IgG 單株抗體的開發流程

之前有寫過奈米抗體(nanobodies)是怎麼開發的，這篇來介紹目前主流的 IgG 開發流程。

其實整個流程和奈米抗體(nanobodis, VHH)差不多，主要差在用的動物不同，篩選和表達的系統不同。

IgG: 動物是用老鼠，取出老鼠 B 細胞或血液後，做成 hybridoma 後篩選，再用老鼠細胞 CHO 或人類細胞 HEK 表達。

VHH: 動物用駱馬，取出淋巴細胞後，插入噬菌體 phagemid 後篩選，再用細菌表達。

相關閱讀：Phage display 和奈米抗體製造

▋準備抗原 Antigen Preparation

抗原就是打進動物體內，讓牠產生抗體的東西，在做對抗病毒的中和抗體時，通常會用滅毒病毒(inactive viruses)或部分的病毒蛋白(recombinant proteins)。

如果不是做病毒的抗體，而是其他的，例如針對癌症腫瘤細胞的，抗原可能只有一小段胜肽，無法激起大量的免疫反應的話，會需要和其他較易引起免疫反應的東西接在一起，或是加 adjuvant，比較常見的是用在疫苗上。

▋接種 Immunization

就是把抗原打進動物體內，讓牠產生抗體，通常會打三劑，一個 primary injection 和兩個 booster injection，大概分別在第 14 天和第 28 天左右。

在接種約兩個禮拜後(大概是第 42 天時)會取老鼠血液，用 ELISA 測量抗體的產生狀況如何，如果免疫反應不高，抗體濃度低，可能需要加打 booster。如果血液中抗體夠高，會再打最後一劑不加 adjuvant 的抗原，三天後取脾細胞做融合。

▋分離 B 細胞 B cell isolation

在最後一劑接種的三、四天後，通常是血液中的抗體量達到高峰時，取出老鼠的胰臟，從中分離出淋巴細胞。


(點圖可放大)

▋製造融合細胞瘤 Hybridoma creation

這個步驟分成兩個部分，先要準備好骨髓癌細胞(myleoma)，再和 B 細胞做融合。

▍骨髓癌細胞

常用的骨髓癌細胞包括 Sp2/0 或 NS-1，為永生細胞株(mmortalized cells)，將它和 B cells 融合的目的是為了要讓 B 細胞可以無限的生長和產生抗體。

這些骨髓癌細胞缺少 HGPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)，在融合前幾週會被培養在含有 8-azaguanine 的培養液中，8-azaguanine 是 purine analog，在被 HGPRT 轉變成 azaGMP (8-azaguanosine monophosphate)，使細胞無法生成 purine，導致細骨髓癌細胞缺少 HGPRT，因此可以在含有 8-azaguanine 的培養液中存活，這是要確保使用的骨髓癌細胞都缺少 HGPRT。

HAT (hypoxanthine–aminopterin–thymidine) 培養液中的 HAT 在缺少 HGPRT 的情況下則無法合成 DNA，因此骨髓癌細胞無法在 HAT 培養液中存活，除非它們和 B 細胞融合，因為 B 細胞有 HGPRT。

▍細胞融合 Hybridization

把骨髓癌細胞和 B 細胞混合，加入幫助細胞融合的 PEG (polyethylene glycol)，然後在 HAT 培養液中養個 10-14 天左右，通常融合的成功率為 1% - 2%。

▋篩選融合細胞瘤 Hybridoma selection

這個步驟是篩選出可以對抗抗原的抗體，由於融合細胞瘤是一群不同的細胞組成，每個細胞產生的抗體都不一樣，要怎麼從中挑出你想要的抗體？

這時候就要稀釋細胞，稀釋到你把細胞加到 96-well 培養盤中時，每個孔都只有一個融合細胞，確保每一個孔都只會有一種抗體。

由於細胞會把抗體分泌到培養液中，這時候就可以用 ELISA 去測這些培養液，看哪個孔裡面的抗體是你想要的，就是會和抗原有反應的抗體。

不過，這個方你看了可能會覺得累吧？現在比較新的技術是用 microfluid 去分細胞，例如 AbCellera 的核心技術 microfluid single-cell screening，或是和它因為這個技術互告的 Berkeley Lights 的 Beacon® Optofluidic System。（剛剛想找 Berkeley Lights 網站，發現它已經變成 Bruker Cellular Analysis，它在 2023 年年初的時候以 $57.8M 鎂買下 IsoPlexis 成為 PhenomeX，年底的時候 Bruker Corporation 則用 $$108M 鎂買下 PhenomeX，然後我剛剛看 Bruker Cellular Analysis 的網站，他們已經從 microfluid 進化成 nanofluid。）

▋繁殖融合細胞瘤 Clonal expansion

這個部分就是大量培養你要的融合細胞，大量的融合細胞才能產生大量的抗體，也可以用來保存以備後用。

到這邊就可以結束了，接著進入從陪養液中純化抗體的部分。

或者是在篩選出融合細胞瘤後，從中萃取出其抗體基因，用另一個細胞系統大量表達抗體。

▋Cloning

就是從 B cell 萃取 DNA 以取得抗體的基因序列，然後轉到 expression vector，再在老鼠或人類細胞中表達。

IgG 抗體結構可分成 heavy chain (HC) 和 light chain (LC)，可以分開在兩個 vectors，或是放在同一個 vector。



Expression vector 通常會包含幾個要素：

• Enhancers: 增加抗體表現
• Promoter: SV40, CMV, EF-1
• Kozak sequence (cap-dependent translation initiation): 放在 start codon 前面，可以促進轉譯開始。
• Secretion signal: 讓抗體可以分泌出 B 細胞的訊號，包括 IL-2 signal peptide。
• MCS: 用來插入抗體基因的地方，包括 HC 和 LC。
• polyA tail
• Selection marker: 用來挑選成功轉進細胞的 plasmid，通常是用抗生素。
• Ori: 讓細胞可以複製 plasmid

▋抗體生產 Antibody production

主要包括幾個步驟：把帶有抗體基因的 plasmid 送入細胞，在細胞中表達抗體，然後純化抗體。

▍送入細胞 Delivery

把 plasmid 送入細胞有幾個方式：

• LNP (lipid nanoparticle) 或其他 lipid-based 的運送系統
• Electroporation
• Viral infection: 如果是用 viral vector 的話
• Calcium phasphate

▍表達細胞系統 Expression System

常用的老鼠細胞有 CHO cells，又包括 CHO-K1 和 CHO-pro3 等等。

或是人類細胞 HEK cells

▍純化抗體 Purification

就是用 FPLC 來純化抗體，常用的 column 包括 affinity (IMAC), ion exchange (IEX) 和 SEC (size exclusion column)。

▍功能測試 Functional tests

純化完之後就要測試抗體功能，因為有可能在純化的過程中，抗體沒有組合好等等情況而喪失該有的功能。

主要測試的方向包括：

• Binding affinity: 和抗原的親和力，或是抓住病毒的效力好不好。
• Specificity: 特異性夠不夠專一，會不會和其他不相干的蛋白結合，影響其功能。
• Functionality & Potency: 是否能消除病毒，或抑制感染。

常用的技術則包括 ELISA, BLI, SPR, flow cytometry 等等。

如果以上其中一個不夠好，可以透過分析其結構，看是否能夠改動某個序列片段或幾個氨基酸，最佳化抗體的功效。


延伸閱讀：精準治療 — 單株抗體藥物在臨床上的應用




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References:

NIH | Monoclonal Antibody Production

Hybridoma Technology - Monoclonal Antibody Production

VectorBuilder | Mammalian Antibody Heavy and Light Chain Coexpression Vector

精準治療 — 單株抗體藥物在臨床上的應用

抗體藥物是精準治療(Precision Medicine)的一種， 因為它是針對特定情況做的治療，例如帶有某種變異基因的腫瘤。這篇將介紹單株抗體在臨床治療上的應用，包括已經通過 FDA 核准的雙特異性抗體和抗體藥物複合體外，還有放射性同位素標靶抗體藥物或胜肽、標靶蛋白降解劑抗體複合物，以及抗體核酸複合物等等。

藥物除了常見的小分子藥物外，還有大分子和細胞治療。

小分子就是化學物質，大分子則是生物製劑(biologics)，例如蛋白質或抗體藥，細胞治療則包括 CAR-T 或基因治療等等。

蛋白質藥物包括胰島素或各種激素等等，抗體藥開始較大眾所知就是疫情時出名的 Regeneron 開發的新冠抗體藥。

抗體藥分為很多種，除了傳統的 IgG 外，還有分子較小的 scFv (single-chain fragment variable) 和只有鯊魚和駱馬才有的 VHHs，又稱 nanobodies。

有興趣的可以看這篇：關於抗體和抗體藥的一些小知識

抗體藥物有哪些？

抗體藥物主要用於精準醫療(precision medicine)，目前大多為癌症藥物。這篇想整理的是抗體改造或加料過後的應用，大部分也都是針對癌症而開發的，包括雙特異性抗體和多特異性抗體，以及抗體藥物複合體和放射性同位素標靶抗體藥(RACs)等等。

Bi-specpfic Abs 雙特異性抗體藥

天然的抗體本身只能抓住一種抗原，但是經改造過後，可以把它的兩個 binding sites，也就是 Fab 的部分改成抓不同的抗原。

這個概念最早由 Nisonoff 和他同事提出來，並於 1960 發表在 Science 期刊上，不過近五十年後的 2009 年才有第一個 FDA 核准的 bispecific (bsAb) 抗體藥，為德國生技公司 Fresenius Biotech GmbH 研發的 catumaxomab (Removab®)。

為什麼要做這種抗體呢？因為如果能和不同的抗原結合，可以應用的地方就更多了，大致可以分為三種：

1. 連結免疫細胞和癌細胞(in-trans binding)，藉此召喚免疫細胞過來殺癌細胞，通常都是透過 T 細胞受體 TCR (T cell receptors) 的 CD3。召喚 T 細胞來殺死癌細胞的又叫 T-cell engagers (TCEs)，Removab 即屬於這種，一邊抓的是 T 細胞的 CD3，另一邊抓的是癌細胞的 EpCAM，不過它的 Fc 是第三個 binding site，會和其他的免疫細胞的 Fcγ 受體結合，例如巨噬細胞(macrophage)和自然殺手細胞(natural killer cells, NKs)

2. 連結同一個細胞上的受體(in-cis binding)，藉此阻斷訊號傳遞。 針對癌細胞上的 RTK 受體(receptor tyrosine kinases)來抑制訊息傳遞，例如 EGFR 和 HER2，可以結合連結相同的受體，也可以連結不同的受體，例如 Merus 的 Zenocutuzumab 是連結 HER2 x HER3，而他的 NJ-61186372 則是針對 EGFR x MET。Zenocutuzumab (MCLA-128) 主要是針對 NRG1+ 的癌症，包括胰臟癌(PDAC)和非小細胞肺癌(non–small cell lung cancer, NSCLC)，目前正在第二期臨床試驗。

3. 幫助受體組合，藉此促進受體活躍。這類抗體可以作為 agnoist，例如 Roche 正在研發中的 BFKB8488A 是針對生長激素 FGFR1C (fibroblast growth factor receptor 1C) 和 KLB (β-klotho)，用於促進 FGF21 (fibroblast growth factor 21) 的訊息傳遞，進而治療第二型糖尿病。

