新冠病毒患者的免疫力可維持超過半年

根據感冒冠狀病毒和流感病毒的經驗，大多數人都認為人類體內對抗新冠病毒的免疫保護可能很短，大概感染後半年左右抗體就會降到測不到，尤其是無症狀和輕症的患者可能感染後抗體量本來就不高，不過到底可以維持多久呢？這個資訊可以讓我們預測疫苗提供的免疫保護持久力。從疫情開始至今也一年了，各國的資料也收集得差不多了吧。XD

La Jolla Institute 的研究團隊之前已經發表了兩篇相關研究，他們先是分析健康個體和 COVID-19 康復患者的血清，發現所有康復患者都有可辨識新冠病毒 Spike protein 的 CD4+ (helper) T cells，T cells 的反應程度和 IgG 量成正向相關，七成的康復患者有可對抗新冠病毒的 CD8+ (killer) T cells，而且反應強烈。康復患者除了帶有可辨識 Spike protein 的免疫細胞外，他們也帶有可辨識其他病毒蛋白的 T cells，像是 M protein 和 N protein。另外，他們也分析了疫情前採集到的血清，同樣帶有可辨識新冠病毒的 T cells。

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「他們檢測了於 2015-2018 年採樣到、沒有感染過新冠病毒的血液檢體，結果發現其中有 40% - 60% 含有可以辨識新冠病毒的 helper T cells，不過和康復患者不同的是他們的 T cells 反應雖然也是以 Spike 為主，但幾乎沒有對 N protein 或 M protein 有反應的 T cells，次主要的是 NSPs (non-structural proteins)。而之所以會有這些 T cells，可能是因為這些人之前感染過其他種類的冠狀病毒，cross-reactivity 使他們體內也有能辨識新冠病毒的 T cells。研究者們認為這是之前感染其他四種引起感冒症狀的冠狀病毒時產生的，因為這些血液檢體裡都有針對至少其中三種常見冠狀病毒的 T cells，血清檢測也顯示全部都有 HCoV-OC43 和 HCoV-NL43 Spike protein 的 IgG 抗體，表示大多數人都感染過常見的四種感冒冠狀病毒，而且至少感染過超過三種，而這也可能是為什麼大部分的人感染到新冠病毒後都只是輕症或無症狀。」

註：常見的四種感冒冠狀病毒為 NL63, 229E, OC43 和 HKU1。

在之後發表在 Science 研究裡，他們則是分析是哪些病毒片段使 CD4+ T cells 有 cross-reactivity，讓未感染個體的免疫系統能夠對新冠病毒有反應。

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在之前的研究裡，他們以分析 CD4+ T cells 的反應為主，而他們這個月發表的研究，三種 adaptive immunity 都分析了 -- CD4+ (helper) T cells, CD8+ (killer) T cells, memory B cells。在他們分析的近兩百位患者包括了無症狀患者、輕症、中度和重症患者，不過大多數(93%)為不需住院的輕症患者，年齡為 19 歲到 81 歲。其中有些患者的提供不同時期的血清檢體，間隔大約幾個月採集一次，其中有 63 個檢體是感染後超過半年後採集的。

他們分析了血清內的抗體後，發現九成患者的 anti-Spike IgG 可以六到八個月都穩定存在著，anti-nucleocapsid IgG 也差不多持續八個月穩定存在著，中和抗體主要為 anti-Spike RBD IgG，90% 患者的中和抗體也是穩定存在六到八個月。產生抗 Spike 抗體的 memory B cells 比症狀出現一個月後更多，倒是 CD4+ (helper) 和 CD8+ (killer) T cells 減少，存活週期(half-life)約為三到五個月。那生產抗體的 memory B cells 呢？他們發現患者體內針對新冠病毒的 memory B cells 在症狀出現後的 120 天內持續增加，之後呈現一個 plateau 的狀態。針對 Spike 的 memory B cells 中有約 10%-30% 是特別針對 Spike RBD。RBD-specific memory B cells 的狀況也差不多，不過可以早在症狀出現後十六天左右就開始持續增加，並且持續增加四到五個月。未感染者體內則幾乎沒有 Spike-specific memory B cells。既然有 anti-N protein 的抗體，當然就會有生產它的 nucleocapsid-specific memory B cells，也同樣是症狀出現後的四到五個月內持續穩定增加。

