現在的生技領域在關注什麼？

（這篇是之前寫給台加的，所以很淺很白話。）

隨著科技日新月異，以前沒想過會發生的事，現在飛速前進地快要超越人類的想像，人們也要開始思考這些改變將如何影響生活，例如 Airbnb 和 Uber 帶給旅遊業和計程車業的衝擊。同樣的情況也發生在生物科技，以前以為做不到的事，現在看起來似乎有可能發生，我們也許也要開始思考，人類該如何應變這些進步。這裡介紹幾個目前熱門的技術，在驚嘆它們將如何改變人類生活之餘，它們引起的一些爭議也值得我們思考。

CRISPR-Cas9

CRISPR 的全名是 clustered regularly interspaced palindromic repeats，是古生菌(archaea)的基因體(genome)裡重複的 DNA 片段，當初發現的是西班牙的研究生 FJM Mojica，那時是 1993 年。他從那時起花了近十年的時間持續研這些重複的 DNA 片段的功用，然後在 2012 年的時候正式把它命名為 CRISPR [1]，Cas9 則是其一種切割 DNA 的酵素(endonuclease)。CRISPR-Cas9 是細菌用來對抗病毒感染的一種機制，病毒 DNA 進入細菌後，會嵌入 CRISPR 之間用來偵測之後入侵的病毒，當細菌找到對應的病毒 DNA (跟嵌入 CRISPR 之間為相同的序列)後，Cas9 則會去切碎它，使病毒無法在細菌裡面複製。2012 年，美國柏克萊大學 Dr. Jennifer Doudna 的研究團隊利用這個特性來編輯基因，並把結果發表在 Science 期刊上 [2]，刊出來之後造成轟動。這個技術會引起大量關注除了因為它能用來修正 DNA 裡突變的地方外，它還號稱便宜、快速又好上手，使得科學家們躍躍欲試，想把它應用在自己的研究上。把想要編輯(修正)的基因片段嵌入 CRISPR 之中，Cas9 找到對應的 DNA 序列後會切一個口，這個切口會使 DNA 自行修復，修復的時候會把突變的地方改回正確的，更進一步的技術是可以把它改成你想要的序列。不過，這個技術目前還有個瓶頸需要突破，因為 CRISPR-Cas9 雖然可以把突變的地方修正，但同時也可能會修改到其他地方，把原本正確的地方改成錯誤的，變為其他的突變，或是改到你不想改的地方，而我們不知道可能會被改變的地方是哪裡，只能取一些重要的基因做檢測，因此目前還無法用於人類胚胎上。另外，如何有效地把 CRISPR-Cas9 系統送進體內，讓所有細胞或局部區塊的細胞裡的基因都改正，也是需要繼續研究的地方。

雖然不能用於人類胚胎上，但仍然可用於治療疾病。美國賓州大學的 Dr. Carl June 和其團隊計畫用這個技術來治療 HIV，方法是把病人的免疫細胞 T cells 抽出來後，用 CRISPR-Cas9 插入一個癌症細胞才有的接受器基因 NY-ESO-1，然後阻斷 T cells 表面本來就有的一個蛋白的基因 PD-1，之後再把基因改造過後的 T cells 輸回病人體內，讓它們去殺死癌細胞。這個計畫去年六月已通過美國 NIH 核准，現在在等 FDA 認證，準備在今年年底進入臨床試驗 [3]。

iPS cells

自從日本京都大學的山中伸彌教授找出把已經分化的細胞變回幹細胞的方法後，好像沒什麼不能發生了。卵子受精後成為 zygote，會經過幾次細胞分裂，之後繼續分裂變成 blastocyst，到這個階段的細胞都屬於胚胎幹細胞(embryonic stem cells, ES cells)，這個時期的細胞可以自我複製(self-renewal)，也可以繼續分化(differentiation)成各種細胞，例如表皮細胞。胚胎幹細胞可以說是生命的起頭，而分化後的細胞則是終端，無法再變成其他種細胞。