Antibody-Drug Conjugates (ADCs) 抗體藥物複合體

抗體藥物複合體即是把抗體和藥物連結在一起，通常是化療藥物，透過抗體把化療藥物帶進癌細胞後才放出藥物殺死癌細胞，除了加強效用外，還可以減少藥物對正常細胞的傷害，希望可以取代傳統化療。

ADC 的結構和設計

ADC 的結構分成三個部分：Antibody - linker - Payload

抗體部分，目前常用的是 IgG1，除了它的穩定性較強，在體內的半衰期約 14-21 天外，透過 Fcγ 受體(Fcγ receptors, FcγRs)召喚先天免疫細胞，包括巨噬細胞和自然殺手細胞，也較少引起免疫原性(immunogenicity)，減少引起抗藥抗體(anti-drug antibodies)的產生和過度的免疫反應的風險。

在抗體設計上會希望對抗原的親和性(affinity)很好，且標靶的抗原是在癌細胞上高度表達，但在健康細胞上表達有限的。在特異性(specificity)上也是要選著專一性較高的，另外就是需要有效的內吞(internalization)。除了用單一特異性的，也有用 bispecific，可以針對較多種類的癌細胞。

藥物(payload)的部分通常用的藥比傳統的化學治療藥物要強，包括 MMAE (monomethyl auristatin E), MMAF (monomethyl auristatin F) 和美登素(maytansine, maitansine)的衍生物 DM1 和 DM4。

抗體和藥物之間的連結(linker)可為可裂解(cleavable)或是不可切割的，目前的主流是可裂解的，因為不可裂解的需要把整個 ADC 都分解掉才能釋放藥物。可裂解的可以利用腫瘤和正常生理條件中的差異來裂解，例如腫瘤有比較低的酸鹼值或比較高的蛋白酶活性，ADC 在進入癌細胞後可以透過蛋白酶(protease)切開連結釋出藥物。

另外，也可以透過 linker 改善 ADC 的疏水性(hydrophobic)。由於小分子藥物有比較高的疏水性來保持它的 potency，因此若是 ADC 上有很多 payload，就會使它的疏水性增加，可能會導致它比較快被清除，或是有 aggregation 的風險。為了要解決這個問題，可以把 linker 設計的比較親水性一點，例如用 PEGylation。

市面上的抗體藥物複合體

在抗體和藥物的連結方式上，目前市面上已批准的是使用隨機的方式，但因為是隨機的，所以 payload 的數量(0-8, 4 可能最多)和位置無法控制。比較新的是定位連接法(site-specific)，透過蛋白質工程可以設計連接的位點讓 payload 去連接，這個方法會使 ADC 比較穩定。

目前通過 FDA 核准的癌症 ADC 有 13 個，涵蓋超過 20 種適應症，主要為血癌和實質腫瘤(solid tumours)。這幾年投入 ADC 市場的生技公司和藥廠也不少，例如溫哥華因為疫情崛起的 AbCellera 和在地老公司 Zymeworks 都開始做 ADCs。大藥廠如 Merck 也於去年收購了研發 PBSEs (payload-binding selectivity enhancers) 的生技公司 Abceutics，PBSEs 的特點是它和 ADC 同時施打進體內，可以吸收掉被釋出癌細的藥物，減少它對正常細胞的損害。除此之外，Pfizer 也於去年收購了 Seagen 和它的四個已上市的 ADC 藥物。



最早得到 FDA 許可、針對實質腫瘤的 ADC 為 Genentech 的 KADCYLA® (trastuzumab emtansine)，它於 2013 年獲得許可用於治療乳癌晚期，之後又於 2019 年獲得許可治療乳癌早期，抗體是針對 HER2 的 IgG1，戴的藥物是 DM1。近期較有名的 ADCs 可能是第一三共和 AZ 合作的 Enhertu (HER2 ADC, trastuzumab deruxtecan)，它在 2019 年時通過 FDA 許可用於治療乳癌，也是針對表現 HER2 的癌細胞的 IgG1，藥物則是 DXd (topoisomerase I inhibitor)。今年初又通過許可以用在非小細胞肺癌，目前的適應症就有五個，包括乳癌、非小細胞肺癌、胃癌和實質腫瘤，替藥廠賺進了不少營收，2024 Q1 就有 $461M。

Radionuclide antibody conjugate (RACs)

除了帶化療藥物的 ADC，還有一種是帶放射物的配體(ligand)或抗體，是近年來的新歡，它比普通 ADC 有優勢的地方在於它不只可以用來殺死癌細胞，還可以用來觀察腫瘤的位置和藥物吸收的情形，希望可以用來取代傳統的放射線治療。

Radioconjugates

介紹 RACs 之前先介紹一下 radioconjugates (放射性配體共軛物)，是直接把目標蛋白的配體和放射性同位素(radioisotope)連結。

目前已上市的放射性配體共軛物有 Novartis 用於治療胃腸胰神經內分泌腫瘤(gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors, GEP-NETs) 的 Lutathera (lutetium-177 dotatate) 和治療攝護腺癌的 Pluvicto (lutetium-177 vipivotide tetraxetan)，分別於 2018 年和 2022 年獲得 FDA 許可。Pluvicto 於 2023 年的營收則是 $980M，Lutathera 則是 $605M，比前年增加了 28%，錢景大有可為。

這兩個藥物都是用釋放 β 射線的同位素 lutetium-177，藥物在到達或進入細胞後，釋放出的輻射會破壞癌細胞的 DNA，藉此殺死臨近的癌細胞。Lutathera 針對的是表現在 NET 細胞上的受體 SSTR2 (somatostatin type 2 receptor)，Pluvicto 則是用可以胜肽 vipivotide 來抑制表現在攝護腺癌細胞上的抗原 PSMA (prostate-specific membrane antigen)。

除了 β 射線外，還有 α 射線，它的範圍較小但能量較高，在殺死癌細胞上效果更好。另外，患者在接受 Lutathera 和 Pluvicto 治療後的一個禮拜內須要遠離孕婦和小孩，因為 Lu-177 的半衰期是一個禮拜，而 α 射線穿透的範圍較短，相較之下反而是個優勢。目前有好幾個 α 射線的臨床試驗，最普遍的放射同位素為 actinium-225 (Act-225), lead-212 (Pb-212) 和 astatine-211，像是 Novartis 的攝護腺癌藥物也有出的 Act-225 版本的 225Ac-PSMA-617，正在第一期臨床試驗中。

Bristol Myers Squibb 於去年花 $4.1B 鎂收購的 RayzeBio，它的 RYZ101 用的也是 α 放射的 actinium-225 (Act-225)，同樣是針對 NET 細胞上的受體 SSTR2，主要是用來治療對 Lutathera 沒反應的患者，目前在第三期臨床治療。

Radionuclide antibody conjugate (RAC)

相較於放射性配體共軛物，放射同位素接在抗體上可以在體內維持較久，因為抗體穩定性較強，也因此比較適合接半衰期較長的放射同位素。

截至目前為止，只有兩個 FDA 核准的 RACs：

Zevalin (ibritumomab tiuxetan)：於 2002 年獲得 FDA 許可，放射同位素是用 Iodine-131，抗體是針對 CD20，用於治療表現 CD20 的 non-Hodgkin's lymphoma。

Bexxar (tositumomab and iodine I 131 tositumomab)：於 2003 獲得 FDA 許可，放射同位素是用 Y-90 (Yttriuim-90)，抗體也是針對 CD20，用於治療表現 CD20 的 non-Hodgkin's lymphoma。

不過抗體的優點也是缺點，雖然它較穩定，可以在體內停留的時間較長，但用在放射同位素上就是個缺點，因此較小的胜肽反而比較有利。

生技公司 Y-mAbs 為此開發了一個解法，就是利用雙特異性的 scFv 設計了一個 SADA (Self-Assembling and DisAssembling)，一邊是 anti-GD2，一邊是 anti-DOTA (同位素螯合劑)，然後接一個可以拆開或組合成 tetramer 的蛋白，在他們的 YT 影片裡是說用 P53。治療分成兩個步驟，第一步是先把抗體打進去，組合成 tetramer 的會抓住癌細胞，monomer 則會在血液裡晃一晃就因為體積小排出去，接者再把同位素打進去，這時候抗體的 DOTA 就會抓住同位素，這樣就可以達到精準治療，又不會有 IgG 接抗體後停留在體內太久的問題，他們用來治療實質腫瘤的 GD2-SADA:177Lu-DOTA 目前正在第一期臨床試驗中。

除了用 scFv 外，也有公司選擇用小抗體 VHHs，例如溫哥華的生技新創公司 Abdera 是用 VHH-Fc，他們用來治療對小細胞肺癌(small cell lung cancer )和的為大細胞神經內分泌癌(large cell neuroendocrine carcinoma, LCNEC)的 ABD-147 是針對表現 DLL3 的實質腫瘤，用的同位素為 Act-225，目前正在第一期臨床試驗。

Degrader-Antibody Conjugates (DACs)

抗體可以接藥物外，還可以接 degrader，是指把目標蛋白降解，這個技術稱為 TPD (targeted protein degradation, TPD)，通常都是利用 ubiquitin-proteasome system (UPS)，藉由 E3 ligase 幫目標蛋白標記 ubiquitin (Ub)，使它可以被 proteasome 降解。其方法是用 molecular glue，是可以把 E3 ligase 目標蛋白連結在一起的小分子，使目標蛋白得以被 E3 ligase 標記和降解。

另一個和 molecular glue 很類似的是 Arvinas 開發的 PROTAC (PROteolysis TArgeting Chimera)，它的結構分成三個部分，兩側分別是 E3 ligase 和目標蛋白的配體(ligand)，中間是連結兩側配體的 linker，可以把目標蛋白帶到 E3 ligase 進行標記和降解。

PROTAC 是 2001 年時由耶魯大學的 Dr. Craig Crews 首先發表於 PNAS，之後於 2013 年成立 Arvinas，目前大部分的藥物都還在第一期臨床試驗，不過他們用來治療乳癌的口服藥 Vepdegestrant (ARV-471) 已進入第三期臨床試驗，是針對 ER+ (estrogen receptors)/HER2- 的患者，2011 年時和輝瑞(Pfizer)合作開發和商業化。



PROTAC 和 molecular glue 都可以接到抗體上，抗體針對的是癌細胞表面的抗原，透過抗體和抗原的結合，把 PROTAC 或 molecular glue 帶進細胞，把目標蛋白帶到 E3 ligase 進行標記和降解。

目前在做這個的有和輝瑞合作的 Nurix，不過目前還沒有太多資訊。另一個是 2016 年成立的韓國生技公司 Orum Therapeutics (오름테라퓨틱)，他們目前只有兩個藥物進到第一期臨床試驗，一個是針對 HER2+ 的 ORM-5029 (TPD2-GSPT1)，DACs 透過抗體結合 HER2 進入細胞，之後被降解釋出 molecular glue (SMol007) 把目標蛋白 GSPT1 (translation termination factor) 帶到 E3 ligase 進行標記和降解，導致癌細胞死亡。另一個是用來治療急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML)，抗體的部分是針對 CD33，進入細胞後也是透過降解 GSPT1 殺死癌細胞，這個藥物已於 2023 年年底被 Bristol Myers Squibb (BMS) 收購。

Antibody-Oligonucleotide Conjugates (AOCs)