再來是 memory T cells。大約 70% 的患者在症狀出現後一個月(20-50 days)開始測得到針對新冠病毒的 memory CD8+ T cells，目標蛋白有 Spike, Membrane (M), Nucleocapsid (N) 和 ORF3a，其中約有 50% 患者體內的 CD8+ T cells 在六個月後仍穩定存在著，在感染後一個月，約有 93% 的患者可以測得到針對新冠病毒的 CD4+ T cells，目標蛋白除了 Spike, M, N, ORF3a 外，還有 nsp3，在六個月後體內 CD4+ T cells 仍穩定存在的患者有 92%。Spike-specific (CD4+ / CD8+) T cells 的穩定存在情況和針對新冠病毒的 T cells 類似，同樣可以穩定存在六個月以上。

最後，他們比較了免疫系統裡的其中五樣指標，看看他們維持多久。他們比較的五樣為 RBD IgG, RBD memory B cells, Spike IgA, total SARS-CoV-2-specific CD8+ T cells 和 total SARS-CoV-2-specific CD4+ T cells，因為這五樣在免疫保護力中扮演著重要角色。他們發現，大多數人(64%)在症狀出現後一到兩個月內，這五樣都穩定存在著，但在五到八個月後，這五樣在體內仍穩定存在的只剩 43%。不過呢，雖然五樣都降的人站了以半以上，但有 95% 的人在五到八個月後，至少有三樣仍穩定存在著，也就是說抗新冠病毒的免疫力並沒有之前以為的短，至少能夠維持半年以上，算是個好消息。

La Jolla 的研究已輕症為主，去年年底英國有個研究則是針對感染後無症狀或輕微症狀的醫護人員。倫敦醫院從去年三月底疫情爆發初期就開始每週驗 PCR 和血清，檢測和分析他們在英國封城後十六到十八週的 T cells 和抗體反應。

他們分析了倫敦醫院醫護人員的 T cells 和抗體，發現他們的 T cells 對新冠病毒 Spike 有反應的比例不高，只有 49%，反而對 N protein (neucleocapsid) 有反應的比例高達 85%。相較之下，疫情前的控制組對 Spike 和 N protein 有反應的比例為 29% 和 12%。不意外的，和 La Jolla 研究團隊的結果類似，未感染者血清也測得到對新冠病毒有反應的 T cells，不過到底是新冠病毒的哪個蛋白片段和感冒冠狀病毒有 cross-reactivity，是否和 La Jolla 研究團隊的結果一樣，則需要進一步的分析。

那抗體呢？有 97% 有抗 S1 IgG 或抗 N protein IgG/IgM，而且有 89% 的抗體是有抑制病毒作用的中和抗體，不過無症狀或輕微症狀患者的抗體量比症狀明顯的患者低。之前有研究顯示，新冠病毒患者的抗體量降的很快，可以在幾週內就降到測不到，不過有的研究卻顯示可以維持幾個月，而在這個研究顯示，是不管是無症狀、輕微症狀還是症狀明顯的患者，他們的中和抗體量在這 16 到 18 週中都維持固定的量，並沒有減低。另外，有趣的是五十歲以上的醫護人員中，有八成的中和抗體量很高(IC50 >200)[註]；相對的，24 歲到 49 歲有高中和抗體量的比例為 58%。

註：中和抗體量 IC50 = 0-49 為測不到，50-199 為低，200+ 為高。

那抗體和 T cell 反應是否有關聯，是否有抗新冠病毒 T cell 反應的人就有抗體，或是抗體量比較高呢？似乎關沒有絕對的關聯性，而這也和之前的研究結果類似，有不少人沒抗新冠病毒的抗體，但卻帶有對新冠病毒有反應的 T cells。

結論：目前看來，新冠病毒患者體內的抗體、生產抗體的 B cells，和前線對抗感染的 T cells 都可穩定存在五到八個月。


Publications:

CJ Reynolds et al, Discordant neutralizing antibody and T cell responses in asymptomatic and mild SARS-CoV-2 infection. Science (2020)

JM Dan et al, mmunological memory to SARS-CoV-2 assessed for up to 8 months after infection. Science (2021)

RJ Cox & KA Brokstad, Not just antibodies: B cells and T cells mediate immunity to COVID-19. Nature Reviews Immunology (2020)

未感染過新冠病毒或 SARS 的人也有對抗新冠病毒的 T cells

體內對抗病毒或細菌的免疫系統除了抗體外，還有免疫細胞們。之前說過，免疫系統有兩種，一種是第一線的先天免疫系統(innate immunity)，另一種是感染後學習得來的 adaptive immunity。簡單來說，第一線的先天免疫系統裡，負責打仗的是白血球，包括巨噬細胞(macrophage)和自然殺手細胞(natural killer cells, NK cells)等等。負責第二線 adaptive immunity 則是消滅被感染細胞的 T cells 和生產抗體的 B cells。通常感染後的 B cells 反應程度和 T cells 反應程度是相關的，有一個就有另一個，之前較多研究是著重在感染新冠病毒後，體內是否產生可以對抗的中和抗體(neutralizing antibodies)，不過最近有幾篇研究是關於 T cells 免疫反應的，有趣的發現是有的人體內測不到抗新冠病毒的抗體，但卻有抗新冠病毒的 T cells，尤其是 CD4+ (helper) T cells。

相關文章：輕症及無症狀患者帶有可對抗新冠病毒的 T cells

人類冠狀病毒有七個，除了這次的 SARS-CoV-2 和之前的 SARS, MERS，另外就是造成感冒的 OC43, HKU1, 229E 和 NL63，這些全部都會引起 T cells 反應和產生抗體，不過抗體消退的比 T cells 反應快，SARS 患者的抗體大概可維持兩、三年，不過他們的 memory T cells 在感染後至今已有十七年了仍存在於體內。之前有研究顯示抗冠狀病毒的抗體有 cross-reactivity，除了抗 spike RBD (receptor-binding domain) 的抗體比較有 specificity，由於其他蛋白在冠狀病毒中還滿 conserved，抗這些蛋白的抗體很多都有 cross-reactivity，也就是說抗其他冠狀病毒的抗體也可以辨識新冠病毒的抗體。抗體是這樣，T cells 也是這樣嗎？

前幾天發表在 Nature 的一篇研究分析了三組人的 T cells，包括有 SARS 康復患者、新冠病毒的康復患者，以及沒有感染過 SARS 和 SARS-CoV-2 或接觸過患者的個體，想知道他們體內是否有對抗新冠病毒的 T cells ，還有對病毒的哪些部分有反應，例如結構蛋白(structural protein) nucleocapsid (NP) 和非結構蛋白(non-structural proteins) NSP7 等等 [註]。

註：病毒蛋白分為兩種：structural proteins 和 non-structural (NS) proteins。Structural proteins 就是組成病毒的蛋白，例如 capsid proteins 或是 envelope proteins。NS proteins 大多是酶類蛋白，功能為調控病毒蛋白的表現居多，這篇論文裡測的 NSP7 和 NSP13 在冠狀病毒的小族群裡變化不多，SARS 和 SARS-CoV-2 的 NSP7 和 NSP13 幾乎一樣，這種通常會有 cross-reactivity。

1. 新冠病毒患者, n = 36

所有康復患者的免疫細胞(PBMC, peripheral blood mononuclear cells)對 NP 有反應，但是只有 33% 的人對 NSP7 和 NSP13 有反應。有的人的 T cells 可以對 NP 的很多片段有反應，有些 NP 片段除了可被新冠病毒患者的 T cells 辨識外，同時也可以被 SARS 康復患者的 T cells 所辨識。對病毒 NP 片段有反應的以 CD4 T cells 為主。

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2. SARS 康復患者, n = 23

SARS 已經過去十七年了，康復患者的免疫系統仍然可以對抗 SARS 嗎？這篇研究顯示，SARS 康復患者體內仍存有可以辨識 SARS NP 的免疫細胞，而且也可以辨識新冠病毒的 NP，不過對其 NSP7 和 NSP13 沒什麼反應。這是否說，新冠病毒感染患者的免疫細胞維持的時間和 SARS 康復患者的免疫細胞一樣，可以維持長達十多年後仍對病毒有反應？