Blastocyst 的內層細胞通常會被抽取出來體外培養，也就是研究用的 ES cells，這個階段的幹細胞屬於多能性幹細胞(pluripotent ES cells)。而山中伸彌的研究，則是利用四個 transcription factors (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) 把分化後的細胞重新設定(reprogram)，使它變回多能性幹細胞，這些被重新設定的人工多能性幹細胞就是 iPS cells (induced pluripotent stem cells, 誘導性多能幹細胞)。當細胞被變回幹細胞後，你可以誘導它分化成你想要的細胞，例如卵子或精子。這個技術除了避免了使用胚胎幹細胞作為研究用途的爭議，也擴展了治療疾病上的可能性，山中伸彌教授的 iPS cells 研究讓他獲得了 2012 年的諾貝爾生醫獎。

iPS cells 能夠如何應用在治療上面呢？2014 年的時候，日本兵庫縣一位七十歲的女性接受了幹細胞移植手術治療黃斑病(macular degeneration)，地點在鼎鼎有名、位於京都的 RIKEN Centre for Developmental Biology (CBD)。這個手術由三位眼科醫師執行，為首的是任職於神戸市立医療センター中央市民病院的栗本康夫，RIKEN 中心的高橋政代把一位七十歲的女性病患的皮膚細胞轉成 iPS cells 後，再把它轉成 retinal pigment epithelium cells (視網膜色素上皮細胞)，讓它長成一片後，再取一小片細胞植入病患眼中，這是史上第一次用 iPS cells 治療的手術 [4]。 時隔三年後，2017 年三月底，同樣的團隊再度幫另一位病患動同樣的手術治療黃斑病，只是這次用的不是病患自己的細胞，而是別人的，比對過 HLAs (human leukocyte antigens)後可以避免產生免疫反應 [5]。RIKEN 的 iPS cell bank 有人類(HPS)和其他動物(APS)的，每個 iPS cell line 都有詳細的資料，如果可以建立起一個龐大的 iPS cell bank，那使用的用途就會變得比較多，也可以供給更多病患使用（基本上可以變成像幹細胞銀行那樣）。

Genome profile

人類基因體計畫(Human Genome Project)完成於 2003 年，之後 DNA 定序(sequencing)的技術越來越進步，近幾年主要用的技術是次世代定序 NGS (next-generation sequencing)，比原本的定序技術 Sanger sequencing 能定序 DNA 序列的量要大，也讓全基因體定序(whole-genome sequencing, WGS)的價格漸漸降低，從之前的每人要價五千美金降到一千美金左右（和研究計畫合作）。全基因體定序除了能夠幫助科學家們研究各個基因的變異(variations)，也能應用於疾病治療上。目前很夯的 Personalized Medicine (或稱 Precision Medicine)是指針對各個病人做不同的治療，例如乳癌的突變基因除了大家都知道的 BRCA1 和 BRCA2，還有其他種類的突變，不同的突變對藥物的反應不見得一樣，不同的病患也可能對同樣的藥物反應不同，可能這個藥對這個病患有效，但對其他的效果不大。Personalized Medicine 便是對不同的病患設計不同的治療，已達到最大的治療效果。當全基因體定序的資料庫建立起來，便可供大家研究各個基因和其突變間的變異，科學家可以用資料庫裡的基因資料做比對，然後針對某些致病的突變做研究，以利於後面的藥物研發，不同的突變可用不同的治療方式，增加治癒的機率。

註：除了全基因體定序，另有 whole-exome sequencing，是指定序所有已知的 exomes。

關於技術的爭議和需要思考的地方

上面介紹的技術雖然在未來可以解決不少問題，或用來治療目前無法治療的疾病，但仍有些地方是需要考慮的。iPS cells 是目前爭議性最低的，之前科學界用人類的胚胎幹細胞來做研究遭到一些外界的反對，認為違反倫理，而 iPS cells 的出現算是解決了這項爭議，因為可以用 iPS cells 代替人類胚胎幹細胞做研究。不過，類似的爭議同樣浮現在 CRISPR-Cas9 的應用上，例如把 CRISPR-Cas9 用在人類胚胎上面：如果父母對於自己的基因不滿意，我們可以用這個技術去改造胚胎的基因，讓他成為一個完美的小孩嗎？父母有權利用自己主觀的想法去更改小孩的基因嗎？這個例子好像還太遙遠，那如果在父母有遺傳性疾病，我們可以用 CRISPR-Cas9 去編輯受精卵帶有的突變基因嗎？其中的風險有人能幫小孩承擔嗎？當然，要知道自己是否有突變的基因，是否會遺傳給後代，可以做全基因體定序，未來當價格越來越便宜後，是否要為自己的全部基因做定序呢？其中是否會有隱私問題？保險公司是否能因為你帶有高致病風險的基因而提高保費或拒保呢？雖然這些都還沒發生，但隨著科技進步之快速，我們可能要開始思考這其中是否有些界線是不能跨越的，或是當它成為無法阻擋的趨勢時，該如何用法律去規範。