AOCs 在過去幾年也開始崛起，它是把寡核苷酸(oligonucleotide)和抗體連結，透過抗體運送寡核苷酸進到細胞內。它的連結方法有幾種，包括用化學反應直接連結，或是透過結合親和力(binding affinity)，例如 avadin 和 biotin，也可以用離子相互作用(ionic interactions)。



AOCs 剛開始時是用於免疫染色作為診斷工具，好處是可以用限制酶切掉螢光團(fluorophore)後重複染色而不傷組織細胞。相較於 ADCs 和 RACs，雖然在共軛連結上較為困難，但它的優勢在於可以調控基因表現，目前大多數的研發是著重在 siRNA 和 ASO (anti-sense oligonucleotides)，因此它的效用是看其抑制蛋白表現的程度。另外一個困難點是穩定性(stability)，它在血液中的半衰期只有兩天左右，但和抗體連結在一起後可以增加到五天以上。



目前做 AOCs 的公司有 Avidity Biosciences，他們的 AOC1001 (Del-desiran) 是利用 siRNA 來降低突變的 DMPK (myotonic dystrophy protein kinase) mRNA，用以治療 DM1 (dystrophic myotonic dystrophy type 1)，已進入第三期臨床試驗。

Extracellular vesicles (EVs)-Fc

除了用單一抗體，也可以利用外泌體(Extracellular vesicles, EVs)展示很多抗體。最近瑞典 Karolinska University 發表在 Nature Biomedical Engineering 的一篇研究是把帶有抗 Fc 的蛋白或結構域(domain)基因的載體送進會產生 EV 的細胞裡，例如 Protein A 或 Protein G 等等，使它可以把抗 Fc 的蛋白表現在外泌體外面。接著，把這些表現有抗 Fc 蛋白的外泌體和抗體混合，外泌體外面就會插滿了抗體，而外泌體裡面就可以裝化療藥物。目前還在老鼠實驗階段，但在老鼠身上的效果不錯。

Antibody-Cell Conjugation (ACC)

抗體細胞連結，顧名思義就是把抗體和免疫細胞連結在一起，例如自然殺手細胞(Natural Killer cells, NK cells)或是細胞激素誘導殺手細胞(cytokine induced killer cells, CIK)，算是一種細胞治療，是於 2009 年時由蕭世嘉提出的。ACC 相較於 CAR-T 治療簡單許多，不需要基改，而是直接把抗體接在免疫細胞上。

把抗體接到細胞上有兩種方法：

1. 非天然糖類代謝：細胞吸收非天然醣類後會把要表現在細胞膜的 glycocalyxes 轉變成 phosphonucleotide donors，之後透過 bioorthogonal reactions 把抗體接上去。

2. 酵素反應(chemoenzymatic methods)：利用糖基化酶(glycosylases)去改造細胞表面的 glycocalyxes，然後再把抗體接上去。

目前在做 ACC 的是由蕭世嘉創辦的 Acepodia。


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References

Podcast: 魔術子彈─抗體藥物複合體 Antibody Drug Conjugate (ADC)

K Tsuchikama, Y Anami, SYY Ha et al. Exploring the next generation of antibody–drug conjugates. Nat Rev Clin Oncol (2024) DOI: 10.1038/s41571-023-00850-2

M Senior. Precision radiation opens a new window on cancer therapy. Nat Biotechnol (2024) DOI: 10.1038/s41587-024-02295-z

OPB Wiklander, DR Mamand, DK Mohammad et al. Antibody-displaying extracellular vesicles for targeted cancer therapy. Nature Biomedical Engineering (2024) DOI: 10.1038/s41551-024-01214-6

X Ma, J Jiang, X An et al. Advances in research based on antibody-cell conjugation. Front in Immunol (2023) DOI: 10.3389/fimmu.2023.1310130

Pfizer/BioNtech 的新冠疫苗 -- 關於施打一劑後的研究

這兩篇是關於 Pfizer / BioNTech 疫苗的，其中一篇是以色列的施打結果。大家也知道以色列打疫苗神速，到今年二月中為止已有超過百萬人施打了輝瑞疫苗，在去年十二月到今年二月中期間，他們收集了施打疫苗後的 21 天內，病毒測試為陽性的約五千人的 RT-qPCR 結果。結果顯示在施打第一劑 12-37 天後的病毒量比施打十一天後低很多，也比沒施打疫苗的低惹 2.8 到 4.5 倍。不過這篇比的是平均病毒量，如果可以再細分說打了第一劑後，感染後的最高病毒量是多少(因每個人個情況不一樣，病毒量最高的那一天)，跟沒打疫苗的，感染後的最高病毒量是多少，也許更可以說打了疫苗後，可以使感染後體內病毒不會大量繁殖，病毒量會在一個不會有症狀也無法傳染的範圍。

另一篇則是關於得過新冠病毒後，是不是只打一劑輝瑞疫苗後就夠了，這樣就可以把疫苗發給更多的人。這個研究是南加州的醫學中心做的，參與者的年齡層是 29 歲到 55 歲左右，六成為女性。分析的抗體量為第一劑疫苗前到疫苗後的前三天、第一劑後的一到三週，還有第二劑後的一到三週。要怎麼知道之前是否感染過呢？他們是測體內抗 SARS-CoV-2 N protein 的抗體，因為 Pfizer 只表現 Spike protein，所以不會產生 anti-N protein 的抗體。分析結果顯示，感染過的患者，體內的 anti-N 和 anti-Spike IgG 抗體不管在哪個時間點都比較高，有趣的是他們的 anti-S RBD IgG 只比打過第一劑、沒感染過新冠病毒的人低一點而已。另外，感染過的患者在打了第一劑後的 anti-Spike RBD IgG 和打了兩劑疫苗但沒感染過的人差不多，疫苗但沒感染過的人差不多，中和抗體測試的結果也一樣。

也就是說：
1. 感染過新冠病毒的抗體量 vs. 沒感染過，但打了一劑疫苗的抗體量 --> 前者稍微低一點
2. 感染過新冠病毒 + 打了一劑疫苗的抗體量 vs. 沒感染過，但打兩劑疫苗的抗體量 --> 沒顯著差異
3. 感染過新冠病毒 +/- 疫苗 vs. 沒感染過 +/- 疫苗 --> 前者比後者多

另外，感染過新冠病毒的人在打了第一劑後的疫苗反應(畏寒和發燒)比沒感染過的頻率高，而沒感染過的人，第二劑的疫苗反應(頭痛、暈眩)比第一劑高。

這個結果顯示，得過新冠病毒的人打一劑就夠了。不過，這篇研究沒特別說感染過的人之多久前感染的，最短可能是一週前得，最長 .... 不知道，不過如果有人是兩個月前染感的的話，也就是說兩劑之間可以隔兩個月還有效？分析一下患者得過的時間點，應該可以推出兩劑之間最長可以隔多久。



References:

M Levine-Tiefenbrun et al, Initial report of decreased SARS-CoV-2 viral load after inoculation with the BNT162b2 vaccine. Nature Medicine (2021)

JE Ebinger et al, Antibody responses to the BNT162b2 mRNA vaccine in individuals previously infected with SARS-CoV-2. Nature Medicine (2021)

又一篇新冠病毒的小抗體研究

這集的標題雖然是駱馬的小抗體(nanobodies)，但前半個小時是討論中國的 CoronaVac，同時他們也收到很多 email 詢問為什麼美國不也做 inactivated virus vaccine。



第一個用病毒做的疫苗是 Edward Jenner 的天花疫苗(smallpox, 1798)，為 inactivated Vaccinia virus。第二個 Pasteur 的狂犬病疫苗(rabies, 1885)，再來是黃熱症疫苗(yellow fever, 1935)和流感疫苗(influenza, 1936) [1]，流感疫苗剛開始是給軍方用，因為在第一次世界大戰時美軍人力因流感而有所損失 [2]。

至於為什麼美國不用病毒做新冠病毒的疫苗呢？他們解釋是美國已經研發其他種類的疫苗很久了，包括 mRNA 疫苗和 subunit 疫苗，所以可以直接拿來用，加上大藥廠已經砸很多錢在研發新型疫苗，因此拿來研發新冠病毒疫苗相對來講反而是比較簡單的。另一個可能原因是用病毒做疫苗需要用到 BSL3 的實驗室，不方便大量生產。

關於中國的 CoronaVac，他們提到 inactivated virus vaccine 通常是用 UV 或福馬林(formalin)去 inactivate viruses，但中國的這支疫苗是用 β-propiolactone (C3H4O2)，雖然它也被用來 inactivate viruses，不過它會和蛋白質反應，可能會改變蛋白結構，而且最近有幾篇研究顯示 β-propiolactone 會使 Spike 的 S1 脫離 [3, 4]，而可讓免疫系統產生中和抗體的 RBD 就在 S1，如果新冠病毒疫苗少惹 S1，那疫苗效用還剩多少？另外，如果要做 inactivated viruses，也會先評估用來 inactivate 的物質會不會改變病毒結構，是否每個 batch 的品質都穩定一致。之前的疫苗之所以用 inactivated viruses，是因為當時那個年代的技術就只能用 inactivated viruses，並不是因為它比較安全，如今的科技使疫苗不再局限於用 inactivated viruses。

相關文章：近期和新冠病毒抗體相關的研究

裡面還有一段對話滿好笑的(30:25)，CoronaVac 的臨床實驗是 Phase I/II 合在一起，通常是 Phase I 安全測試過了以後，換一批測試者做 Phase II。SinoVac 是一二期一起做，第一期只有七天，七天後如果沒出現問題就進入 Phase II [5]。然後其中一位就說，因為是用 inactivated viruses，如果真的有問題的話，七天後試驗者可能就掰掰了，既然七天後沒人死，就表示疫苗算是安全的。XD

(33:50) "... that the Chinese government enlisted army personnel for at least one of the phases for their trial and I thought we were critical of that for a while, but I think that's no longer a criticism."

".... yeah, we got a lot of pushback from people in China who said this is often done and it is often done, but they said it was licensed and it was actually a Phase II trial, so they should have just said it's a Phase III trial, right? instead of saying it was licensed for you."

"I think the issue there was is it okay to do that in troops, ..... I think I pointed out the U.S. can't exactly get on a moral high horse about what's been done."

還有一段莫名戳中我的笑點，是討論到 Phase III 是在中國、巴西和土耳其做的，最近還加了印尼。

(44:10) "I don't think they had enough cases in China to do the Phase III, right?"

"I think because at that point the pandemic was really under control such through lockdowns in China, they were actually having a hard time getting cases for their clinical trials, but uhh unfortunately, plenty of other countries had plenty of cases."