3. 沒有 SARS 或新冠病毒病史和接觸史, n = 37

其中二十幾位的血液是 2019 年七月以前採樣的，十一位是抗體測試對新冠病毒的 NP 反應為陰性。分析結果顯示一半以上未感染者的 T cells 可以辨識新冠病毒的蛋白片段，不過它們辨識的片段大多和康復患者體內的 T cells 辨識的病毒片段不同，主要以 NSP7, NSP13 和 NP 為主。NSP7 和 NSP13 雖然在 SARS 和 SARS-CoV-2 間的相似度高，但是和感冒冠狀病毒 OC43, HKU1, NL63 和 229E 的相似度滿低的，那這些未感染過 SARS-CoV-1/2 個體體內的 T cells 不是因為感染過感冒冠狀病毒後習得來的，那是從哪裡得來的呢？是其他未被發現的冠狀病毒嘛？

這篇研究中也提到，雖然體內有可對抗新冠病毒的 T cells，不代表可以使個體免於感染，不過可以在感染之後就消滅它，至少不會使它演變成重症。



相關文章：新冠病毒的哪個部分最能引起免疫反應呢？

從這篇研究我們知道了什麼？

1. COVID-19 康復患者體內有可以辨識 SARS-CoV-2 的免疫細胞，而且有 cross-reactivity，也可以辨識 SARS 的病毒蛋白。

2. SARS 康復患者體內的免疫細胞可以維持十七年後仍對 SARS 蛋白有反應，並且也有 cross-reactivity，同樣對新冠病毒有反應。

3. 未感染過 SARS-CoV-1/2 或未接觸過患者的個體體內也有可以辨識新冠病毒蛋白的免疫細胞，不過辨識的蛋白和 SARS-CoV-1/2 的康復患者不同，以 NSP7 和 NSP13 為主，不像 SARS-CoV-1/2 康復患者的免疫細胞，主要辨識的是 NP。

4. 目前還不知道為什麼未感染者的體內會有可以辨識 SARS-CoV-2 蛋白的免疫細胞，只知道不是因為感染過感冒冠狀病毒後產生的。



Articles:
TN / “Common Cold” Coronaviruses Could Help Produce Anti-SARS-CoV-2 Immune Cells (July 2020)


Papers:
DM Altmann & RJ Boyton, SARS-CoV-2 T cell immunity: Specificity, function, durability, and role in protection. Science (2020)

NL Bert et al, SARS-CoV-2-specific T cell immunity in cases of COVID-19 and SARS, and uninfected controls. Nature (2020)

輕症及無症狀患者帶有可對抗新冠病毒的 T cells

免疫系統除了較為人知的白血球，例如巨噬細胞(macrophae)等等，還有抗體外，另外就是 T 細胞和製造抗體的 B 細胞。最近有幾篇研究是關於感染新冠病毒後，體內的 T 細胞反應，發現康復患者體內除了有抗 Spike protein 的抗體外，同時也都有能夠辨識新冠病毒的 CD4+ (helper) T cells，並且有強烈反應。也有研究顯示，未感染過新冠病毒的患者的血液檢體裡，也含有可辨識新冠病毒的 helper T cells。

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至於輕症或無症狀患者呢？輕症或無症狀患者的體內不見得測得到抗體，不過最近瑞典的 Karolinska Institute 的研究團隊發現，輕症及無症狀患者體內有對抗新冠病毒的 T cells，即便他們體內沒有產生足夠、可被檢測到的抗體量。

這篇研究先比較了重症患者、康復後的輕症或無症狀患者，還有健康個體的血液，發現其 CD4+ T cells 裡的 CD38 和 PD-1，以及 CD8+ T cells 裡的 CD38 和 CTLA-4 等等的表現有明顯的區別，重症患者的 CD38 和 PD-1 表現比健康個體要高。普遍來說，患者早期的 CD8+ T cells 會有 CD38 和 PD-1 表現增加的現象，而康復患者則是偏向 CCR7+ 的表現增加。他們利用這些差別，分析了今年五月中院內的五個不同族群、兩百位多位個體的 memory T cells，包括在疫情發生前或發生中的健康個體、輕重症和無症狀的康復患者，和康復患者一起住的家庭成員。