References

1. E Lander. The Heroes of CRISPR. Cell (2016)
2. M Jinek and K Chylinski et al. A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science (2012)
3. First CRISPR clinical trial gets green light from US panel. Nature (2016)
4. Japanese woman is first recipient of next-generation stem cells. Nature (2014)
5. Japanese man is first to receive 'reprogrammed' stem cells from another person. Nature (2017)

每個人都帶有至少一個治病的基因突變

這個研究滿有趣的，他們找了一百位健康的人來做基因定序，看是不是真的健康。這個研究是 ACMG (American College of Medical Genetics and Genomics) 和 Boston 的幾個醫院合作的，參與的有九位醫生，每位各找十個左右 40-65 歲的病人，說是病人但基本上是健康的，沒有心血管疾病和糖尿病病史。其中有五十位只做了家族史(family history, FH)問卷[註]來檢測患病風險，另為五十位則做了家族史問卷和全基因體定序(WGS, 4600 genes)，之後醫生依據這些結果和病人討論和給予建議（例如飲食、運動等等）。

結果發現，每個人都帶有至少一個隱性基因突變，就是說兩個 copy 只有一個有突變，所以沒症狀，但是如果兩個 copy 都突變了，會造成疾病，而這些定序出來帶有突變且會致病的基因有 59 個，大多是罕見疾病。這五十位有做基因定序的病人中，有十一位發現有他們之前不知道的疾病，有兩個是之前便知道有遺傳性血色病(hereditary hemochromatosis)(homozygous HFE C282Y variant)，並已經在治療。在那十一位中，有兩個在定序結果出來後的半年內出現的症狀證實了定序的結果：一位有白點狀眼底(fundus albipunctatus, homozygous RDH5 W95X variant)，他表示的確一直有無法適應黑暗的困擾；另一位是有紫質症 variegate porphyria (PPOX L67X variant)，皮膚對陽光敏感，被照到的地方會受傷或起水泡。剩下的九位，雖然帶有突變基因，但並沒有出現明顯症狀，例如帶有 KCNQ1 S276 突變的沒有出現 long QT syndrome 的症狀。

在醫生和病人得到結果後，只有做家族史的那組只有 16% 有做其他的檢測，而有做基因檢測的那組則有 34%。因為擔心病人知道自己的患病風險後會不會變得很緊張和焦慮，他們也做了這方面的測驗，發現兩組的人都沒有在知道結果後有情緒上的變化。

這篇讓我比較訝異的是每個人都帶有會致病的隱性突變，而且多是罕見疾病，我本來以為比較多會是常見的疾病，但其中的確有 BRCA1, BRCA2 就是了。不過，這是說其實罕見疾病沒那麼罕，只是剛好碰見和你帶有相同的突變基因、並且結婚生子的不多嗎？而近親通婚則把這個機率升高了。

之前有個研究是專做近親通婚的基因定序：
《舊文：除了人類基因體計畫，還有另一種：Human Knockout Project 》

如果全基因體定序的價格將到你可以負擔得起，或是健保有條件給付，你會想做嗎？如果將來可以做到人人可做全基因體定序，還要考慮到隱私權問題，保險公司能不能過問，能不能因為你帶有某些基因突變而調高保費或拒保。

是說如果 $$ 夠多的話，可以取幾個地區，每區各十個人左右，然後在每個人的 20, 40, 60 歲的時候做一次 WGS，比較看看有什麼變化，是不是某些環境真的會致病或致癌。或是劃分成幾種生活習慣，例如抽煙、愛吃三高食物，或是每天都熬夜等等的，同在在他們 20, 40, 60 歲的時候做一次 WGS，看看生活習慣有沒有影響，不過這種可能比較偏向 epigenetics，WGS 大概看不出來。


【 註 1 】網路家族史問卷：My Family Health Project
【 註 2 】59 個有突變的基因列表：ACMG Recommendations for Reporting of Incidental Findings in Clinical Exome and Genome Sequencing


Article:

Science / One in five 'healthy' adults may carry disease-related genetic mutations


JL Vassay et al, The Impact of Whole-Genome Sequencing on the Primary Care and Outcomes of Healthy Adult Patients: A Pilot Randomized Trial. Annals of Internal Medicine (2017)