之後駱馬小抗體的部分是討論德國研究團隊於上個月發表在 Science 的研究。之前有提過駱馬除了正常的 IgG，還有一種只有 heavy chain 的抗體 HCAb，以及釣出小抗體的噬菌體展示(phage display)。

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在這篇之前，德州大學(U Texas)也在去年發表過他們抗 SARS 的小抗體，他們是把 SARS Spike 打入駱馬體內，然後釣出小抗體，經過 cyro-EM 分析發現效果最好的小抗體 VHH-72 是把 Spike RBD 固定在某個 conformation，使它無法動。他們把這個小抗體測試在假新冠病毒上(pseudovirus)，發現它也可以抑制新冠病毒。

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德國的這個研究則是把新冠病毒的 Spike RBD 和用福馬林去活性過的新冠病毒打入駱馬後釣出小抗體，然後測試這些小抗體的中和效用(neutralizing activity)，發現其中一株中和效果最強的小抗體 VHH E 的 IC50 可到 60 nM [6]。VHH E 和其他小抗體不太一樣，它的 CDR3 特別長，雖然和 ACE2 結合的點和之前發現的小抗體 CC12.3 和 H11-D4 相同，但方向不一樣。之前研究發現，Spike RBD trimer 通常處在一個 up & down conformation 平衡的一個狀態，較常發生的狀態是沒有或三個中只有一個 RBD 處於 up conformation。雖然三個 RBD 都為 up conformation 的狀態很少見，但只有 up conformation 才可以和 ACE2 結合，只是不知道需要幾個 RBD 為 up conformation。

他們用 cryo-EM 分析 VHH E 和 ACE2 結合的狀態，發現和 VHH E 結合的大多是三個 RBD 都為 up conformation，並且各和一個 VHH E 結合，顯示 VHH E 會把 RBD 固定在 3-up conformation，而且一旦結合，RBD 就無法變回 down conformation。不免俗的，也要試試把兩、三個 VHH 連在一起看看效果會不會更好，當然也是用常用的 (GGGS)3 linker，結果發現 IC50 可以降到 pM range (930 pM for VHH EE, 520 pM for VHH EEE)。這篇研究和其他不同的地方是他們還有測試哪些突變會逃過 VHH 的中和作用，有趣的是如果某個突變可以逃過某個 VHH，大多的情況是它會對其他 VHH 更敏感，所以如果把兩個不同的 VHH 結合在一起，便沒有突變可以逃過 VHH。相反的，雖然 VHH EEE 有很強的中和作用，single mutantion 就可以讓病毒逃掉。



References:

1. S Plotkin, History of vaccination. PNAS (2014)

2. US CDC / Influenza Historic Timeline

3. Y Cai et al, Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science (2020)

4. AV Letarov et al, Free SARS-CoV-2 Spike Protein S1 Particles May Play a Role in the Pathogenesis of COVID-19 Infection. Biochemistry (2020)

5. Z Wu et al, Safety, tolerability, and immunogenicity of an inactivated SARS-CoV-2 vaccine (CoronaVac) in healthy adults aged 60 years and older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1/2 clinical trial. The Lancet (2021)

6. P Koenig et al, Structure-guided multivalent nanobodies block SARS-CoV-2 infection and suppress mutational escape. Science (2021)

新冠病毒患者的免疫力可維持超過半年

根據感冒冠狀病毒和流感病毒的經驗，大多數人都認為人類體內對抗新冠病毒的免疫保護可能很短，大概感染後半年左右抗體就會降到測不到，尤其是無症狀和輕症的患者可能感染後抗體量本來就不高，不過到底可以維持多久呢？這個資訊可以讓我們預測疫苗提供的免疫保護持久力。從疫情開始至今也一年了，各國的資料也收集得差不多了吧。XD

La Jolla Institute 的研究團隊之前已經發表了兩篇相關研究，他們先是分析健康個體和 COVID-19 康復患者的血清，發現所有康復患者都有可辨識新冠病毒 Spike protein 的 CD4+ (helper) T cells，T cells 的反應程度和 IgG 量成正向相關，七成的康復患者有可對抗新冠病毒的 CD8+ (killer) T cells，而且反應強烈。康復患者除了帶有可辨識 Spike protein 的免疫細胞外，他們也帶有可辨識其他病毒蛋白的 T cells，像是 M protein 和 N protein。另外，他們也分析了疫情前採集到的血清，同樣帶有可辨識新冠病毒的 T cells。

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「他們檢測了於 2015-2018 年採樣到、沒有感染過新冠病毒的血液檢體，結果發現其中有 40% - 60% 含有可以辨識新冠病毒的 helper T cells，不過和康復患者不同的是他們的 T cells 反應雖然也是以 Spike 為主，但幾乎沒有對 N protein 或 M protein 有反應的 T cells，次主要的是 NSPs (non-structural proteins)。而之所以會有這些 T cells，可能是因為這些人之前感染過其他種類的冠狀病毒，cross-reactivity 使他們體內也有能辨識新冠病毒的 T cells。研究者們認為這是之前感染其他四種引起感冒症狀的冠狀病毒時產生的，因為這些血液檢體裡都有針對至少其中三種常見冠狀病毒的 T cells，血清檢測也顯示全部都有 HCoV-OC43 和 HCoV-NL43 Spike protein 的 IgG 抗體，表示大多數人都感染過常見的四種感冒冠狀病毒，而且至少感染過超過三種，而這也可能是為什麼大部分的人感染到新冠病毒後都只是輕症或無症狀。」

註：常見的四種感冒冠狀病毒為 NL63, 229E, OC43 和 HKU1。

在之後發表在 Science 研究裡，他們則是分析是哪些病毒片段使 CD4+ T cells 有 cross-reactivity，讓未感染個體的免疫系統能夠對新冠病毒有反應。

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在之前的研究裡，他們以分析 CD4+ T cells 的反應為主，而他們這個月發表的研究，三種 adaptive immunity 都分析了 -- CD4+ (helper) T cells, CD8+ (killer) T cells, memory B cells。在他們分析的近兩百位患者包括了無症狀患者、輕症、中度和重症患者，不過大多數(93%)為不需住院的輕症患者，年齡為 19 歲到 81 歲。其中有些患者的提供不同時期的血清檢體，間隔大約幾個月採集一次，其中有 63 個檢體是感染後超過半年後採集的。

他們分析了血清內的抗體後，發現九成患者的 anti-Spike IgG 可以六到八個月都穩定存在著，anti-nucleocapsid IgG 也差不多持續八個月穩定存在著，中和抗體主要為 anti-Spike RBD IgG，90% 患者的中和抗體也是穩定存在六到八個月。產生抗 Spike 抗體的 memory B cells 比症狀出現一個月後更多，倒是 CD4+ (helper) 和 CD8+ (killer) T cells 減少，存活週期(half-life)約為三到五個月。那生產抗體的 memory B cells 呢？他們發現患者體內針對新冠病毒的 memory B cells 在症狀出現後的 120 天內持續增加，之後呈現一個 plateau 的狀態。針對 Spike 的 memory B cells 中有約 10%-30% 是特別針對 Spike RBD。RBD-specific memory B cells 的狀況也差不多，不過可以早在症狀出現後十六天左右就開始持續增加，並且持續增加四到五個月。未感染者體內則幾乎沒有 Spike-specific memory B cells。既然有 anti-N protein 的抗體，當然就會有生產它的 nucleocapsid-specific memory B cells，也同樣是症狀出現後的四到五個月內持續穩定增加。

再來是 memory T cells。大約 70% 的患者在症狀出現後一個月(20-50 days)開始測得到針對新冠病毒的 memory CD8+ T cells，目標蛋白有 Spike, Membrane (M), Nucleocapsid (N) 和 ORF3a，其中約有 50% 患者體內的 CD8+ T cells 在六個月後仍穩定存在著，在感染後一個月，約有 93% 的患者可以測得到針對新冠病毒的 CD4+ T cells，目標蛋白除了 Spike, M, N, ORF3a 外，還有 nsp3，在六個月後體內 CD4+ T cells 仍穩定存在的患者有 92%。Spike-specific (CD4+ / CD8+) T cells 的穩定存在情況和針對新冠病毒的 T cells 類似，同樣可以穩定存在六個月以上。

最後，他們比較了免疫系統裡的其中五樣指標，看看他們維持多久。他們比較的五樣為 RBD IgG, RBD memory B cells, Spike IgA, total SARS-CoV-2-specific CD8+ T cells 和 total SARS-CoV-2-specific CD4+ T cells，因為這五樣在免疫保護力中扮演著重要角色。他們發現，大多數人(64%)在症狀出現後一到兩個月內，這五樣都穩定存在著，但在五到八個月後，這五樣在體內仍穩定存在的只剩 43%。不過呢，雖然五樣都降的人站了以半以上，但有 95% 的人在五到八個月後，至少有三樣仍穩定存在著，也就是說抗新冠病毒的免疫力並沒有之前以為的短，至少能夠維持半年以上，算是個好消息。

La Jolla 的研究已輕症為主，去年年底英國有個研究則是針對感染後無症狀或輕微症狀的醫護人員。倫敦醫院從去年三月底疫情爆發初期就開始每週驗 PCR 和血清，檢測和分析他們在英國封城後十六到十八週的 T cells 和抗體反應。

他們分析了倫敦醫院醫護人員的 T cells 和抗體，發現他們的 T cells 對新冠病毒 Spike 有反應的比例不高，只有 49%，反而對 N protein (neucleocapsid) 有反應的比例高達 85%。相較之下，疫情前的控制組對 Spike 和 N protein 有反應的比例為 29% 和 12%。不意外的，和 La Jolla 研究團隊的結果類似，未感染者血清也測得到對新冠病毒有反應的 T cells，不過到底是新冠病毒的哪個蛋白片段和感冒冠狀病毒有 cross-reactivity，是否和 La Jolla 研究團隊的結果一樣，則需要進一步的分析。

那抗體呢？有 97% 有抗 S1 IgG 或抗 N protein IgG/IgM，而且有 89% 的抗體是有抑制病毒作用的中和抗體，不過無症狀或輕微症狀患者的抗體量比症狀明顯的患者低。之前有研究顯示，新冠病毒患者的抗體量降的很快，可以在幾週內就降到測不到，不過有的研究卻顯示可以維持幾個月，而在這個研究顯示，是不管是無症狀、輕微症狀還是症狀明顯的患者，他們的中和抗體量在這 16 到 18 週中都維持固定的量，並沒有減低。另外，有趣的是五十歲以上的醫護人員中，有八成的中和抗體量很高(IC50 >200)[註]；相對的，24 歲到 49 歲有高中和抗體量的比例為 58%。

註：中和抗體量 IC50 = 0-49 為測不到，50-199 為低，200+ 為高。

那抗體和 T cell 反應是否有關聯，是否有抗新冠病毒 T cell 反應的人就有抗體，或是抗體量比較高呢？似乎關沒有絕對的關聯性，而這也和之前的研究結果類似，有不少人沒抗新冠病毒的抗體，但卻帶有對新冠病毒有反應的 T cells。

結論：目前看來，新冠病毒患者體內的抗體、生產抗體的 B cells，和前線對抗感染的 T cells 都可穩定存在五到八個月。


Publications:

CJ Reynolds et al, Discordant neutralizing antibody and T cell responses in asymptomatic and mild SARS-CoV-2 infection. Science (2020)

JM Dan et al, mmunological memory to SARS-CoV-2 assessed for up to 8 months after infection. Science (2021)

RJ Cox & KA Brokstad, Not just antibodies: B cells and T cells mediate immunity to COVID-19. Nature Reviews Immunology (2020)

未感染新冠病毒的人也有抗體

之前已有好幾篇研究顯示，未感染者體內有抗新冠病毒的免疫 T cells，有可能是因為和其他的冠狀病毒有 cross-reactivity。這篇研究用 flow cytometry 分析了未感染者和患者抗冠狀病毒 Spike protein 的三種抗體 IgA, IgM 和 IgG，想知道新冠病毒和感冒冠狀病毒之間 cross-reactivity 程度有多少。

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冠狀病毒的 Spike protein 分成 S1 和 S2 兩個 domains，S2 在冠狀病毒間的相似度比較高，叫有可能是 cross-reactivity 的來源。他們的 competitive binding assays 結果顯示，未感染者和患者的血清抗體間的 cross-reactivity 主要在於 S2。跟未感染者的抗體相較，患者血清內的抗體免感度(sensitivity)和專一性(specificity)比較高。

