2019年7月5日 星期五

預防病毒感染除了打疫苗外還有什麼方法?

上個月刊在 Science Immunology 的一篇研究用的方法是用 CRISPR 改造 B cells。抗體基因分成 heavy chain (IgH) 和 light chain (IgL) 兩個部分,兩個都需要幾過幾次的 splicing 去除掉不需要的 V(D)J regions 才會變成最終的一個抗體。他們在 IgH VDJ 和 C (constant) region 中間的 intronic region 插入了對抗某個病毒(在這個研究裡是 RSV 和 Influenza) 的抗體的 IgL 和 IgH VDJ 的部分,C 的部分用原有(endogenous)的基因以減少需要插入基因的長度,使得改造過的 B cells 可以生產他們想要的抗體。


Figure / Wikipedia - VDJ recombination

他們把改造過的 B cells 植入老鼠體內,然後再輸入後的一個禮拜後,再讓老鼠感染 RSV (respiratory syncytial virus),感染五天後取其肺臟和胰臟側病毒量,並且和抗體藥 palivizumab 的效果做比較,結果顯示效果和抗體藥一樣好。另外,改造過的 B cells 在老鼠體內可以維持多久也是個問題,所以他們也測試了長期的效果,他們在移植基改 B cells 後的 87 天後才讓老鼠感染 RSV,然後同樣在感染五天後測量胰臟和肺臟的病毒量,結果和移植七天後的效果是一樣的。

這個方法如果在人體內可行的話,或許可以取代很難研發的疫苗,不過目前的老鼠實驗只測到 87 天後的效果,是否可以維持年以上的效果還不知道。



Article:

Science / Genetically engineered immune cells fight off deadly virus in mice (May 2019)


Paper:

HF Moffett et al, B cells engineered to express pathogen-specific antibodies protect against infection. Science Immunology (2019)









2019年6月28日 星期五

第一型糖尿病患的新型免疫細胞

對免疫系統稍有了解的,大概都知道免疫 T 細胞(T cells)和 B 細胞(B cells),兩者的產地不同。T 細胞由胸腺(thymus)生產,又分為兩種,殺手 T 細胞(CTLs; cytotoxic T cells)和 helper T cells),主要是用來殺死外來物,例如病毒和細菌。B 細胞則是產於骨髓(bone marrow)和淋巴結(lymph nodes),功能是記住外來物的樣子,然後在相同外來物再度入侵時,可以生產抗體抵禦。

不過最近研究發現,第一型糖尿病患(Type I diabetes, T1D)有種特別的免疫細胞,是 B cell 和 T cell 的混合體,同時表現 TCR (T-cell receptors)和 BCR (B-cell receptors),例如大多數的 DE cells 會表現 IgD 和 IgM [註 1]。另外,他們也同時表現 B cell 和 T cell 獨有的基因,目前暫稱為 dual expresser (DE) cells。普通的健康個體也有 DE cells,但是 T1D 患者比較多。除此之外,他們的 BCR CDR3 帶有一段特別的 amino acid sequence,只有第一型糖尿病患者的 BCR 才有,健康個體的沒有。第一型糖尿病主要是因為 T cells 跑去殺死製造胰島素(insulin)的胰臟 β cells,使其無法生產胰島素。目前認為 T 細胞會殺死 β cells 是因為胰島素的一個氨基酸片段 B:9-23 (SHLVEALYLVCGERG) 被 HLA (human leukocyte antigen)呈現給惹 T cells [註 2],使它誤以為胰島素是入侵者需要被消滅,而表現胰島素的 HLA 則是 HLA-DQ8,一種大量出現在第一型糖尿病患裡的 HLA。B:9-23 片段對普通的 HLA-DQ8 的 affinity 是很低的,但是 T1D 患者的 DQ8 binding pocket 裡和胰島素接觸的兩個氨基酸(A14, R22)如果突變為 A14E 和 R22E 的話,affinity 會增加百倍以上。

註 1:BCR 簡單來說就是黏在 B cells 表面的抗體,所以也同樣有三個辨識抗原的 CDRs (complementarity-determining regions)。抗體有五種 -- IgA, IgD, IgE, IgG & IgM,BCRs 則主要為 IgD 和 IgM。

註 2:HLA 屬於 Class II MHC (MHCII),表現在 APC (antigen-presenting cells) 表面,有個 binding pocket 會結合抗原(antigen),然後把它呈現給 T cells,告訴 T cells 這是入侵物,快去殺死它。