除了人類基因體計畫，還有另一種：Human Knockout Project

做研究常常需要用到 KO (knock-out) mice 來確認目標蛋白質的重要性，或是主要功能是什麼。不過呢，人和老鼠還是有差別，我們可以把老鼠的某個基因 KO，但無法把人類的基因 KO。如果我們無法 KO 人類的基因，那總可以找本來就沒有某些基因的人來研究吧？

雖說近親繁殖會使隱性的突變和疾病顯現出來，例如某 A 帶的一對基因一個是正常的(X)，一個是突變沒功能的(x)，那他帶的這個基因就是 Xx。因為突變而喪失功能叫 loss-of-function (LoF)，假設某 B 是近親因此也有同樣的情形 (Xx)，兩個人通婚後生的小孩就會有 25% 的機會是 xx，也就是身體裡沒有正常功能的蛋白質 X，等於是人類的 X 基因 KO。這種近親通婚的情況目前在帕基斯坦還存在，他們常常會和自己的表親通婚，於是會出現讓隱性突變顯性表現出來的情形。然而，很多人即使因為這個情形而喪失了某些基因，但還是活得很健康，這表示這個基因不重要嗎？這些看似不重要的基因也許可以為藥物研發帶來什麼意義。

2000 年的時候，Daniel MacArthur 開始找人類沒有也不會有事的基因。那年他還是 Dr. Kathryn North 實驗室的大學生。Dr. North 是澳洲雪梨大學的教授，之前發現一對兄弟的 muscular dystrophy (MD) 早發症狀(early-onset)可能是因為 ACTN3 出問題，不過當他們確認了父母肌肉裡的蛋白表現時，發現並沒有正常的 ACTN3 蛋白，但是父母本身是健康的，表示兄弟倆的 MD 症狀並非是缺少 ACTN3 蛋白的緣故（他們後來也發現是另一個基因突變造成的）[1]。於是呢，Dr. North 便開始想找出有什麼基因是看似重要，但沒有也可以存活的，也許我們缺少了那個基因非但無害，反而還有好處，他把這個計畫叫做 Human Knockout Project。為 1000 Genomes Project [註] 的一部份，分析了 185 位的基因體，MacArthur 和同事發現健康的人平均有一百種 LoF variants 和二十個完全喪失功能的基因突變 [1, 8]。

健康人的 LoF variants 通常是這幾種情形 [8]：
- 兩個 alleles 只有一個有問題(heterogenous)，而有問題的那個雖然造成嚴重疾病，但因為是 recessive 所以(病徵)不會表現出來。
- 有問題的 alleles 雖然沒那麼嚴重，但也不至於造成疾病。
- 那個基因是多餘的(redundant)，也就是說有其他的基因可以取代它的功能。
- 不會影響基因的功能

2014 年的時候，MacArthur 和耶魯大學的 van Heel，還有英國倫敦大學(University of London)的 Richard Trembath 計畫花四年定序住在英國的倫敦東區的 25,000 位巴基斯坦裔英國人的基因，這些人的父母很多都是一等親(表親)通婚。2015 年的時候，他們開始這項計畫，Sanger Institute 也答應幫他們定序，預計 2017 年年底可以完成 [2]。2016 年的時候，他們把已經定序和分析了的 3222 位巴裔英國人的結果發表在 Science，發現他們真的缺少不少基因，在 821 人裡有 781 個基因共出現 847 種 variants，其中有 575 個 variants 是 LoF。有 38 個人缺少了之前以為很重要的基因，但只有 9 人因為缺少這些基因而生病 [3, 9]。

之後，MIT Broad Institute 的 Dr. Sekar Kathiresan 也做了類似的研究，他們分析了 10,503 位有參與長期心血管疾病和糖尿病研究的巴基斯坦人的基因，結果發表在這個月的 Nature。他們發現這些人的基因中有 1317 個是即便完全喪失功能(fully knock-out)也不會造成需要就醫的情形，有 1843 人至少有一個完全喪失功能的基因(就是兩個 alleles 都 KO)，有兩個人以上是同時有七個喪失功能的基因：PLA2G7 (Lp-PLA2), CYP2F1 (Cytochrome P450 2F1), TREH (Trehalase), A3GALT2 (α1,3-galactosyltransferase 2), NRG4 (neureglin 4), SLC9A3R1, APOC3 [5, 11]。