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這種 cross-reactivity 有多普及呢？他們分析了疫情前 2011 年到 2019 年時收集的血清，和新冠病毒患者的血清做比較。結果顯示冠狀病毒間的 cross-reactivity 在年輕族群中比較普遍，2011 年到 2018 年間，十六歲以下的健康個體約有 50% 的血清內有可辨識新冠病毒 Spike 的 IgG，17 - 25 歲之間只有 2%；2019 年採集的中年族群的血清，約有 8% 有低量的、可辨識新冠病毒 Spike 的 IgG。例外，新冠病毒患者血清內同時有可辨識 Spike 的 IgG, IgM 和 IgA，而未感染者的則主要為 IgG，沒有 IgM 和 IgA，重要的是未感染者血清內的抗體具有中和新冠病毒的效力。



Paper:

KW Ng et al, Preexisting and de novo humoral immunity to SARS-CoV-2 in humans. Science (2020)

感染過冠狀病毒是否就免疫了呢？

目前市面上有很多血清檢測的 kits，而我們最想用血清檢測回答的問題有：

1. 康復患者血清內的抗體量是多少？
2. 多少才有保護作用，使人不被二次感染？（這也算是疫苗效用的一個指標，如果抗體無法避免二次感染，那疫苗 .....？）
3. 無症狀患者、輕症患者和重症患者體內的抗體量是都一樣的嗎？是否所有感染者都能產生大量的抗體，使其不被二次感染？還是重症患者的抗體比較多？
4. 體內抗體能維持多久，有效避免二次感染的抗體量會維持多久？

上個月刊在 medRxiv 的這篇研[1]究分析了目前關於冠狀病毒的相關研究，想要試著回答上面的問題，但因為新冠病毒是這幾個月的事，所以 SARS, MERS 和其他造成感冒的冠狀病毒的研究比較多。

註：常見的、會引起感冒症狀的人類冠狀病毒有 229E (alphacoronavirus), NL63 (alphacoronavirus), OC43 (betacoronavirus), HKU1 (betacoronavirus)。

1. 造成感冒的冠狀病毒，例如 229E，康復患者體內的抗體大概可以維持一年使人不被二次感染，或是再次感染的症狀也是很輕微。

2. SARS 康復患者體內的抗體在感染後第四個月達到高峰，而且則能維持到三年左右，使其不被二次感染。（不過研究裡檢測的最後時間點是感染後第三年，所以只知道至少三年，之後就不知道了。）

3. MERS 輕症換者可在症狀發生後的半年和一年的時間點測到 IgG，重症患者的時間點也差不多。

4. 其中一篇研究[2]裡是測試冠狀病毒 229E 的康復患者是否會二次感染。當時參與研究的志願者中，只有 11% 體內沒有抗體，顯示在當時的年代(1961-1977)，這株冠狀病毒非常普及。當一年後再讓這些志願者感染這株病毒，看看抗體是否還有保護作用，發現抗體對同株的病毒有保護作用，但對相近病毒(也就是同樣是 alphacoronavirus，但是不同病毒株)只有部分的保護作用。後來有篇研究[3]顯示，如果體內抗體量不夠的話，229E 的康復患者可被二次感染。參與此研究的志願者在感染病毒一週後，IgG 開始上升，然後在十四天時達到高峰，一年後再測的時候抗體量仍然比感染前高，當再一次接受感染挑戰的時候，雖然約有一半的人被二次感染，但都沒有症狀。另外，第一次感染的時候，在前五到六天都測得到病毒，而二次感染時，只有前兩天測得到病毒，顯示病毒被清掉的很快。（不知道這是不是這次有很多無症狀患者的原因，如果血清檢測可以順便檢驗其他的 betacoronaviruses 的話可能可以知道。）

5. 有些冠狀病毒抗體有 cross-reactivity，像是 229E 的抗體可以使患者約一年不被同種的冠狀感染，例如同是 alphacoronavirus 的 NL63。


Figure / Quantitative and binary readouts in serology assays. (Krammer & Simon, Science 2020)

雖說目前有很多血清抗體檢測，但是要知道新冠病毒的康復患者是否能夠避免二次感染，需要可以測量體內抗體量的檢測，而這需要做 ELISA，比較耗時也比較耗人力，需要在實驗室執行。LFA 之類的快篩只能知道有或沒有，而且需要夠高的 sensitivity 和 specificity，才不會有太多的 false positive 或 false negative，主要是用來了解病毒感染的盛行率(sero-pervalence)。



Article:

Science / Serology assays to manage COVID-19 (May 2020)


References:

1. AT Huang et al, A systematic review of antibody mediated immunity to coronaviruses: antibody kinetics, correlates of protection, and association of antibody responses with severity of disease. medRxiv (2020)

2. SE Reed, The behaviour of recent isolates of human respiratory coronavirus in vitro and in volunteers: evidence of heterogeneity among 229E-related strains. J Med Virology (1984)

3. KA Callow et al, The time course of the immune response to experimental coronavirus infection of man. Epidemiology & Infection (1990)

從駱馬體內得到的新冠病毒小抗體

哎呀呀，已經有人做了啊。這篇的研究團隊是之前做 Spike protein Cyro-EM 的那個，原來他們也有做駱馬(llama)的小抗體研究啊。

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如果有看過我之前關於小抗體那篇的，就知道駱馬和鯊魚除了有普通的 IgG 之外，還有一種只有 heavy chain 的小抗體 HCAbs (heavy chain antibodies)，如果只取它的 Fv (variable region)，體積會更小，稱為 VHH 或是 nanobodies (Nbs)。這種小抗體要顧慮的地方比傳統 IgG 要少一些，例如不用考慮是否醣化(glycosylation)，加上也較容易生產製造，所以近來也引起關注，可望作為另一種型態的抗體藥。

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根據文中所述，他們自 2016 年起就用駱馬研發對抗 SARS 和 MARS 的小抗體。駱馬被先後打入 SARS 和 MERS 的 Spike protein 後體內會產上對抗 Spike protein 的抗體，他們在打入抗原的六週後取出駱馬的淋巴球，然後再用噬菌體展示(phage display)從中釣出可以和 Spike protein 結合的小抗體。他們從從駱馬淋巴球裡抓到七個 MERS 的小抗體和五個 SARS 的小抗體，得到了小抗體的基因序列後，便在酵母菌裡大量表現，然在再用 ELISA 確認它是否真的能夠和病毒結合。經過試驗發現其中一個 VHH 可以中和 SARS，為 VHH-72，並且和 MERS 的 S protein 沒有 cross-reactivity。

註 1：抗原(antigen)對免疫系統來講就是外來物，因此可以是病毒或細菌，免疫系統在外來物入侵後即會產生抗體(antibody)對抗外來物。

註 2：一隻駱馬可以被打入五種抗原，之後在用 phage display 把分別的小抗體釣出來，想更瞭解細節的可參考之前的《 Phage display 和小抗體製造 》這篇。

接著，他們想測試這些 VHH 是否可以抑制病毒，於是他們改造了基改過無害的 lentivirus VSV，讓它們在表面表現 S protein，假裝是 SARS，然後看看這些假 SARS 病毒是否能夠進入細胞，結果顯示和假 SARS 或假 MERS 結合力很強的 VHH 可以抑制病毒，結合力若的則沒有抑制的效果，其中以 VHH-72 的效果最好，9 nM 就可以達到抑制的效果。另外，VHH-72 雖然和 SARS S protein RBD 的結合力很強，但是 ELISA 的結果顯示它對 SARS S protein NTD (N-terminal domain) 沒有反應，表示 VHH-72 是透過和 RBD 結合來抑制病毒。

這個研究裡我比較訝異的是他們也分析了小抗體和病毒結合的 crystal structure，發現 VHH 抑制病毒的機制應該是把 Spike 的 RBD 固定在某個 conformation，使它不能動。VHH-72 是透過其 CDR2 和 CDR3 和病毒結合，但結合點和 ACE2 似乎不同，和 ACE2 競爭的不是 CDR2 或 CDR3，而是比較遠的 FR (framework region)。


Figure / The Crystal Structure of SARS VHH-72 Bound to the SARS-CoV-1 RBD (Wrapp et al, Cell 2020)

因為新冠病毒的 Spike protein 和 SARS 的很像，所以他們想知道 VHH-72 是否也可以抑制 SARS-CoV-2 的感染。他們發現 VHH-72 也會和新冠病毒的 S protein RBD 結合，但是 binding affinity 比較低。他們的 crystal structure 分析結果顯示 VHH-72 是和 SARS S RBD 的 R426 接合，而這個氨基酸在 SARS-CoV-2 則是 N439，這可能是造成 binding affinity 的原因。為了增強 binding affinity，他們試了兩種方法：一是用 (GGGS)3 linker 把兩個 VHH-72 尾接頭的連在一起(VHH-72-VHH-72)，一是在它後面接一個 IgG Fc (VHH-72-Fc)。ELISA 測試的結果顯示，這兩種都會會 SARS S 和 SARS-CoV-2 S 結合，並且細胞實驗顯示 VHH-72-Fc 可以抑制假 SARS 和假 SARS-CoV-2。

有意思的是 VHH-72 在病毒 S protein 的結合點似乎和之前發表過的抗體不同，倒是和 CR3022 類似，不過 CR3022 並無法抑制 SARS-CoV-2。

相關文章：近期和新冠病毒抗體相關的研究

哦，另外還有一個重要的點，就是這個小抗體可以在動物細胞裡大量表現，別以為這沒什麼，你如果遇過那種在三種細菌株裡都表現不出來，要不就表現出來但是不 soluble 的 VHH 就知道苦了。（現在每天都在和 phage display 還有 VHH 奮戰的苦主 QQ）

其實這篇研究的另一半是 MERS 和它的 VHH，有興趣的人可以看看。



Article:

UT NEWS / Antibodies from Llamas Could Help in Fight Against COVID-19 (Apr 2020)

TN / Llama Antibodies Could Help Fight Against COVID-19 (May 2020)


Paper:

Wrapp et al, Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-Domain Camelid Antibodies. Cell (2020)

血清檢測｜受新冠病毒感染人口到底有多少？

最近這篇研究滿多人在傳的(not peer-reviewd)，就是美國加州在四月初檢測了約 3300 位透過臉書廣告徵來的 Santa Clara 的居民，發現每 66 位就有一位曾感染過 SARS-CoV-2，由此數據估算出兩百萬居民中大概有 48000 - 82000 位居民感染過病毒，比官方檢測出的一千位多了約 50 倍以上。（如果取中間值算，假設是 65,000 位居民已感染過，那就是大約 3.25% 的盛行率。）除此之外，德國在月初發表的血清檢測也顯示相似的結果，七人中有一人感染過新冠病毒，和 qPCR 交叉檢測的結果，估約整個城市的感染率為 15%，不過德國的病毒專家說，這麼高可能是因為二月的時候，城中有一個慶祝活動。

註：盛行率為 prevalence，為感染人口除以總人口數，分母不是檢驗人口。

雖說這個血清檢測的結果顯示很多人已感染過，相對來講也就是把致死率(infection fatality rate, IFR)的分母變大了，以 Santa Clara 的例子來說，這表示 48000 - 82000 中的死亡人數為約一百人，等於是 0.1% - 0.2%。不過，血清檢測要注意的是偽陽性(false positive)和偽陰性(false negative)的問題，如果不夠 specific，很可能很多是 false positive，也就是說其實感染人數並沒那麼多；如果不夠 sensitive，則有可能出現很多 false negative。