作者們認為第一型糖尿病的 T 細胞會攻擊 β cells 是因為這段特別的氨基酸片段 DE peptide 可能會和 HLA-DQ8 結合,進而引發 T cells 的攻擊,他們用電腦模擬的結果發現 DE peptide 和 HLA-DQ8 的結合力非常強,比胰島素的片段還大到上萬倍,因此很可能引發強大的 T 細胞反應。而實際實驗結果也顯示 DE peptide 的確會和 HLA-DQ8 結合,並且會刺激第一型糖尿病患的 T helper cells 產生免疫反應,指示 CTLs 去攻擊胰臟的 β cells。不過,雖然目前看來第一型糖尿病患的 DE peptide 是引發 CTLs 去攻擊生產胰島素的 β cells 的原因,但是胰島素在這中間扮演了什麼角色呢?如果 HLA-DQ8 結合的目標物是 DE peptide,為什麼 CTLs 攻擊的會是 β cells 呢?目前原因還不清楚,需要更多的研究。



Article:

The Scientist / Novel Type of Immune Cell Discovered in Type 1 Diabetes Patients


Paper:

R Ahmed et al, A Public BCR Present in a Unique Dual-Receptor-Expressing Lymphocyte from Type 1 Diabetes Patients Encodes a Potent T Cell Autoantigen. Cell (2019)


Book: B Cells and Antibodies, Molecular Biology of the Cell (4th ed.)










哪個國家最誠實?

Science 前兩天刊了一個有趣的研究,是大規模的行為試驗:到底哪個國家的公民最誠實?

這個研究是在四十個國家的共 355 個主要城市裡的公家或私人機構丟包超過 17000 個(長得像透明片夾 business cards,因為要讓人可以不用打開就看到裡面有什麼的)錢包。丟包的地點包括有銀行、電影院、博物館、郵局和飯店等等,丟包的方式是研究人員走去櫃檯說,「不好意思,我剛剛撿到這個錢包,但是我趕時間,你能不能幫忙把錢包物歸原主?」然後看有多少人會跟失主聯絡。另外,錢包有兩種,一種是裡面只有聯絡方式但是沒錢的,另一種是裡面有 USD$13.45,他們想知道哪個國家的公民回報率最高,哪種錢包比較多人回報,有錢的還是沒錢的。


Figure / Cohn et al, Science (2019)

結果呢,撿到錢包後會回報的比例,四十個國家中,瑞士最高,加拿大中間(比美國高,意外嘛?XD),中國最後(不意外?),比中國好兩三名的是摩洛哥、肯亞、秘魯和馬來西亞。回報的時間則是瑞士人第一天就聯絡失主惹,美國和英國平均三個禮拜後才回報失主,中國則是四十天後。另外,有趣的是有裝錢的錢包的回報率比沒錢的高。

btw, 日本竟然沒在實驗國家裡,不知道它和瑞士比哪個比較誠實。😆

(其實我覺得這個研究的實驗方式比較像是測試服務態度和做事效率,因為有的人可能會覺得 "That's not my job",聯絡失主不在他的工作範圍內,有錢的回報率比較高是因為覺得失主會很著急,沒錢的話就覺得無所謂而懶得聯絡,反正也不是他的職責,做了也不會加薪。)


Paper:

A Cohn et al, Civic honesty around the globe. Science (2019)










2019年6月14日 星期五

某血型鬧血荒怎麼辦?

血型的不同在於它們表面帶有不同的抗原(antigen)和抗體,血型 A 型的紅血球表面帶有 Type A antigen 和抗體 anti-B,B 型的人帶有 Type B antigen 和抗體 anti-A,AB 型的則帶有 A, B 兩種抗原但是不帶有抗體,O 型的人則不帶有抗原,但是帶有 anti-A 和 anti-B 兩種抗體。


Figure / Blood Groups and Red Cell Antigens - Chapter 5 The ABO blood group

抗原和其對應的抗體相結合,例如抗原 Type A antigen 和抗體 anti-A 結合的話就會引發免疫反應造成溶血(hemolysis),所以不同血型的人不能互相輸血,但是 AB 型的人可以接受所有人的血,因為他不帶有抗體,而 O 型可以捐血給所有人,因為它不帶有 A, B antigens 。

如果血庫缺少某種血或需要某種血怎麼辦?要是可以把所有的血全部變成 O 型血就好了,這樣不管需要哪種血都可以輸 O 型血。

UBC 的研究團隊在人體的腸道菌裡發現兩種酵素,可以把紅血球上的 Type A antigen 移除使它變成 O 型。紅血球表面的抗原,其實就是不同的醣連結 (carbohydrate chains),A 型的比 O 型的多帶了個 GalNAc (N-acetylgalactosamine),B 型的則是多帶惹 galactose。他們掃了上萬個腸道菌基因,發現腸道菌 Flavonifractor plautii 的兩個酵素 N-acetylgalactosamine deacetylase (GalNAc deacetylase) 和 α-galactosidases (GalNase),這兩個酵素合作的話,可以有效去除紅血球上的 Type A antigen,也就是把某部分的醣切掉,使它變成成 O 型紅血球上較短的醣連結。同理,也可以把 B 型紅血球表面的抗原去除,使它變成 O 型。


