞(natural killer cells, NKs)
2. 連結同一個細胞上的受體(in-cis binding)，藉此阻斷訊號傳遞。 針對癌細胞上的 RTK 受體(receptor tyrosine kinases)來抑制訊息傳遞，例如 EGFR 和 HER2，可以結合連結相同的受體，也可以連結不同的受體，例如 Merus 的 Zenocutuzumab 是連結 HER2 x HER3，而他的 NJ-61186372 則是針對 EGFR x MET。Zenocutuzumab (MCLA-128) 主要是針對 NRG1+ 的癌症，包括胰臟癌(PDAC)和非小細胞肺癌(non–small cell lung cancer, NSCLC)，目前正在第二期臨床試驗。
3. 幫助受體組合，藉此促進受體活躍。這類抗體可以作為 agnoist，例如 Roche 正在研發中的 BFKB8488A 是針對生長激素 FGFR1C (fibroblast growth factor receptor 1C) 和 KLB (β-klotho)，用於促進 FGF21 (fibroblast growth factor 21) 的訊息傳遞，進而治療第二型糖尿病。
Antibody-Drug Conjugates (ADCs)
抗體藥物複合體即是把抗體和藥物連結在一起，通常是化療藥物，透過抗體把化療藥物帶進癌細胞後才放出藥物殺死癌細胞，除了加強效用外，還可以減少藥物對正常細胞的傷害，希望可以取代傳統化療。
ADC 的結構和設計
ADC 的結構分成三個部分：Antibody - linker - Payload
抗體部分，目前常用的是 IgG1，除了它的穩定性較強，在體內的半衰期約 14-21 天外，透過 Fcγ 受體(Fcγ receptors, FcγRs)召喚先天免疫細胞，包括巨噬細胞和自然殺手細胞，也較少引起免疫原性(immunogenicity)，減少引起抗藥抗體(anti-drug antibodies)的產生和過度的免疫反應的風險。
在抗體設計上會希望對抗原的親和性(affinity)很好，且標靶的抗原是在癌細胞上高度表達，但在健康細胞上表達有限的。在特異性(specificity)上也是要選著專一性較高的，另外就是需要有效的內吞(internalization)。除了用單一特異性的，也有用 bispecific，可以針對較多種類的癌細胞。
藥物(payload)的部分通常用的藥比傳統的化學治療藥物要強，包括 MMAE (monomethyl auristatin E), MMAF (monomethyl auristatin F) 和美登素(maytansine, maitansine)的衍生物 DM1 和 DM4。
抗體和藥物之間的連結(linker)可為可裂解(cleavable)或是不可切割的，目前的主流是可裂解的，因為不可裂解的需要把整個 ADC 都分解掉才能釋放藥物。可裂解的可以利用腫瘤和正常生理條件中的差異來裂解，例如腫瘤有比較低的酸鹼值或比較高的蛋白酶活性，ADC 在進入癌細胞後可以透過蛋白酶(protease)切開連結釋出藥物。
另外，也可以透過 linker 改善 ADC 的疏水性(hydrophobic)。由於小分子藥物有比較高的疏水性來保持它的 potency，因此若是 ADC 上有很多 payload，就會使它的疏水性增加，可能會導致它比較快被清除，或是有 aggregation 的風險。為了要解決這個問題，可以把 linker 設計的比較親水性一點，例如用 PEGylation。
市面上的抗體藥物複合體
在抗體和藥物的連結方式上，目前市面上已批准的是使用隨機的方式，但因為是隨機的，所以 payload 的數量(0-8, 4 可能最多)和位置無法控制。比較新的是定位連接法(site-specific)，透過蛋白質工程可以設計連接的位點讓 payload 去連接，這個方法會使 ADC 比較穩定。
目前通過 FDA 核准的癌症 ADC 有 13 個，涵蓋超過 20 種適應症，主要為血癌和實質腫瘤(solid tumours)。這幾年投入 ADC 市場的生技公司和藥廠也不少，例如溫哥華因為疫情崛起的 AbCellera 和在地老公司 Zymeworks 都開始做 ADCs。大藥廠如 Merck 也於去年收購了研發 PBSEs (payload-binding selectivity enhancers) 的生技公司 Abceutics，PBSEs 的特點是它和 ADC 同時施打進體內，可以吸收掉被釋出癌細的藥物，減少它對正常細胞的損害。除此之外，Pfizer 也於去年收購了 Seagen 和它的四個已上市的 ADC 藥物。
最早得到 FDA 許可、針對實質腫瘤的 ADC 為 Genentech 的 KADCYLA® (trastuzumab emtansine)，它於 2013 年獲得許可用於治療乳癌晚期，之後又於 2019 年獲得許可治療乳癌早期，抗體是針對 HER2 的 IgG1，戴的藥物是 DM1。近期較有名的 ADCs 可能是第一三共和 AZ 合作的 Enhertu (HER2 ADC, trastuzumab deruxtecan)，它在 2019 年時通過 FDA 許可用於治療乳癌，也是針對表現 HER2 的癌細胞的 IgG1，藥物則是 DXd (topoisomerase I inhibitor)。今年初又通過許可以用在非小細胞肺癌，目前的適應症就有五個，包括乳癌、非小細胞肺癌、胃癌和實質腫瘤，替藥廠賺進了不少營收，2024 Q1 就有 $461M。