參與 Santa Clara 這個研究的學者說，他們同時也測試了這個 kit (Premier Biotech, Minnespolis, MN) 的 sensitivity 和 specificity，他們先檢測了已知的 85 個確診案例和 371 個陰性案例，結果顯示有兩個 false positives。他們另外也用在地居民做測試，檢測了已在 Stanford Hospital 用 qPCR 驗過的 37 陽性案例和 30 位陰性案例，交叉比對的果顯示只有 68% 的陽性案例被測到，所有陰性則為 true negative。兩者合併的估算下，這個 kit 的 sensitivity 大約是 80.3%，specificity 約為 99.5%。用調整過的 sensitivity 和 specificity 去估算的結果顯示 Santa Clara 的盛行率(seroprevalence)大約介於 2.49% - 4.16%，也就是說整個城市約有 48,000 - 81,000 已受過感染，是官方確診數的五十倍左右。



News:

Nature / Antibody tests suggest that coronavirus infections vastly exceed official counts (April 2020)


Paper:

E Bendavid et al, COVID-19 Antibody Seroprevalence in Santa Clara County, California. medRxiv (2020)

近期和新冠病毒抗體相關的研究

可能現在大家都知道 SARS 和 SARS-CoV-2 都是利用自身的 spike protein (S protein) 和人類細胞表面的 ACE2 結合而進入細胞的，因此阻斷 S protein 和 ACE2 的結合變成目前藥物研發的主要標靶，最近好幾篇研究都是關於用抗體去達到這個目的。

SARS-CoV-2 S protein 位於病毒的表面，是個醣化蛋白(glycoprotein)，會三個組成一體(trimer)。S protein 本身又大致分成三個 domains: N-terminal S1, S2 & C-terminal TM (transmembrane) domain，S1 和 S2 之間有個 furin cleavage site，S1 裡包含了 RBD (receptor-binding domain)，負責和 ACE2 結合，結合了之後 S1/S2 會被切開露出 S2，CoVs 的 S2 會進一步在 S2' site 再切割一次，這個切割會露出 S2 的 fusion peptide，可以讓病毒和細胞膜結合，使其進入細胞內。


Figure / Structure of 2019-nCoV S in the prefusion conformation (Wrapp et al, Science 2020)

Walls et al 發表在 Cell 的研究顯示 SARS-CoV-2 和 ACE 結合的 affinity 和 SARS 的差不多，他們也發現和 SARS不同的是 SARS-CoV-2 有個 furin cleavage site，SARS 的是一個 arginine (R)，SARS-CoV-2 則是 RRAR。SARS S protein 的 S1/S2 cleavage site 可以被細胞內蛋白酶 CatB/L (cathepsins B/L, cysteine protease) 和 TMPRESS2 (serine protease) 切割， 因此 Hoffmann et al 他們也測試了這兩個蛋白酶，看看他們是否也能切割 SARS-CoV-2 的 S protein，結果顯示除了 furin protease，SARS-CoV-2 也用 TMPRSS2，CatB/L 則是可有可無。另外，臨床使用的 serine protease inhibitor camostate mysylate，同時也是 TMPRSS2 inhibitor，也顯示可以抑制 SARS-CoV-2 進入細胞。如果和 CatB/L inhibitor E-64d 一起使用，則可以完全阻止病毒感染，在沒有 TMPRSS2 的情況下，SARS-CoV-2 也可以用 CatB/L。

Hoffmann et al 除了發現 SARS 和 SARS-CoV-2 都是透過 ACE2 進入細胞，而且帶有 ACE2 抗體的血清可以阻止這兩個病毒進入細胞外，也發現從 SARS 康復患者體內取出 anti-SARS 的抗體是 anti-S antibodies。他們取了三位 SARS 康復患者的血清測試，發現可以降低 SARS-CoV-2 感染，雖然效用比 SARS 較低。不過，他們把 SARS S1 打入兔子體內後產生的抗體可以有效抑制 SARS 和 SARS-CoV-2 感染細胞。另外，Walls et al 他們的結構研究顯示 SARS 和 SARS-CoV-2 的 S proteins 非常相似，SARS 的抗體很可能會和 SARS-CoV-2 有 cross-reactivity 而可以也抑制 SARS-CoV-2，於是他們把 SARS- S 打入老鼠體內，然後測試其產生的抗體是否能抑制 SARS-CoV-2，結果發現可以。由以上看來，對抗 SARS 的抗體或是疫苗可能對現在的 SARS-CoV-2 也多少有某種程度的效用。

不過，有趣的是之前 Cryo-EM 的那篇試了三個 SARS 的 anti-S RBD 的抗體(S230, m396, 80R)，想說竟然結構那麼像，不知道有沒有 cross-reactivity，沒想到那三個抗體都無法辨識 SARS-CoV-2。這個結果和 Walls et al 還有 Hoffmann et al 的不同的原因可能是因為這兩篇的研究產生的 polyclonal antibodies 可能抓到的是 S protein 的 S2 domain，而這篇用的是 anti-RBD (S1) antibodies。

相關文章：關於武漢病毒(SARS-CoV-2) Cryo-EM 那篇論文的閒聊

這個月，Scripps Research 的團隊在 Science 發表了 SARS 抗體和 SARS-CoV-2 結合的研究，他們發現 SARS 和新冠病毒和抗體的結合點幾乎一樣，也許是為什麼 SARS 抗體和 SARS-CoV-2 會有 cross-reactivity 的原因。他們研究的一個 SARS 的抗體 CR3022 是荷蘭的一家藥廠 Crucell Holland B.V. 於 2016 年從 SARS 康復患者體內釣出的，年初的時候有研究發現 CR3022 和新冠病毒有 cross-reactivity，於是 Scripps Dr. Wilson 的研究團段想知道這個抗體是怎麼和 SARS-CoV-2 結合的，結果發現這個抗體和 SARS 及 SARS-CoV-2 S protein RBD 結合的點非常相似。有趣的是病毒和 CR3022 的這個結合點和它和 ACE2 的結合點有些距離，因此不存在競爭的關係。另外，這個結合點在平常的狀態並不在病毒的表面，而是當 RBD 處於某種狀態下才會出現在表面的地方。在細胞實驗中，CR3022 雖然可中和 SARS，但卻無法中和 SARS-CoV-2。因為有太多迷點，所以目前還不了解和 CR3022 的這個結合點在病毒感染的真正功能是什麼，不過至少知道這個抗體是用不同的機制來抑制病毒感染。



Articles:

TN / Clues to SARS-CoV-2 Vulnerability Emerge (April 2020)


Publications:

AC Walls et al, Structure, Function, and Antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein. Cell (2020)

M Hoffmann et al, SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell (2020)

M Yuan et al, A highly conserved cryptic epitope in the receptor-binding domains of SARS-CoV-2 and SARS-CoV. Science (2020)

D Wrapp et al, Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science (2020)

新冠病毒(SARS-CoV-2)檢測 -- qPCR 和抗體檢測（續）

有看中研院那篇的就知道，目前檢測新冠病毒的方法有三：

1. qPCR：檢測體內是否有病毒 RNA，知道 primers 就可以用來檢測，不需要另外研發，相對準確，敏感度高(sensitivity)，但需四到六小時，包含運送檢體時間等等的 turnaround time 至少要一天。不過目前 UCSF, Mammoth 和加州 Public Health 部門合作研發的 SARS-CoV-2 DETECTR 利用 CRISPR 技術似乎可以快速檢測，加上 RNA extraction 的時間只要 45 分鐘。

2. 用抗體檢測體內抗原(也就是病毒)：跟 qPCR 比起來準確度較低(需要注意有沒有 cross-reactivity)，也需要時間研發，但是檢驗方法簡單，速度也快，turnaround time 約二十分鐘到一小時。（下圖的第三種 sandwich assay）

3. 用抗原(也就是病毒蛋白)檢測體內是否有抗體：研發時間沒上面那個長，比較簡單，檢驗方法也同樣簡單和快速，但需要等到症狀出現後，病患體內產生抗體才測得到，通常是用來追蹤是否曾經感染過。（下圖的第一種 direct assay 或第二種 indirect assay）

相關文章：新冠病毒(SARS-CoV-2)的檢測 -- qPCR 和抗體


Figure / Diagram of common ELISA formats (direct vs. sandwich assays)(Thermo Fisher)

註：抗體檢測的原理跟 ELISA 相同，可以固定抗原(antigen)去測體內抗體(antibody)，如上圖的第一種和第二種，這種只要有抗原就可以測，或是固定抗體去測體內是否有抗原，如上圖中的第三種，這種比較需要花時間先去研發出好的抗體。

相關文章：簡單檢測新冠病毒抗體

Nature 的這篇介紹了幾個正在研發的抗體檢測，第一個介紹的就是中研院楊老師的那個 LFIA！和大多數用 S (spike) protein 做抗原的抗體檢測不同的是中研院用的是 N (nucleocapsid) protein，其中一株抗體和 SARS 還有其他種冠狀病毒的 spike protein 沒有 cross-reactivity。不過看了這篇才知道，中研院的抗體是用 AI 去模擬 Ag-Ab interactions 後製造出來人造抗體 libraries，然後再用 phage display 去抓出抗體，而不是用動物去製造抗體，或是從康復患者體內釣出來，因此省掉了兩個月的時間。（也就是說中研院有抗體的基因序列，可以大量生產，也許可以測試是否能用於治療，不過我覺得 anti-spike 的抗體應該會比較有效果。）

相關文章：Phage display 和小抗體製造


Figure / Schematic representation of a LFIA device (Banerjee et al, Analyst 2018; doi: 10.1039/C8AN00307F)

抗體檢測大多用 LFIA (lateral flow immunoassay) 式的快篩，原理跟 ELISA 相同，只是長得像驗孕棒 XD。如上圖的 LFIA 所示，用的是 sandwich assay，也就是把抗體固定在檢測棒上面，然後先讓(可能含有病毒)的血液和帶有染劑的抗體混合，然後讓混合後的血液和抗體流過檢測棒，如果有血液含有抗原(也就是抗原)的話，就會被固定在檢測棒的抗體抓住。另一條 control line 是抓多餘的帶有染劑的抗體，也就是確認有足夠的抗體，並且有作用。因此如果血液中有病毒的話，就會有兩條線，沒有的話就會只出現 control line 那條線。

第二個介紹的是加拿大的公司 Sona Nanotech (Halifax-based)，他們是和 GE 合作研發的 LFIA，抗原用的是 spike protein 的 S1 domain，目前預估是六到八週內可以有供研究使用的產量。

如最之前說的，檢測體內是否有對抗病毒的抗體相對簡單，只要純化出抗原就可以下去測了，德國柏林的 Pharmact 已經有二十分鐘的抗體快篩檢測，用的抗原是 N protein 和 spike protein 的 S1 和 S2 domain，可以用來檢測患者體內是否有這兩個病毒蛋白的抗體，這個快篩可以檢測到 IgM 和 IgG，IgM 是人體受感染後最先產生的抗體，之後再產生 IgG。他們和 qPCR 結果做比較，結果顯示準確度很高 -- 100% true negative 和 0% false positive，不過缺點是敏感度低，因為一開始的 IgM 反應並不高，感染後的 4 - 10 天內測到的敏感度只有 70%，但是第 11 天到第 24 天可以測到 92.5%，IgG 在這幾天測到的比例也高達 98.6%，因此整體 false negative 比例約為 13%。

