輕症及無症狀患者帶有可對抗新冠病毒的 T cells

免疫系統除了較為人知的白血球，例如巨噬細胞(macrophae)等等，還有抗體外，另外就是 T 細胞和製造抗體的 B 細胞。最近有幾篇研究是關於感染新冠病毒後，體內的 T 細胞反應，發現康復患者體內除了有抗 Spike protein 的抗體外，同時也都有能夠辨識新冠病毒的 CD4+ (helper) T cells，並且有強烈反應。也有研究顯示，未感染過新冠病毒的患者的血液檢體裡，也含有可辨識新冠病毒的 helper T cells。

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至於輕症或無症狀患者呢？輕症或無症狀患者的體內不見得測得到抗體，不過最近瑞典的 Karolinska Institute 的研究團隊發現，輕症及無症狀患者體內有對抗新冠病毒的 T cells，即便他們體內沒有產生足夠、可被檢測到的抗體量。

這篇研究先比較了重症患者、康復後的輕症或無症狀患者，還有健康個體的血液，發現其 CD4+ T cells 裡的 CD38 和 PD-1，以及 CD8+ T cells 裡的 CD38 和 CTLA-4 等等的表現有明顯的區別，重症患者的 CD38 和 PD-1 表現比健康個體要高。普遍來說，患者早期的 CD8+ T cells 會有 CD38 和 PD-1 表現增加的現象，而康復患者則是偏向 CCR7+ 的表現增加。他們利用這些差別，分析了今年五月中院內的五個不同族群、兩百位多位個體的 memory T cells，包括在疫情發生前或發生中的健康個體、輕重症和無症狀的康復患者，和康復患者一起住的家庭成員。

跟之前的研究一樣，疫情爆發前的健康個體血液裡有可辨識新冠病毒 membrane protein 和 spike protein 的 T cells，但是對 nucleocapsid 沒有反應，而康復患者則對這三個病毒蛋白都有反應。令人覺訝異的是輕症和無症狀患者，以及在疫情期間捐血的健康個體的血液裡，皆有對這三個病毒蛋白都有反應的 T cells。另外，CD4+ T cells 的反應比 CD8+ T cells 強烈。最後，他們比較了這五個族群體內抗體和 T cells 的關係，發現有些人的抗體檢驗為陰性，但是卻帶有對抗 nucleocapsid, membrane protein 和 spike protein 的 CD4+ 和 CD8+ T cells。帶有對新冠病毒有強烈 T cell responses 的人口中，除了患者家屬、輕症及無症狀患者外，還有在疫情期間的健康患者，帶有抗病毒 T cells 的人數是帶有抗體人數的兩倍之多，表示即便用血清檢測也低估了感染人數。

有些學者擔心，輕症或無症狀患者體內的免疫反應不足以產生保護效應，因為抗體量不高，不過這個研究顯示，雖然抗體不高，但是對抗病毒的 T cells，表示已有可以對抗病毒的免疫機制。在之前 SARS 疫苗的研發中，發現疫苗雖然沒在老鼠體內產生足夠抗體，但卻可以引起 T cell responses，並且足以使老鼠免於不被 SARS 再次感染而死亡，這個現象同樣也在這個研究裡的輕症和無症狀康復患者中觀察到。也有其他研究觀察到，未感染者帶有可辨識新冠病毒的 T cells，可能是因為和其他冠狀病毒有些許的 cross-reactivity 造成的，如果是這樣的話，是不是血清低估感染人數似乎也不能確定。



相關文章：

未感染過新冠病毒或 SARS 的人也有對抗新冠病毒的 T cells
抗新冠病毒的 T cells 和抗感冒冠狀病毒的有 cross-reactivity


Articles:

TN / SARS-CoV-2 Immunity Likely To Be Higher Than Antibody Testing Has Shown (July 2020)

Karolinska Instututet / Immunity to COVID-19 is probably higher than tests have shown (June 2020)


Paper:

T Sekine e tal, Robust T cell immunity in convalescent individuals with asymptomatic or mild COVID-19. bioRxiv (2020)

T Sekine e tal, Robust T cell immunity in convalescent individuals with asymptomatic or mild COVID-19. Cell (2020)

2018 諾貝爾生醫獎：免疫系統中的檢測點 PD-1 和 CTLA-4

今年的諾貝爾生醫獎得主是免疫療法，分別為德州大學安德生癌症中心(University of Texas MD Anderson Cancer Center)的 James Allison 和日本京都大學的本庶佑。免疫細胞中有一種是 T -cells [註 1]，它的細胞膜上有接受器(T cell receptors, TCR)和其他輔助蛋白質會辨識非自體蛋白（例如細菌的或病毒的）和傳送訊息。要全面啟動 T cells 需要兩個訊息 ，一個是 T cells 上面的 TCR 和抗原的接合 [註 2]，另一個是 T cells 上面的 CD28 和 APC 表面的 B7 結合，CD28 表現在 naive T cells 上面。