Figure / Blood Types and Carbohydrate Chemistry

UBC 團隊目前只試惹 A 型血,因為它比較普遍。不過,真的要用於輸血之前,要先有確認所有的 A 型紅血球都有被轉換成 O 型才行。


Article:

Science News / Type A blood converted to universal donor blood with help from bacterial enzymes (June 2019)


Paper:

P Rahfeld et al, An enzymatic pathway in the human gut microbiome that converts A to universal O type blood. Nature Microbiology (2019)









2019年4月21日 星期日

憂鬱症藥物 SSRIs 為什麼對有些病患有效,對部分病患卻無效?

可能很多人都知道 SSRIs (selective serotonin reuptake inhibitors) 是目前主要治療憂鬱症的藥物,但是並不是對每個人都有效,大約有 30%-40% 的患者對 SSRIs 沒有反應。憂鬱症的病因並不清楚,目前認為跟腦內的血清素訊息傳遞系統(serotonergic circuit)有關,因為 SSRIs 抑制了神經細胞接受血清素,使得神經細胞間的血清素(serotonin, 5-HT)濃度增加,而這減緩了部分憂鬱症患者的症狀,不過大家對其詳細的作用機制不清楚,不知道為什麼有些患者對 SSRIs 治療沒有反應。

這個月刊在 Molecular Psychiatry 的研究比較了正常人和重度憂鬱症(major depressive disorder, MDD)患者的神經細胞,想要知道在細胞層面上、基因表現上和神經迴路上有什麼差異。他們從有八百人的大型臨床實驗裡挑出對 SSRIs (escitalopram, citalopram) 治療反應最好的病患(R, remitters)和對治療完全沒反應的病患(NR, nonremitters),取他們的皮膚細胞後,把皮膚細胞重新改造回多功能幹細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs),再將幹細胞引導為神經細胞做研究。作者們研究了神經細胞的各個面向,包括細胞裡製造和降解血清素的酵素、運送血清素的蛋白等等,但卻沒發現對治療有反應和沒反應之間的差別。不過,他們發現雖然在生化分析的層面上沒差別,但是在神經細胞的形狀上有點不同。

對藥物沒反應的憂鬱症患者的神經細胞比較長,基因分析顯示某些基因的表現量也比較低,像是 PCDHA6 和 PCDHA8。當他們把神經細胞中的 PCDHA6 和 PCDHA8 的表現量降低後,細胞也會變得長長的,這種不正常的細胞形狀可能會使腦部的某個區塊的神經細胞過分交流,而某些區塊的交流不足,而這種不正常的腦神經迴路可能是憂鬱症患者對藥物沒反應的原因。

另外,他們用血清素去刺激由 iPSC 轉換而來的神經細胞,結果顯示正常人(H, healthy)的神經細胞和病患 R 組的神經細胞對血清素的刺激沒有差別,但是病患 NR 組的神經細胞對血清素的反應比 H 組和 R 組都大,出現過激(hyperactivity)的情形,而且它們的其中兩個血清素接受器(5-HT receptors)的表現量也比較高:5-HT2A 和 5-HT7,這兩個都是 GPCRs。他們也試了幾個血清素接受器的 antagonists,包括有 5HT2A receptor antagonist Ketanserin 和 5-HT7 antagonist SB-269970,結果發現 Ketanserin 可以抑制血清素引起的過激活動,把無反應病患組(NR)的神經細胞活動降到跟 H 組和 R 組一樣,SB-269970 也有相同的效果。另外,FDA 核准用來治療精神疾病 biopolar 的藥物 Lurasidone 也是的 5HT2A 和 5-HT7 receptor antagonist,實驗結果顯示它也可以抑制 5-HT 在病患神經細胞 NR 組引起的 hyperactivity。

這個研究結果讓我們了解幾點:
- 血清素 5-HT 會引起神經細胞(serotonergic neurons)反應,MDD 病患的神經細胞會出現過激反應(hyperactivity)。
- 憂鬱症可能是因為 5-HT2A 和 5-HT7 這兩個訊息傳遞路徑有關
- 對憂鬱症藥物 SSRIs 沒反應的病患,其神經細胞上的 5-HT2A 和 5-HT7 receptors 比較多。
- 5-HT2A 和 5-HT7 receptor antagonist 可抑制血清素引起的 hyperactivity。
- 5-HT2A 和 5-HT7 或可做為治療憂鬱症的標把蛋白