跟之前的研究一樣，疫情爆發前的健康個體血液裡有可辨識新冠病毒 membrane protein 和 spike protein 的 T cells，但是對 nucleocapsid 沒有反應，而康復患者則對這三個病毒蛋白都有反應。令人覺訝異的是輕症和無症狀患者，以及在疫情期間捐血的健康個體的血液裡，皆有對這三個病毒蛋白都有反應的 T cells。另外，CD4+ T cells 的反應比 CD8+ T cells 強烈。最後，他們比較了這五個族群體內抗體和 T cells 的關係，發現有些人的抗體檢驗為陰性，但是卻帶有對抗 nucleocapsid, membrane protein 和 spike protein 的 CD4+ 和 CD8+ T cells。帶有對新冠病毒有強烈 T cell responses 的人口中，除了患者家屬、輕症及無症狀患者外，還有在疫情期間的健康患者，帶有抗病毒 T cells 的人數是帶有抗體人數的兩倍之多，表示即便用血清檢測也低估了感染人數。

有些學者擔心，輕症或無症狀患者體內的免疫反應不足以產生保護效應，因為抗體量不高，不過這個研究顯示，雖然抗體不高，但是對抗病毒的 T cells，表示已有可以對抗病毒的免疫機制。在之前 SARS 疫苗的研發中，發現疫苗雖然沒在老鼠體內產生足夠抗體，但卻可以引起 T cell responses，並且足以使老鼠免於不被 SARS 再次感染而死亡，這個現象同樣也在這個研究裡的輕症和無症狀康復患者中觀察到。也有其他研究觀察到，未感染者帶有可辨識新冠病毒的 T cells，可能是因為和其他冠狀病毒有些許的 cross-reactivity 造成的，如果是這樣的話，是不是血清低估感染人數似乎也不能確定。



相關文章：

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抗新冠病毒的 T cells 和抗感冒冠狀病毒的有 cross-reactivity


Articles:

TN / SARS-CoV-2 Immunity Likely To Be Higher Than Antibody Testing Has Shown (July 2020)

Karolinska Instututet / Immunity to COVID-19 is probably higher than tests have shown (June 2020)


Paper:

T Sekine e tal, Robust T cell immunity in convalescent individuals with asymptomatic or mild COVID-19. bioRxiv (2020)

T Sekine e tal, Robust T cell immunity in convalescent individuals with asymptomatic or mild COVID-19. Cell (2020)

新冠病毒(SARS-CoV-2)的檢測 -- qPCR 和抗體

目前的檢測都是以用 qPCR 檢測病患體內是否有武漢病毒的 RNA，這個方法的問題是耗時耗力，尤其是 RNA extraction 相對來講比 DNA 困難不少，是個瓶頸。另外，復原的患者裡沒有病毒後就測不到 RNA，只能針對目前正被感染的患者，而非康復後的患者，如果患者康復了，那感染的源頭或是中介者就斷了。

目前用 qPCR 檢測的目標基因是 N gene, E gene 和 RdRp gene，它們轉譯後的蛋白為 nucleoprotein (N protein), envelope protein (E protein) 和 RdRp (RNA-dependent RNA polymerase)。

關於這個病毒的 background info 請參考這篇：關於武漢病毒(SARS-CoV-2) Cryo-EM 那篇論文的閒聊


Figure / SARS genome (ViralZone 2020)

之前 BC CDC (BC 省疾管局)內部的 seminar 裡有提到他們檢測的流程為先用 qPCR 檢測是否有 RdRP 和 E gene (~24hrs)，再檢測是否有 N gene (2hrs)，然後送定序 RdRP (8-16 hrs)，都顯示 positive 後最後送 National Microbiology Lab (NML) 確認(24-48hrs)。後來我在 CDC 工作的朋友說，現在已經不用送 NML，BC CDC 檢測為陽性就直接公佈了，所以 24 小時內就可以知道結果。(註：NML 為加拿大唯一的 P4 Lab，位於 Winnipeg, Manitoba。)