Radionuclide antibody conjugate (RACs)
除了帶化療藥物的 ADC，還有一種是帶放射物的配體(ligand)或抗體，是近年來的新歡，它比普通 ADC 有優勢的地方在於它不只可以用來殺死癌細胞，還可以用來觀察腫瘤的位置和藥物吸收的情形，希望可以用來取代傳統的放射線治療。
Radioconjugates
介紹 RACs 之前先介紹一下 radioconjugates (放射性配體共軛物)，是直接把目標蛋白的配體和放射性同位素(radioisotope)連結。
目前已上市的放射性配體共軛物有 Novartis 用於治療胃腸胰神經內分泌腫瘤(gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors, GEP-NETs) 的 Lutathera (lutetium-177 dotatate) 和治療攝護腺癌的 Pluvicto (lutetium-177 vipivotide tetraxetan)，分別於 2018 年和 2022 年獲得 FDA 許可。Pluvicto 於 2023 年的營收則是 $980M，Lutathera 則是 $605M，比前年增加了 28%，錢景大有可為。
這兩個藥物都是用釋放 β 射線的同位素 lutetium-177，藥物在到達或進入細胞後，釋放出的輻射會破壞癌細胞的 DNA，藉此殺死臨近的癌細胞。Lutathera 針對的是表現在 NET 細胞上的受體 SSTR2 (somatostatin type 2 receptor)，Pluvicto 則是用可以胜肽 vipivotide 來抑制表現在攝護腺癌細胞上的抗原 PSMA (prostate-specific membrane antigen)。
除了 β 射線外，還有 α 射線，它的範圍較小但能量較高，在殺死癌細胞上效果更好。另外，患者在接受 Lutathera 和 Pluvicto 治療後的一個禮拜內須要遠離孕婦和小孩，因為 Lu-177 的半衰期是一個禮拜，而 α 射線穿透的範圍較短，相較之下反而是個優勢。目前有好幾個 α 射線的臨床試驗，最普遍的放射同位素為 actinium-225 (Act-225), lead-212 (Pb-212) 和 astatine-211，像是 Novartis 的攝護腺癌藥物也有出的 Act-225 版本的 225Ac-PSMA-617，正在第一期臨床試驗中。
Bristol Myers Squibb 於去年花 $4.1B 鎂收購的 RayzeBio，它的 RYZ101 用的也是 α 放射的 actinium-225 (Act-225)，同樣是針對 NET 細胞上的受體 SSTR2，主要是用來治療對 Lutathera 沒反應的患者，目前在第三期臨床治療。
RACs
相較於放射性配體共軛物，放射同位素接在抗體上可以在體內維持較久，因為抗體穩定性較強，也因此比較適合接半衰期較長的放射同位素。
截至目前為止，只有兩個 FDA 核准的 RACs：
Zevalin (ibritumomab tiuxetan)：於 2002 年獲得 FDA 許可，放射同位素是用 Iodine-131，抗體是針對 CD20，用於治療表現 CD20 的 non-Hodgkin's lymphoma。
Bexxar (tositumomab and iodine I 131 tositumomab)：於 2003 獲得 FDA 許可，放射同位素是用 Y-90 (Yttriuim-90)，抗體也是針對 CD20，用於治療表現 CD20 的 non-Hodgkin's lymphoma。
不過抗體的優點也是缺點，雖然它較穩定，可以在體內停留的時間較長，但用在放射同位素上就是個缺點，因此較小的胜肽反而比較有利。
生技公司 Y-mAbs 為此開發了一個解法，就是利用雙特異性的 scFv 設計了一個 SADA (Self-Assembling and DisAssembling)，一邊是 anti-GD2，一邊是 anti-DOTA (同位素螯合劑)，然後接一個可以拆開或組合成 tetramer 的蛋白，在他們的 YT 影片裡是說用 P53。治療分成兩個步驟，第一步是先把抗體打進去，組合成 tetramer 的會抓住癌細胞，monomer 則會在血液裡晃一晃就因為體積小排出去，接者再把同位素打進去，這時候抗體的 DOTA 就會抓住同位素，這樣就可以達到精準治療，又不會有 IgG 接抗體後停留在體內太久的問題，他們用來治療實質腫瘤的 GD2-SADA:177Lu-DOTA 目前正在第一期臨床試驗中。