Article:

Salk News / When neurons are out of shape, antidepressants may not work (2019)


Paper:

KC Vadodaria et al, Altered serotonergic circuitry in SSRI-resistant major depressive disorder patient-derived neurons. Molecular Psychiatry (2019)










2019年3月9日 星期六

用酵母菌釀造大麻

繼三年前有人發表了如何用酵母菌釀造嗎啡後,這個月 UC Bekeley 的研究團隊發表了他們用酵母菌釀造大麻的成果在 Nature。記得那時候才還在臉書上開玩笑說,應該要研究如何用酵母菌釀造大麻的,想來會很有錢途,沒想到真有人做惹。

舊文:用酵母菌釀造嗎啡

看了整篇研究後,覺得基改酵母讓它生產大麻比生產嗎啡簡單啊,主要是 CBD (cannabidiol) 和 THC (Δ9-tetrahydrocannabinol) 的產生過程還滿直接的,不像嗎啡中的中介物 S-reticuline 很難產出,另外就是這篇研究是用 Cas9 來改造酵母菌基因,應該也比原本的用 shuttle vector 去改要容易點。


Figure / Pathway of CBD and THC biosynthesis (modified from X Luo et al, Nature 2019)

上面是大麻的 THC 和 CBD 生產的主要路徑,這兩個物質大家應該滿熟悉的吧?THC 是讓人嗨的,CBD 則是有鎮靜止痛的效果。大麻裡面除了這兩個物質外,還有 CBN (cannabinol), CBG (cannabigerol) 和 CBC (cannabichromene)。

上面幾個途徑的各個反應如下:(後面 highlight 的部分是所需酵素)

1. Sugar (galactose) acetyl-CoA --> malonyl-CoA
2. Sugar (galactose) --> acetyl-CoA --> hexanoyl-CoA (hexanoly-CoA pathway)
3. Hexanoic acid --> hexanoyl-CoA [CsAAE1]
4. Hexanoyl-CoA + 3x malonyl-CoA --> olivetolic acid (OA) [CsTKS, CsOAC]
5. OA --> cannabigerolic acid (CBGA) [CsPT4]
6. CBGA --> THCA (Δ9-tetrahydrocannabinolic acid), CBDA (cannabidiolic acid) [THCAS, CBDAS]

Pathway #2 他們稱為 hexanoyl-CoA pathway,從 acetyl-CoA 轉化成 hexanoyl-CoA 的過程需要的酵素為:RebktB, CnpaaH1, Cacrt, Tdter

可以看出 CBGA 在裡面扮演重要的 intermediate,它除了是 THC 和 CBD 的 precursor 之外,也是 CBG 和 CBC 的,加入 CBCAS 之後就可以轉化成 CBCA,而以上這幾個酸性物質加熱後就會變成中性有活性的 CBG, THC, CBD 和 CBC。

CBGA --> CBG
THCA --> THC
CBDA --> CBD
CBCA --> CBC

以上這些物質,在大麻裡面是以酸性的形式存在,直到人們點煙或加熱的時候,才會轉化成 THC 或 CBD,這個過程也就是 decarboxylation。CBG 不具有讓人嗨的效果,近來被認為可以抗發炎,但是它在大麻裡面的量比較少,因為大多很快就被轉化成 THCA 和 CBDA。另外,THC 曝露在 UV light 和氧氣之下會慢慢變成 CBN,它跟 THC 同樣會讓人嗨,但是效果比較弱。

另外,雖然整個製造過程看起來滿簡單的,但是研究了一下發現,破酵母細胞萃取 THC 或 CBD 的這個步驟的成本滿高的,因為酵母菌的細胞壁(cell wall)很難破,這篇研究裡用的是 zymolase,而且用量是 2U/OD。這篇研究裡 THC 的產量是 8 mg/L,但是根據我的經驗酵母菌在搖了兩天後的 OD600 就可以超過 10,一公升的話 OD 就是 10,000,也就是說要用 20,000U 的酵素。這個酵素我查到的價錢是 2000U 要價加幣 $150,也就是說每 8 mg 就要花掉至少 CAD$1500,嘖嘖嘖~ 當然也有較便宜的破細胞方法,像是用 glass beads 或是 french press 這些用 mechanical force 的去破細胞。所以啊,成本還是要算仔細呢。XD



News articles:

UC Berkeley / Yeast produce low-cost, high-quality cannabinoids (2019)