關於患者體內的免疫反應可參考：武漢肺炎輕症患者體內的免疫反應


其他相關文章：關於武漢病毒(SARS-CoV-2) Cryo-EM 那篇論文的閒聊



Article:

Nature / Fast, portable tests come online to curb coronavirus pandemic (March 2020)


Papers:

JP Broughton et al, Rapid Detection of 2019 Novel Coronavirus SARS-CoV-2 Using a CRISPR-based DETECTR Lateral Flow Assay. MedRxiv (2020)

R Banerjee & A Jaiswal, Recent advances in nanoparticle-based lateral flow immunoassay as a point-of-care diagnostic tool for infectious agents and diseases. Analyst (2018)

簡單檢測新冠病毒抗體

這篇研究提供了簡易的檢測方法，而且有詳細的 protocol，不過還沒有經過 peer-review (這篇之後在五月時刊在 Nature Medicine)，研究團隊是在紐約的 Icahn School of Medicine at Mount Sinai。總之非常簡單，有在純化蛋白和做 ELISA 的實驗室都可以做到，不需要 P3 實驗室，就差能不能自己抽血而已。（好想試 XD）

主要是純化抗原，然後用 ELISA 檢測人體內是否有新冠病毒的抗體，之前澳洲得那篇研究顯示在症狀開始後第七天，患者血液裡可以測到 IgM，這篇則是在症狀開始的第三天就可以檢測到抗體。（如果不懂抗體檢測的，可以去看中研院的那篇解釋。XD）

相關文章：武漢肺炎輕症患者體內的免疫反應

抗原：
1. Spike-thrombin-foldon-6xHis
2. SS-RBD-6xHis

- SARS-CoV-2 Spike protein (full-length): M1-P1213; GenBank MN908947.3
- RBD (receptor-binding domain): R319-F541
- SS: signal peptide (M1-S14)
- thrombin: thrombin cleavage site
- foldon: T4 foldon (trimer)

Expressing vectors:
1. mammalian: pCAGGS; Epi293F cells
2. baculovirus: pFastBacDual

Purification:
1. Ni-NTA (room temp)
2. Buffer exchange to PBS

Human serum samples:
1. 大概五十個血清庫裡的檢體，年齡範圍在 20 到 65 歲以上，應該都是健康個體，是用來檢測 ELISA 的背景訊號的，確認檢測的 specificity。
2. 三位康復患者的血清
3. 十二位新冠病毒急性患者的血清

患者血清檢體：
1. 新冠病毒患者症狀開始後第二、四、六和二十天
2. 新冠病毒患者康復後(同個體)：症狀開始後第三十天
3. 冠狀病毒 NL63 和 229E 的患者：NL63 也是用 ACE2
4. 其他傳染病患者康復後：包括登革熱患者

註：會引起疾病的人類冠狀病毒至少有七種，其中有四種是全球季節性的，未引起輕微的呼吸道疾病，包括有 HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 和 HCoV-229E，其中 NL63 和 229E 為 alphacoronavirus，另外兩個則是 betacoronavirus。會引起重症的 SARS 和 MERS，以及目前的 SARS-CoV-2 也是 betacoronavirus。

ELISA:
1. Coating: 2 ug/ml (in PBS), 50 ul/well, O/N at 4C
2. Blocking: 3% milk (PBS-T), 1h at room temp
3. Serum: diluted in 1% milk/PBS-T, 2 hrs at room temp
4. 2'Ab: goat-anti-human IgG HRP (1:3000, in PBS-T), 1 h at room temp


Figure / Reactivity of control and SARS-CoV-2 convalescent sera to different spike antigens (Amanat et al, medRxiv 2020)


結果：

1. 在 mammalian cells 裡的表現竟然比較好，mRBD (mammalian RBD) 可以達到 25-50 mg/L，mSpike (mammalian Spike) 也有 5 mg/L，RBD 的表現在 insect cells (iRBD) 則只有 1.5 mg/L，iSpike (insect Spike) 也只有 0.5 mg/L。

2. 在 insect cells 裡表現的 RBD 大小比在動物細胞裡較小，可能是因為在動物細胞裡表現的有被醣化，所以在蛋白膠上顯現的 band 會比較高。

3. 症狀出現後第三天就可以測到抗體

4. 所有新冠患者的血清都和 Spike 還有 RBD 有強烈反應，對 Spike 的反應比 RBD 強，其他傳染病患者的血清則沒反應。

5. 用 mRBD 和 mSpike 測出來的康復患者血清和健康個體血清的差距比較大，相較於 iRBD 和 iSpike，差距比較顯著。

6. 冠狀病毒 299E 和 NL63 患者的血清也對新冠病毒的 Spike 和 RBD 沒反應，表示沒有 cross-reactivity。

7. ELISA 的結果也可以分辨出其他傳染病患者和康復後的新冠患者。

8. 抗體 CR3022 對 mSpike 和 mRBD 有強烈反應。（關於 CR3022 可參考這篇：近期和新冠病毒抗體相關的研究）

9. 那五十幾個血清庫裡的血清對 mRBD 和 mSpike 沒反應，但是大多數卻對 229E 和 NL63 的 Spike protein 有強烈反應。

10. 有反應的抗體種類為 IgG3, IgM 和 IgA

11. 基於安全考量，他們也是惹 heat inactive serum，效果和沒有 heat-inactivated treated serum 差不多，一樣可以測到抗體，表示不需要 P3 實驗室就可以做。

12. 有不少新冠病毒康復患者的血清可以中和病毒，實驗結果顯示可以抑制病毒感染，這和 US CDC Okba et al 發表的結果是一致的。



Article:

Science / New blood tests for antibodies could show true scale of coronavirus pandemic (March 2020)


Papers:

F Amanat et al, A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine (2020)

F Amanat et al, A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in human. medRxiv (2020)

Okba et al, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2−Specific Antibody Responses in Coronavirus Disease 2019 Patients. US CDC Emerging Infectious Diseases (2020)

預防病毒感染除了打疫苗外還有什麼方法？

上個月刊在 Science Immunology 的一篇研究用的方法是用 CRISPR 改造 B cells。抗體基因分成 heavy chain (IgH) 和 light chain (IgL) 兩個部分，兩個都需要幾過幾次的 splicing 去除掉不需要的 V(D)J regions 才會變成最終的一個抗體。他們在 IgH VDJ 和 C (constant) region 中間的 intronic region 插入了對抗某個病毒(在這個研究裡是 RSV 和 Influenza) 的抗體的 IgL 和 IgH VDJ 的部分，C 的部分用原有(endogenous)的基因以減少需要插入基因的長度，使得改造過的 B cells 可以生產他們想要的抗體。


Figure / Wikipedia - VDJ recombination

他們把改造過的 B cells 植入老鼠體內，然後再輸入後的一個禮拜後，再讓老鼠感染 RSV (respiratory syncytial virus)，感染五天後取其肺臟和胰臟側病毒量，並且和抗體藥 palivizumab 的效果做比較，結果顯示效果和抗體藥一樣好。另外，改造過的 B cells 在老鼠體內可以維持多久也是個問題，所以他們也測試了長期的效果，他們在移植基改 B cells 後的 87 天後才讓老鼠感染 RSV，然後同樣在感染五天後測量胰臟和肺臟的病毒量，結果和移植七天後的效果是一樣的。

這個方法如果在人體內可行的話，或許可以取代很難研發的疫苗，不過目前的老鼠實驗只測到 87 天後的效果，是否可以維持年以上的效果還不知道。



Article:

Science / Genetically engineered immune cells fight off deadly virus in mice (May 2019)


Paper:

HF Moffett et al, B cells engineered to express pathogen-specific antibodies protect against infection. Science Immunology (2019)

鬧血荒怎麼辦？把血液全部變成 O 型血！

血型的不同在於它們表面帶有不同的抗原(antigen)和抗體，血型 A 型的紅血球表面帶有 Type A antigen 和抗體 anti-B，B 型的人帶有 Type B antigen 和抗體 anti-A，AB 型的則帶有 A, B 兩種抗原但是不帶有抗體，O 型的人則不帶有抗原，但是帶有 anti-A 和 anti-B 兩種抗體。


Figure / Blood Groups and Red Cell Antigens - Chapter 5 The ABO blood group

抗原和其對應的抗體相結合，例如抗原 Type A antigen 和抗體 anti-A 結合的話就會引發免疫反應造成溶血(hemolysis)，所以不同血型的人不能互相輸血，但是 AB 型的人可以接受所有人的血，因為他不帶有抗體，而 O 型可以捐血給所有人，因為它不帶有 A, B antigens 。

如果血庫缺少某種血或需要某種血怎麼辦？要是可以把所有的血全部變成 O 型血就好了，這樣不管需要哪種血都可以輸 O 型血。

UBC 的研究團隊在這篇研究中，發現人類的腸道菌中有兩種酵素可以把紅血球上的 Type A antigen 移除使它變成 O 型。紅血球表面的抗原，其實就是不同的醣連結 (carbohydrate chains)，A 型的比 O 型的多帶了個 GalNAc (N-acetylgalactosamine)，B 型的則是多帶惹 galactose。

他們掃了上萬個腸道菌基因，發現腸道菌 Flavonifractor plautii 的兩個酵素 N-acetylgalactosamine deacetylase (GalNAc deacetylase) 和 α-galactosidases (GalNase)，這兩個酵素合作的話，可以有效去除紅血球上的 Type A antigen，也就是把某部分的醣切掉，使它變成成 O 型紅血球上較短的醣連結。同理，也可以把 B 型紅血球表面的抗原去除，使它變成 O 型。


Figure / Blood Types and Carbohydrate Chemistry

UBC 團隊目前只試惹 A 型血，因為它比較普遍。不過，真的要用於輸血之前，要先有確認所有的 A 型紅血球都有被轉換成 O 型才行。


Article:

Science News / Type A blood converted to universal donor blood with help from bacterial enzymes (June 2019)


Paper:

P Rahfeld et al, An enzymatic pathway in the human gut microbiome that converts A to universal O type blood. Nature Microbiology (2019)

Phage display 和奈米抗體製造

之前聊過抗體的一些知識，這篇來介紹如何用 phage display (噬菌體展示)來製造抗體，這邊說的抗體是奈米抗體 VHH，也就是 nanobodies (Nbs)。如果還記得之前說過的，駱駝除了正常的 IgG 抗體外，還有一種只有 heavy chain 的小抗體(HCAbs)，而 VHH 就是它的 variable region，很小，只有 14kDa 左右。和用老鼠產生抗體的方式類似，只是這是把抗原打到羊駝(llama, alpaca, 屬於駱駝科 Familiy: Camelidae)體內。

奈米抗體(nanobodies)的開發流程

整個用 phage display 研發小抗體的步驟大概是：

1. Purify antigen (純化抗原)
2. Immunization (把抗原打到動物體內讓他們產生抗體)
3. Library building (製造抗體 library)：整個過程包括抽取動物的免疫細胞(lymphocytes)，從免疫細胞裡抽取 RNA，把 RNA 轉成 cDNA，PCR amplification，clone 到 phagemid 裡面後再 transform 到細菌裡做成細菌的 library。之後用 phage 去感染細菌，轉成 phage library。
4. Biopanning & phage amplification: 從含有各種抗體基因的 phage library 裡面把不跟抗原反應的抗體洗掉，抓出和抗原抓出相對應的抗體。
5. Phage ELISA: 利用 ELISA 釣出 positive clones，這個步驟是要從 biopanning 出來的一堆 phage 裡一個個挑出真的會和抗原反應的抗體。
6. Sequencing of positive clones：定序從 phage library 釣出來的抗體，知道序列後就可以大量生產。
7. Cloning into expression vector & purification: 把抗體的基因轉到 expression expression vector 後就可以大量表現和純化抗體。