Figure / The 2019-nCoV Novel Coronavirus – what we know and what we’re finding out (BC CDC)

除了檢測病患的病毒 RNA，另一個方法就是測體內的抗體，感染病患在免疫系統正常的情況下，身體會製造對抗病毒的抗體，因此即使患者復原了，也可以透過檢測體內的抗體得知其是否曾經感染過病毒，例如浙江台商，另外用抗體檢測也比較省時省力。

新加坡大學 NUS 和美國 Duke University 合作抗體檢測，並在這週二發表了他們的成果。新加坡在一月時發生了兩起教會的群聚感染，一月 29 號的時候有位年輕男士感到身體不適，但找不到感源。另一個教會則是在一月 19 號的時候有位來自武漢的訪者，後來往回追接觸史的時候發現，年輕男士在一月 25 號的農曆年慶祝活動裡，同時參加活動的一對夫妻曾經接觸過那位武漢訪者。那對夫妻在一月 25 的時候出現症狀而去醫院，但因為症狀輕微並沒被診斷為武漢肺炎。發現了年輕男士和這對夫妻的連結後，這對夫妻在二月 18 號送去 CDC 檢測，不過那時那對夫妻已經康復了，檢測人員認為可能測不到病毒的 RNA，於是除了用 qPCR 檢測外，同時也做了抗體測試。沒想到，先生的 RNA 檢測為陽性，於是隔天被送醫隔離，而太太的檢測則是陰性，不過數日後的抗體檢測結果顯示夫妻兩人皆為陽性，表示兩人體內皆有武漢病毒的抗體，太太也曾經感染過病毒。

他們從康復患者的血液檢體裡發現到辨識病毒 S 蛋白(spike protein)的抗體，而這些抗體在實驗室中顯示可以阻止病毒殺死細胞。同時，他們合成的病毒蛋白也可以被患者血裡的抗體偵測到。不過，用抗體檢測需要注意它的 specificity，因為武漢病毒和 SARS 的蛋白很像，可能會出現 cross-reactivity 的問題(也就是抗體同時可以檢測到 SARS 和武漢病毒的蛋白)，所以必須要確定檢測的抗體只會辨識武漢病毒的蛋白，而新加坡和杜克大學研發的抗體測試可以分辨兩個病毒的蛋白，也就是只會對武漢病毒的蛋白有反應。

看到這裡可能會覺得很熟悉，沒錯，中研院之前也公佈過他們可以在浙江台商的血裡測到武漢病毒的蛋白，不過他們測的是 N 蛋白(nucleoprotein)。


【 名字改來改去，武漢病毒到底叫什麼？】

病毒和其引起的疾病命名方式分為三個等級：(ICTV - Naming the 2019 Coronavirus)

1. 疾病名(disease name)：由 WHO 病名，例如這次的武漢肺炎被 WHO 命名為 COVID-19 (Coronavirus Disease 2019)

2. 病毒名(virus)：由病毒學家命名，例如這次的武漢病毒是由 ICTV 裡的冠狀病毒學家命名為 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)。

3. 病毒分類(species)：由 ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses) 將病毒分類，跟動物的界門綱目科屬種一樣，病毒也由大至小分成 family (名字尾巴是 -dae), subfamily (名字尾巴是 -nae), genus (名字尾巴是 -virus) 和 species (可能前面加個宿主名，例如 canine, porcine 等等的，或是後面加個 type 1, type 2 之類的)，另如這次的冠狀病毒就是 Coronaviridae (family) - Orthocoronavirinae (subfamily) -Betacoronavirus (genus) - Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus (species)。

ICTV 發表的命名武漢病毒的 papers：

AE Gorbalenya et al, Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: The species and its viruses – a statement of the Coronavirus Study Group. bioRxiv (2020)

Coronaviridae Study Group of the ICTV, The species Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2. Nature Microbiology (2020)


Article:

Science / Singapore claims first use of antibody test to track coronavirus infections (Feb 2020)