Nature / Scientists brew cannabis using hacked beer yeast (2019)

Harvard Health Publishing / Cannabidiol (CBD) — what we know and what we don’t (2018)


Publications:

X Luo et al, Complete biosynthesis of cannabinoids and their unnatural analogues in yeast. Nature (2019)

S Deiana, Chapter 99 - Potential Medical Uses of Cannabigerol: A Brief Overview. Handbook of Cannabis and Related Pathologies (2017)









2019年2月22日 星期五

多運動可減緩阿茲罕默症 -- 運動賀爾蒙鳶尾素(irisin)

之前有研究發現運動會使體內釋放出一種賀爾蒙 -- irisin (鳶尾素),之前這個賀爾蒙的主要功能被認為是在於能量代謝,增加體內能量消耗,有助於減重,不過最近發現 irisin 也可以促進腦內海馬迴(hippocampus)腦神經細胞的生長。Irisin 的前驅物(precursor)是 FNDC5 (Fibronectin type III domain-containing protein 5),是一個頗大的穿膜蛋白(transmembrane protein),約有 100kDa,表現於肌肉組織。之後其頭尾的 N-terminal signal sequence 和 C-terminal tail 被切掉後剩下中間的一百多個氨基酸長的片段(D32-E143)就是 irisin。它是動物活動時由肌肉細胞釋放出來的一種 cytokine,稱為 myokine,可以刺激脂肪細胞活動,也被發現會促進海馬迴裡 BDNF 的表現。

FNDC5: UniProtKB, OMIM

在這篇研究中,作者們發現人類腦部的海馬迴裡有 irisin,而阿茲罕默症(Alzheimer's disease, AD)患者 海馬迴和脊髓液 (cerebrospinal fluid, CSF) 裡的 irisin 表現量比有輕微認知功能障礙的(mild cognition impairment, MCI)和正常的要為低。另外,LBD (Lewy body dementia) 失智患者的 CSF 內的 irisin 量也比較低,AD 和 LBD 患者血清內的 irisin 量則和正常人沒明顯差別。

接著,他們想知道 AD 是如何影響 irisin 的表現。他們把 AD 的致病蛋白 Aβ 加到培養的老鼠海馬迴細胞和人類的大腦皮質切片,結果發現細胞裡的 irisin mRNA 和蛋白表現量都減少了。在老鼠實驗中,他們發現被打入 Aβ 的老鼠,其腦部海馬迴中的 irisin 表現量大為下降。而本身是 AD 基改老鼠的海馬迴裡,在牠們 13-16 個月大、腦部出現 Aβ 堆積癥狀的時候,irisin 的表現量也是降低的,表示 Aβ 會影響腦內 irisin 的表現量。

除此之外,為了了解 irisin 在大腦的功能是什麼,他們敲掉了老鼠的 FNDC5,結果老鼠的腦神經活動 long-term potentiation (LTP) 和記憶力皆降低了。反之,增加老鼠腦部 irisin 的表現量則可以挽回因打入 Aβ 而降低的記憶力。另外,他們也用病毒把 FNDC5 基因送進 AD 基改老鼠裡,讓其腦部可以大量表現 irisin,看能不能因此改善 AD 基改老鼠的表現,結果顯示 irisin 可以ㄗ AD 基改老鼠腦部的 LTP 和其記憶力。

接著,他們接著想知道運動是否能夠對 AD 有實質上的改善,是否能做為治療的一環。他們把 Aβ 打入老鼠 CSF 中後讓他們每天游泳一小時,一週游五天,連續游五個禮拜,看看運動是否能夠預防 Aβ 造成的記憶力衰退。結果顯示老鼠腦部海馬迴的 irisin 表現不但沒有因為 Aβ 而降低外,老鼠的記憶力也沒有因之衰退。

由此大概可以知道,Aβ 會使腦中的 irisin 表現量減少,但是可以藉由運動增加 irisin 的表現,雖說不太可能光靠運動就大為改善 AD,不過如果可以某種程度的減少 Aβ 對腦部的傷害也是不錯的。不管怎樣,固定運動總是好的,有時間多動一下吧。



Article:

NNR / Exercise-linked Hormone Protects Memory in Mouse Models of Alzheimer's (Feb 2019)


Paper:

MV Lourenco et al, Exercise-linked FNDC5/irisin rescues synaptic plasticity and memory defects in Alzheimer’s models. Nature Medicine (2019)

P Boström et al, Article | Published: 11 January 2012A PGC1-α-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis. Nature (2012)


其他相關閱讀:【醫學研究】捲土重來的鳶尾素( Irisin)