腺病毒疫苗引起血栓的可能機制

有兩篇，一篇是從 mRNA 角度，一篇是從 protein interaction 的角度。

五月時 CBC 報導的那篇研究是猜測腺病毒疫苗，也就是 AZ 和 J&J 疫苗，造成罕見血栓(vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia, VITT)的可能原因。這篇德國研究目前還只是刊在 ResearchSquare 上的 pre-print，尚未經過 peer-review，不過還滿有意思的，之前沒想過這個可能性。 簡單來說，原因就是 alternative splicing events。腺病毒疫苗和 mRNA 疫苗的差別，除了是否用病毒載體外，就是一個是 DNA，一個是 mRNA。（感覺好像在講廢話 XD）

現在想想一個正常基因在細胞內表現會發生的事：
1. DNA transcribed to RNA
2. RNA splicing
3. mRNA translated to polypeptide

這篇研究認為，問題就出在第二步。腺病毒進入細胞後，帶有 Spike ORF 的 DNA 序列轉錄成 RNA，然後就在這個地方，出現了額外的 RNA splicing，這個 RNA splicing 的結果就是產生了不同 truncated Spike，有的可能少了 C-terminus，有的可能少了 N-terminus，使可以到處游來游去的 soluble Spike，而這些到處遊走的 soluble Spike 就會到處和細胞表面的 ACE2 結合，當它們和血管細胞上的 ACE2 結合的話，就會造成血栓。


Figure / Predicted splicing sites within Spike ORF (E Kowarz et al, 2021)

他們用線上程式 SpliceRover online 和 Alternative Splice Site Predictor (ASSP) 分析比較 AZ 和 JJ 疫苗的 Spike sequence，發現 AZ 疫苗用的 Spike 序列比 JJ 的序列預測出來 RNA splicing sites 多(AZ: 24, JJ: 20)，這也許是為什麼 J&J 的血栓比例比 AZ 少了十倍。兩個疫苗都是 codon optimized Spike (GenBank: YP_009724390.1; Ref Seq: NC_045512.2)。

"The AZ sequence was deduced from a publication which describes the use of the GeneArt codon optimizer (Fisher Scientific), while the Johnson & Johnson sequence was obtained directly from the Janssen company (kindly provided by Roland Zahn)."

mRNA 疫苗沒這個問題，因為它們直接到第三步。有人認為，如果能夠把 DNA 序列 codon optimized 到沒有 RNA splicing sites 的話，也許就能解決出現血栓的問題。

有興趣的可以看原論文，他們有做 RT-PCR 和 luciferase assay 測是否有 RNA splicing 的狀況。

CBC / Researchers claim mystery of rare blood clots tied to COVID-19 vaccines solved, but experts urge caution

原論文：E Kowarz et al, “Vaccine-Induced Covid-19 Mimicry” Syndrome: Splice reactions within the SARS-CoV-2 Spike open reading frame result in Spike protein variants that may cause thromboembolic events in patients immunized with vector-based vaccines" (DOI: 10.21203/rs.3.rs-558954/v1)

AZ ChAdOx1nCoV-19 疫苗的論文：N van Doremalen et al, ChAdOx1 nCoV-19 vaccine prevents SARS-CoV-2 pneumonia in rhesus macaques. Nature (2020)

第二篇是加拿大 McMaster 大學的研究，之前說要收集打 AZ 疫苗後血栓患者的血液來研究，沒想到動作還挺快的，竟然還發表在 Nature 惹呢！

腺病毒疫苗引起的罕見血栓 VITT 有點類似 heparin 引發的血栓 HIT (heparin-induced thrombocytopenia)。血小板內有個蛋白叫 PF4，當血小板被活化後，便會把 PF4 釋放到血液裡。HIT 發生的是因為 heparin 會和 PF4 上一個特定的部位結合，兩者結合後會使 PF4 形成 tetramers，然後使 PF4 裡的一個 70 個氨基酸長的 neoepitopes 暴露出來，有些人體內的 IgG 會和 PF4 的這個 neoepitopes 結合，然後活化更多血小板。

註：heparin 是一個很大的多醣(polysaccharide)

VITT 和 HIT 相像的地方在於 VITT 患者體內有抗 PF4 的抗體，但是不需要有 heparin 就可以造成血栓，為什麼呢？因為 VITT 患者體內的某個 IgG 和 HIT 患者體內的 IgG 都是和 PF4 上的同一個地方結合嘛？還是和 heparin 用同一個 PF4 上的 binding site 呢？



他們拿了 VITT 患者的血液來測試，發現不需要有 heparin，患者的血液就可以活化血小板。之後，他們用 mutagenesis 找出了 PF4 上和患者血液中 IgG 的結合片段，結果發現這個片段和 heparin 在 PF4 上的 binding site 是一樣的，也就是說 VITT 患者裡的抗體本身在沒有 heparin 得情況下就可以活化血小板。

雖說是找到了造化血小板的 binding site，但還是不知道為什麼某些人在打了疫苗後體內會出現這種罕見的抗體。

CBC / McMaster lab to screen for rare antibody that causes blood clots after AstraZeneca vaccination

McMaster News / McMaster researchers identify how VITT happens

TN / Exact Mechanism of Vaccine-Induced Blood Disorders Identified

McMaster Platelet Immunology Lab / Antibody Epitopes in VITT

A Huynh et al, Antibody epitopes in vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia. Nature (2021)