Figure / M Alegre et al, Nature Reviews Immunology (2001)

註 1：T cells 又分成 helper T-cells (Th cells, CD4+ T cells) 和 cytotoxic T-cells (Tc cells, CTLs, CD8+ T cells)

註 2：抗原被 APC (antigen presenting cells) 收進細胞內後會變成小片段，然後再由過 MHC (major histocompatibility complex)呈現在 APC 表面讓 T cells 辨識，準確來說和 TCRs 結合的是 MHC:Ag。

Allison 發現 CTLs 上面的 CTLA-4 有抑制免疫反應的作用。如果說 TCR 和 CD28 是兩把鎖，MHC:Ag 和 B7 是鑰匙，解開後才會全面啟動免疫反應，那 CTLA-4 就像是安全鎖，防止 CD28 那個鎖被解開，因為它接合的對象是 B7，因此大多數人想到的是用 CTLA-4 去治療自體免疫性疾病(autoimmune disease)。不過 Allison 想到的是相反的方向，他發現 CTLA-4 的抗體會抑制 T-cell 的功能功能，並且增加免疫反應。他們把直腸癌腫瘤細胞打入老鼠裡，其中有部分老鼠同時和之後的第三天和第六天又各打入一劑 CTLA-4 抗體，結果發現沒打抗體的老鼠如預期長出腫瘤，並且持續變大，而同時也打入 CTLA-4 抗體的老鼠則是打入腫瘤細胞後的五天內長出小小腫瘤後又漸漸萎縮，然後消失了。他們給這些腫瘤長出後又消失的老鼠二次挑戰，看看之前打入的 CTLA-4 抗體的效果有沒有持續，結果這些老鼠並沒有再長出腫瘤。

CTLA-4 的抗體藥為 Bristol-Myers Squibb 的 Ipilimumab (品牌名為 Yervoy)，用來治療黑色素瘤(melanoma)。

讓京都大學的本庶佑得獎的是 PD-1，他發現這個蛋白質會表現在快死掉的 T-cells 的細胞膜表面，因此稱它為 programmed death 1 (PD-1)。PD-1 是 B7 家族的成員之一，其配位基(ligand)為 PD-L1 和 PD-L2。本庶佑和其團隊發現 PD-L1 和 B7 會一同表現在 APC 表面上外，其包括了被活化了的 blood monocytes。他們也發現，除了被活化的 APC 會表現 PD-L1，非免疫細胞的心臟和肺的組織細胞也會表現 PD-L1，它和 PD-1 結合會抑制淋巴細胞活化和繁衍；PD-L2 表現在正常的 dendritic cells 表面，和 PD-1 結合則會抑制 T cell 活化。

後來，他們和另一組研究團隊發現癌細胞也會表現 PD-L1，並且因此逃過免疫系統的偵測。之後，本庶佑和其團隊發現黑色素癌細胞(melanoma cells)無法在沒有 PD-1 的老鼠(PD-1 -/-)體內擴散，在沒有 PD-1 的情況下，CTLs 聚集在癌細胞，並且其活動力也加強了。他們同時也用了抗 PD-1 的抗體測試，發現 anti-PD1 mAb 抑制了老鼠肝臟裡癌細胞的生長，在大腸和肺的測試也得到同樣效果，阻斷 PD-1 和 PD-L1 之間的 interaction 可以抑制癌細胞生長。

雖然這兩個蛋白質都被稱為免疫機制裡的 checkpoint，然而目前臨床上的結果顯示 anti-PD-1 抗癌效果比 anti-CTLA-4 還要好。



Articles:

2018 Nobel Prize in Physiology and Medicine

Science / Cancer immunotherapy pioneers win medicine Nobel (Oct 2018)

Technology Networks / James P. Allison & Tasuku Honjo Win 2018 Nobel Prize for Medicine (Oct 2018)


Papers:

DR Leach et al, Enhancement of Antitumor Immunity by CTLA-4 Blockade. Science (1996)

M Alegre et al, T-cell regulation by CD28 and CTLA-4. Nature Reviews Immology (2001)

GJ Freeman et al, Engagement of the PD-1 Immunoinhibitory Receptor by a Novel B7 Family Member Leads to Negative Regulation of Lymphocyte Activation. JEM (2000)

Y Iwai et al, PD-1 blockade inhibits hematogenous spread of poorly immunogenic tumor cells by enhanced recruitment of effector T cells. Int Immunology (2004)