除了用 scFv 外，也有公司選擇用小抗體 VHHs，例如溫哥華的生技新創公司 Abdera 是用 VHH-Fc，他們用來治療對小細胞肺癌(small cell lung cancer )和的為大細胞神經內分泌癌(large cell neuroendocrine carcinoma, LCNEC)的 ABD-147 是針對表現 DLL3 的實質腫瘤，用的同位素為 Act-225，目前正在第一期臨床試驗。
Degrader-Antibody Conjugates (DACs)
抗體可以接藥物外，還可以接 degrader，是指把目標蛋白降解，這個技術稱為 TPD (targeted protein degradation, TPD)，通常都是利用 ubiquitin-proteasome system (UPS)，藉由 E3 ligase 幫目標蛋白標記 ubiquitin (Ub)，使它可以被 proteasome 降解。其方法是用 molecular glue，是可以把 E3 ligase 目標蛋白連結在一起的小分子，使目標蛋白得以被 E3 ligase 標記和降解。
另一個和 molecular glue 很類似的是 Arvinas 開發的 PROTAC (PROteolysis TArgeting Chimera)，它的結構分成三個部分，兩側分別是 E3 ligase 和目標蛋白的配體(ligand)，中間是連結兩側配體的 linker，可以把目標蛋白帶到 E3 ligase 進行標記和降解。
PROTAC 是 2001 年時由耶魯大學的 Dr. Craig Crews 首先發表於 PNAS，之後於 2013 年成立 Arvinas，目前大部分的藥物都還在第一期臨床試驗，不過他們用來治療乳癌的口服藥 Vepdegestrant (ARV-471) 已進入第三期臨床試驗，是針對 ER+ (estrogen receptors)/HER2- 的患者，2011 年時和輝瑞(Pfizer)合作開發和商業化。
PROTAC 和 molecular glue 都可以接到抗體上，抗體針對的是癌細胞表面的抗原，透過抗體和抗原的結合，把 PROTAC 或 molecular glue 帶進細胞，把目標蛋白帶到 E3 ligase 進行標記和降解。
目前在做這個的有和輝瑞合作的 Nurix，不過目前還沒有太多資訊。另一個是 2016 年成立的韓國生技公司 Orum Therapeutics (오름테라퓨틱)，他們目前只有兩個藥物進到第一期臨床試驗，一個是針對 HER2+ 的 ORM-5029 (TPD2-GSPT1)，DACs 透過抗體結合 HER2 進入細胞，之後被降解釋出 molecular glue (SMol007) 把目標蛋白 GSPT1 (translation termination factor) 帶到 E3 ligase 進行標記和降解，導致癌細胞死亡。另一個是用來治療急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML)，抗體的部分是針對 CD33，進入細胞後也是透過降解 GSPT1 殺死癌細胞，這個藥物已於 2023 年年底被 Bristol Myers Squibb (BMS) 收購。
Extracellular vesicles (EVs)-Fc
除了用單一抗體，也可以利用外泌體(Extracellular vesicles, EVs)展示很多抗體。最近瑞典 Karolinska University 發表在 Nature Biomedical Engineering 的一篇研究是把帶有抗 Fc 的蛋白或結構域(domain)基因的載體送進會產生 EV 的細胞裡，例如 Protein A 或 Protein G 等等，使它可以把抗 Fc 的蛋白表現在外泌體外面。接著，把這些表現有抗 Fc 蛋白的外泌體和抗體混合，外泌體外面就會插滿了抗體，而外泌體裡面就可以裝化療藥物。目前還在老鼠實驗階段，但在老鼠身上的效果不錯。
References:
Podcast: 魔術子彈─抗體藥物複合體 Antibody Drug Conjugate (ADC)
K Tsuchikama, Y Anami, SYY Ha et al. Exploring the next generation of antibody–drug conjugates. Nat Rev Clin Oncol (2024) DOI: 10.1038/s41571-023-00850-2
M Senior. Precision radiation opens a new window on cancer therapy. Nat Biotechnol (2024) DOI: 10.1038/s41587-024-02295-z
OPB Wiklander, DR Mamand, DK Mohammad et al. Antibody-displaying extracellular vesicles for targeted cancer therapy. Nature Biomedical Engineering (2024) DOI: 10.1038/s41551-024-01214-6