打入抗原、讓牠產生抗體後，就可以採集牠的 lymphocytes，從中抽取 mRNA，再轉成 cDNA。之後用可以 amplify VHH 的 primers 和 PCR 去 amplify，再把這些 amplified 出來 VHH fragments subclone 到 phagemid。這些 amplified 出來的 VHH fragments 就是抗體的 DNA library。


Figure / Phagemid pMECS. VHH gene is fused to gIII gene of bacteriophage. (Vincke et al 2002)

噬菌體的構造

Phagemid 本身有包含 bacteriophage (噬菌體)的一些東西(e.g., f1 origin)，所以除了會複製外，在 helper phage M13 的加入下 [註1]，會在細菌裡 package 成一個個的 phage particles。把 VHH 的 DNA library subclone 進 phagemid 裡面是為了讓它和 phage 的 gene III 連結在一起 [註2]，gene III 的蛋白質 product 是噬菌體的外層蛋白 g3p (g3 protein)，也就是 coat protein [註3]。把 VHH 的 DNA library 和 gene III 連結在一起的話，那當 phagemid 在複製和 package 成 phage 的時候，就會和 g3p 一起表現在 phage 的表面（下圖 P3 的地方），這就是 phage display (噬菌體展示)，把抗體展示在噬菌體表面。


Figure / Microbiology: Chapter 11 - Molecular Biology of Viruses (W. W. Norton)

註1：f1 和 M13 phage 都屬於 inovirus (ssDNA virus)，M13 有十個 genes，gene I 到 gene X，它們的 protein products 即是 g1p 到 g10p。Phage display 裡常用的 helper phage 是 M13KO7，可以幫助噬菌體把 phagemid 包進 phage particle 裡面。

"M13KO7 is able to replicate in the absence of phagemid DNA. In the presence of a phagemid bearing a wild-type M13 or f1 origin, single-stranded phagemid is packaged preferentially and secreted into the culture medium.This allows easy production of single-stranded phagemid DNA for mutagenesis or sequencing." （摘自 NEB 的產品網頁）

註2：下面提供的 protocol 裡用的 phagemid 是 pMECS，它帶有 f1 origin 和 gene III。
註3：如果對病毒還算熟悉的話，就是類似病毒的 capsid proteins 或是 envelope proteins。M13 的 g3p 是在的尾端，Expasy 的 ViralZone 有不錯的介紹：Inovirus - M13 phage。

要讓噬菌體把 VHH 表現在它的表面，需要把 phagemid 轉入細菌中，這樣它才有辦法在細菌裡面 package 成一個個的 phage，並且在細菌中大量繁殖，而這些會表現 VHH 的 phage 就是 phage library。

怎麼釣出你要的奈米抗體？

因為一隻羊駝裡可以打入好幾種抗原，所以產生的抗體是對抗不同抗原的混合，因此上面做出來的 phage library 其實是各種抗體的混合。例如你在一隻駱駝裡打入 A, B, C 三個抗原，牠體內就會產生 anti-A, anti-B 和 anti-C 的奈米抗體，你的 phage library 也就會是這三種抗體的混合，如果你要從中挑出 anti-A 的 nanobodies，這時候就要做 biopanning 。

那要怎麼挑出來呢？

就是用 A 抗原去挑，把 A 固定在盤子上後，加入 phage library，這時候表現有 anti-A nanobodies 的 phage 就會 bind A，然後把其他不會 bind A 抗原的 phage 都洗掉，再把會 bind A 抗原的 phage 洗出來(elution)，就是你的 anti-A phage library 惹。Anti-B 和 anti-C 的 phage 也可以用同樣方法挑出來，這個步驟就是 biopanning。


Figure / Scheme of phage display (T Schirrmann et al, Molecules 2011; doi: 10.3390/molecules16010412)

上圖中可以看到每個 phage 的尾巴都表現不同的抗體，這些抗體會和它可以辨識的抗原結合，然後其他的抗原的抗體或是 non-specific binding 會被洗掉，而可以和抗原結合的抗體則會被挑出來，在 helper phage 的幫助之下再度感染細菌，使這些帶有能夠辨識抗原的抗體的噬菌體 amplify。經過 amplification 的噬菌體再進入下一輪的 biopanning，把 binding 比較弱的和其他的 non-specific binding 再洗掉，這樣重複個兩三輪。

之後這些各別的 anti-A, anti-B 和 anti-C phage library 可以用 ELISA 的方法(i.e., phage ELISA)挑出 individual phage clones，例如找出 affinity 最高、最 specific，或是最 stable 的 nanobodies。挑出來的 phage clones 可以萃取出它們的 phagemid，定序之後就可以知道這些 nanobodies 的 DNA sequences。



詳細的 protocol 可以參考這篇：

C Vincke et al, Generation of Single Domain Antibody Fragments Derived from Camelids and Generation of Manifold Constructs. Antibody Engineering (2012)


延伸閱讀： 關於抗體和抗體藥的一些小知識

關於抗體和抗體藥的一些小知識

近幾年來抗體藥變得頗為流行，不少藥廠研發抗體藥，其中包括治療阿茲罕默症的 aducanumab 和 solanezumab。藥名後面為 -mab 的代表是抗體藥，-mab 即為 mAb (monoclonal antibody)。


Figure / Wiki - Drug nomenclature（點圖可以放大）

學名藥命名方式可參考這：Generic Name Stems

大家都知道抗體 IgG 長什麼樣子吧？就是兩個 heavy chains 和兩個 light chains，辨認抗原(antigen)的那端是 Fv (variable regions)，另一端則是會被醣化(glycosylation)和引發免疫反應的 Fc (constant regions)。但是，你知道嗎？駱駝(camelid, llama)的體內有兩種抗體哦哦哦！一種是跟人類一樣的 IgG，另一種是只有 heavy chains 的抗體(HCAbs)，這種特別的抗體的 Fv 叫做 VHH (下圖)，又稱 nanobodies (Nbs)，雖然只有 heavy chain，但是對抗原的 binding affinity 並沒有比較弱，加上體積小，可以用來做抗體藥。


Figure / P. Holier & P. J. Hudson, Nature Biotechnology 2005 (doi: 10.1038/nbt1142)

簡單來說抗體藥有幾種，一種是整個 IgG，一種是只有 Fab，或甚至是只有 Fv，近來更小的 single-chain Fv (scFv) 和 VHH (Nbs) 也引起關注，這兩種小抗體有個好處，就是比完整的 IgG 更容易穿透細胞，也容易被清洗掉(這點有好也有壞，要看用在哪)，而且因為小又沒有 Fc，所以打入體內做為治療時不會引起不必要的免疫反應。

目前做抗體藥的方法有分三種，一種是大家比較知道的 in vivo，先打到動物裡，再取出 B cells 和 myeloma 合成 hybridomas 生產 monoclonal antibody。另一種是在 E. coli 裡面製造，這種大家應該也知道，在細菌裡面製造的優勢就是量大且便宜。最後一種是在酵母菌裡面製造，在酵母菌製造的優勢也是量大且便宜，但比細菌好的是它是 eukaryotic。

因為正常情況下，Fc 的部分會醣化，所以如果要做整個 IgG 的話，最好是在 mammalian cells 裡面製造，就是用 hybridomas，因為細菌並沒有 glycosylation，所以如果用細菌的話，還要再另外 in vitro glycosylation，這麼麻煩的話為什麼還要用細菌呢？如果你是要製造 Fab 或是 scFv 的話，因為不需要 glycosylation，這時候用細菌就可以省時省錢。

酵母菌的話，則是可以用來製造 IgG 或是 Fab, scFv。但是酵母菌的 glycosylation 和人類的不一樣，酵母菌的只有 mannose，生產出來的會附帶大量的 mannose，但是人類的是比較複雜的，通常不只有 mannose，還有 galactose 和 sialic acids 等等，所以需要改造酵母的基因，讓它能夠生產 galactose 和 sialic acid。所以同樣的，如果只是製造 Fab 或是 scFv 的話，用酵母菌會比用動物便宜。如果要製造整個 IgG 的話，雖然比較複雜一點，但是如果基因調控好了，除了可以大量生產外，還可以控制抗體的品質，省錢省時間。另外就是利用酵母菌的話，生產的蛋白質可以讓它釋放出來到培養液中，這樣純化起來會比較容易。


Figure / Jens Nielsen, Bioengineered 2013 (doi: 10.4161/bioe.22856)

當然用 E. coli 或酵母菌的話，不只能製造抗體藥，其他的蛋白質藥物也可以，例如目前市面上已有用酵母菌生產的胰島素(by Novo Nordisk)。

有興趣的可以看下面幾篇 papers。


[05.12.2018 update]

這次 Science 發了這篇文章介紹我之前講的駱駝和鯊魚的小抗體。駱駝和鯊魚除了有正常的 IgG 抗體外，還有一種小抗體，是只有 heavy chain 的抗體。這種小抗體有跟正常抗體一樣的功能，同樣能抓住抗原(antigen)，是免疫系統的一部份，在外來物體入侵時，體內會產生免疫反應製造出這些小抗體。小抗體的 variable region，也就是 VHH，又稱 nanobodies，近年被廣泛研究，看是否能用在治療疾病上面。Nanobody 的其中一種用法就是在它的一端接上讓蛋白降解訊息片段(signal sequence)，例如 degron，這樣當 nanobody 抓到致病蛋白後，接著就會被帶去 proteasome 或是 lysosome 進行降解。

相關舊文：降解蛋白質的密碼(degron)

小抗體的發現是個意外，VUB 的學生想要分析血液和疾病的關聯的時候，因為不想殺老鼠取血，便想到了冷凍庫有駱駝寫的庫存，拿來用後卻發現駱駝血裡面除了有正常的 IgG，還有一種小型的抗體，研究後發現是沒有 light chain 的抗體。之後英國的博士生想要研究駱駝的小抗體，便請 VUB 的研究人員寄血液檢體砍他，沒想到在運送過程中血液莫名弄丟了。不過呢，之後他發現鯊魚血液裡也有這種只有 heavy chain 的小抗體。（這真是太神奇了，為什麼研究會從駱駝跳到鯊魚呢？）

Nanobody 也讓 Kobeilka 得到 2012 年的諾貝爾化學獎，Kobeilka 研究的是 β2-adrenergic receptor，他利用 nanobodies 把 receptor 鎖在 active state 以研究其 crystal structure，他把結果發表在 2011 年的 Nature，之後便在 2012 年因這項研究得到諾貝爾獎。



References:

Science / Mini-antibodies discovered in sharks and camels could lead to drugs for cancer and other diseases (May 2018)

S. Steeland et al, Nanobodies as therapeutics: big opportunities for small antibodies. Drug Discovery Today (2016)

P. Holliger & P.J. Hudson, Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology (2005)

Rasmussen et al, Structure of a nanobody-stabilized active state of the β2 adrenoceptor. Nature (2011)