現在的生技領域在關注什麼？

（這篇是之前寫給台加的，所以很淺很白話。）

隨著科技日新月異，以前沒想過會發生的事，現在飛速前進地快要超越人類的想像，人們也要開始思考這些改變將如何影響生活，例如 Airbnb 和 Uber 帶給旅遊業和計程車業的衝擊。同樣的情況也發生在生物科技，以前以為做不到的事，現在看起來似乎有可能發生，我們也許也要開始思考，人類該如何應變這些進步。這裡介紹幾個目前熱門的技術，在驚嘆它們將如何改變人類生活之餘，它們引起的一些爭議也值得我們思考。

CRISPR-Cas9

CRISPR 的全名是 clustered regularly interspaced palindromic repeats，是古生菌(archaea)的基因體(genome)裡重複的 DNA 片段，當初發現的是西班牙的研究生 FJM Mojica，那時是 1993 年。他從那時起花了近十年的時間持續研這些重複的 DNA 片段的功用，然後在 2012 年的時候正式把它命名為 CRISPR [1]，Cas9 則是其一種切割 DNA 的酵素(endonuclease)。CRISPR-Cas9 是細菌用來對抗病毒感染的一種機制，病毒 DNA 進入細菌後，會嵌入 CRISPR 之間用來偵測之後入侵的病毒，當細菌找到對應的病毒 DNA (跟嵌入 CRISPR 之間為相同的序列)後，Cas9 則會去切碎它，使病毒無法在細菌裡面複製。2012 年，美國柏克萊大學 Dr. Jennifer Doudna 的研究團隊利用這個特性來編輯基因，並把結果發表在 Science 期刊上 [2]，刊出來之後造成轟動。這個技術會引起大量關注除了因為它能用來修正 DNA 裡突變的地方外，它還號稱便宜、快速又好上手，使得科學家們躍躍欲試，想把它應用在自己的研究上。把想要編輯(修正)的基因片段嵌入 CRISPR 之中，Cas9 找到對應的 DNA 序列後會切一個口，這個切口會使 DNA 自行修復，修復的時候會把突變的地方改回正確的，更進一步的技術是可以把它改成你想要的序列。不過，這個技術目前還有個瓶頸需要突破，因為 CRISPR-Cas9 雖然可以把突變的地方修正，但同時也可能會修改到其他地方，把原本正確的地方改成錯誤的，變為其他的突變，或是改到你不想改的地方，而我們不知道可能會被改變的地方是哪裡，只能取一些重要的基因做檢測，因此目前還無法用於人類胚胎上。另外，如何有效地把 CRISPR-Cas9 系統送進體內，讓所有細胞或局部區塊的細胞裡的基因都改正，也是需要繼續研究的地方。

雖然不能用於人類胚胎上，但仍然可用於治療疾病。美國賓州大學的 Dr. Carl June 和其團隊計畫用這個技術來治療 HIV，方法是把病人的免疫細胞 T cells 抽出來後，用 CRISPR-Cas9 插入一個癌症細胞才有的接受器基因 NY-ESO-1，然後阻斷 T cells 表面本來就有的一個蛋白的基因 PD-1，之後再把基因改造過後的 T cells 輸回病人體內，讓它們去殺死癌細胞。這個計畫去年六月已通過美國 NIH 核准，現在在等 FDA 認證，準備在今年年底進入臨床試驗 [3]。

iPS cells

自從日本京都大學的山中伸彌教授找出把已經分化的細胞變回幹細胞的方法後，好像沒什麼不能發生了。卵子受精後成為 zygote，會經過幾次細胞分裂，之後繼續分裂變成 blastocyst，到這個階段的細胞都屬於胚胎幹細胞(embryonic stem cells, ES cells)，這個時期的細胞可以自我複製(self-renewal)，也可以繼續分化(differentiation)成各種細胞，例如表皮細胞。胚胎幹細胞可以說是生命的起頭，而分化後的細胞則是終端，無法再變成其他種細胞。

Blastocyst 的內層細胞通常會被抽取出來體外培養，也就是研究用的 ES cells，這個階段的幹細胞屬於多能性幹細胞(pluripotent ES cells)。而山中伸彌的研究，則是利用四個 transcription factors (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) 把分化後的細胞重新設定(reprogram)，使它變回多能性幹細胞，這些被重新設定的人工多能性幹細胞就是 iPS cells (induced pluripotent stem cells, 誘導性多能幹細胞)。當細胞被變回幹細胞後，你可以誘導它分化成你想要的細胞，例如卵子或精子。這個技術除了避免了使用胚胎幹細胞作為研究用途的爭議，也擴展了治療疾病上的可能性，山中伸彌教授的 iPS cells 研究讓他獲得了 2012 年的諾貝爾生醫獎。

iPS cells 能夠如何應用在治療上面呢？2014 年的時候，日本兵庫縣一位七十歲的女性接受了幹細胞移植手術治療黃斑病(macular degeneration)，地點在鼎鼎有名、位於京都的 RIKEN Centre for Developmental Biology (CBD)。這個手術由三位眼科醫師執行，為首的是任職於神戸市立医療センター中央市民病院的栗本康夫，RIKEN 中心的高橋政代把一位七十歲的女性病患的皮膚細胞轉成 iPS cells 後，再把它轉成 retinal pigment epithelium cells (視網膜色素上皮細胞)，讓它長成一片後，再取一小片細胞植入病患眼中，這是史上第一次用 iPS cells 治療的手術 [4]。 時隔三年後，2017 年三月底，同樣的團隊再度幫另一位病患動同樣的手術治療黃斑病，只是這次用的不是病患自己的細胞，而是別人的，比對過 HLAs (human leukocyte antigens)後可以避免產生免疫反應 [5]。RIKEN 的 iPS cell bank 有人類(HPS)和其他動物(APS)的，每個 iPS cell line 都有詳細的資料，如果可以建立起一個龐大的 iPS cell bank，那使用的用途就會變得比較多，也可以供給更多病患使用（基本上可以變成像幹細胞銀行那樣）。

Genome profile

人類基因體計畫(Human Genome Project)完成於 2003 年，之後 DNA 定序(sequencing)的技術越來越進步，近幾年主要用的技術是次世代定序 NGS (next-generation sequencing)，比原本的定序技術 Sanger sequencing 能定序 DNA 序列的量要大，也讓全基因體定序(whole-genome sequencing, WGS)的價格漸漸降低，從之前的每人要價五千美金降到一千美金左右（和研究計畫合作）。全基因體定序除了能夠幫助科學家們研究各個基因的變異(variations)，也能應用於疾病治療上。目前很夯的 Personalized Medicine (或稱 Precision Medicine)是指針對各個病人做不同的治療，例如乳癌的突變基因除了大家都知道的 BRCA1 和 BRCA2，還有其他種類的突變，不同的突變對藥物的反應不見得一樣，不同的病患也可能對同樣的藥物反應不同，可能這個藥對這個病患有效，但對其他的效果不大。Personalized Medicine 便是對不同的病患設計不同的治療，已達到最大的治療效果。當全基因體定序的資料庫建立起來，便可供大家研究各個基因和其突變間的變異，科學家可以用資料庫裡的基因資料做比對，然後針對某些致病的突變做研究，以利於後面的藥物研發，不同的突變可用不同的治療方式，增加治癒的機率。

註：除了全基因體定序，另有 whole-exome sequencing，是指定序所有已知的 exomes。

關於技術的爭議和需要思考的地方

上面介紹的技術雖然在未來可以解決不少問題，或用來治療目前無法治療的疾病，但仍有些地方是需要考慮的。iPS cells 是目前爭議性最低的，之前科學界用人類的胚胎幹細胞來做研究遭到一些外界的反對，認為違反倫理，而 iPS cells 的出現算是解決了這項爭議，因為可以用 iPS cells 代替人類胚胎幹細胞做研究。不過，類似的爭議同樣浮現在 CRISPR-Cas9 的應用上，例如把 CRISPR-Cas9 用在人類胚胎上面：如果父母對於自己的基因不滿意，我們可以用這個技術去改造胚胎的基因，讓他成為一個完美的小孩嗎？父母有權利用自己主觀的想法去更改小孩的基因嗎？這個例子好像還太遙遠，那如果在父母有遺傳性疾病，我們可以用 CRISPR-Cas9 去編輯受精卵帶有的突變基因嗎？其中的風險有人能幫小孩承擔嗎？當然，要知道自己是否有突變的基因，是否會遺傳給後代，可以做全基因體定序，未來當價格越來越便宜後，是否要為自己的全部基因做定序呢？其中是否會有隱私問題？保險公司是否能因為你帶有高致病風險的基因而提高保費或拒保呢？雖然這些都還沒發生，但隨著科技進步之快速，我們可能要開始思考這其中是否有些界線是不能跨越的，或是當它成為無法阻擋的趨勢時，該如何用法律去規範。



References

1. E Lander. The Heroes of CRISPR. Cell (2016)
2. M Jinek and K Chylinski et al. A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science (2012)
3. First CRISPR clinical trial gets green light from US panel. Nature (2016)
4. Japanese woman is first recipient of next-generation stem cells. Nature (2014)
5. Japanese man is first to receive 'reprogrammed' stem cells from another person. Nature (2017)