七個基因中有一個是 PLA2G7，其蛋白是 Lp-PLA2 (lipoprotein associated phospholipase A2)，這是和血塞有關的酵素，之前研究顯示如果血中的 Lp-PLA2 越高的話，心臟病發(heart attack)的機率就越高。GSK 在 2012 年花了三億美金(USD$3B)買下 Human Genome Sciences 研發抑制 Lp-PLA2 的藥物 Darapladib，不過它的兩個大型 phase III 臨床試驗都失敗 [7]。這個研究發現少了一個或一對 Lp-PLA2 基因的巴基斯坦人得到心血管疾病的機率並沒有比較低，也許可以解釋為什麼 Lp-PLA2 inhibitor 會失敗 [5, 11]。

七個基因中還有一個是 APOC3，其蛋白是 ApoC3 (apolipoprotein C3)，它是 chylomicrons, VLDL (very low density lipoprotein) 和 HDL (high-density lipoprotein)裡的其中一個蛋白，會讓肝臟無法吸收富含甘油三酯(triglycerides, TGs)的脂肪粒(TG-rich lipoproteins, TRLs)，使食物中的脂肪無法從體內循環中被清除，使得高血液中的 TRLs 升高。之前研究顯示當血中的 ApoC3 和 TRLs 過高的話，會造成高三酸甘油酯症(hypertriglyceridemia)；而如果抑制 ApoC3 的話，則應該可以促進脂肪代謝。而在這個研究裡，有一整個家庭，包括雙親和九個孩子，全部都缺少 APOC3 基因，即便他們喝了一杯充滿脂肪的奶昔，但血液中的脂肪量卻很少會上升。這個家庭雖然缺少 ApoC3，但身體健康，表示如果用藥物抑制 ApoC-III 來治療應該是安全的 [5, 6, 11]。

另一個跟 ApoC-III 類似情況的是 PCSK9。德州大學 Southwestern Medical Center 的心血管疾病專家 Helen Hobbs 說他和同事之前懷疑過，有些人的壞膽固醇(LDL, low-density lipoprotein)異常的低是因為 PCSK9 喪失功能。他們找到一位個案是 34 歲的女士，她的一對 PCSK9 都因為突變而喪失功能，造成她的 LDL 極低但身體卻是健康的。因為這個研究，藥廠發現可以用藥物抑制 PCSK9 來降低膽固醇 [1]。事實上，PCSK9 inhibtor 已經進入臨床試驗階段，今年三月的時候，結果發表在 NEJM 中 [10]。這個藥物是 Amgen 的 evolocumab (Repatha)，顯示不但可以降低血液中的膽固醇(up to 59%)，也可以在已經服用降膽固醇藥物 statins 的病患身上再降低 20% 因心血管疾病致死的風險 [4]。

註：為 The 1000 Genomes Project Consortium 的計畫，目的是深入了解 genotype (基因)和 phenotype (表現出來的徵狀)的關係， genotype 如何影響 phenotype [12]。其中合作者眾多，有 Baylor College of Medicine, Broad Institute (MIT, Harvard), Illumina, Life Technologies, Roche, Wellcome Trust Sanger Institute, Cold Spring Harbor Laboratory, EBI, Yale, Stanford 等等。

這個計畫下面有三個主要計畫：
1. 從四個族群裡選出 179 人做全基因底定序(low-coverage WGS)
2. 兩代基因定序(high-coverage WGS)，基本為父母和孩子三人的(mother-father-child trios)。
3. 從幾個族群裡選出 679 人做目標性定序(targeted sequencing)



Articles:

1. J Kaiser, The Hunt for Missing Genes. Science (2014)

2. J Kaiser, East London study to explore high disease rates in south Asians (2015)

3. J Kaiser, Human ‘knockouts’ reveal genes we don’t need. Science (2016)

4. H Ledford, Genome-based cholesterol drug boosts heart health. Nature (2017)

5. J Kaiser, Human ‘knockouts’ may reveal why some drugs fail. Science (2017)

6. Science News / Gene knockouts in people provide drug safety, effectiveness clues (2017)

7. Science Daily / New genetic research can significantly improve drug development (2016)


Papers:

8. DG MacArthur et al, A Systematic Survey of Loss-of-Function Variants in Human Protein-Coding Genes. Science (2012)

9. VM Narasimhan et al, Health and population effects of rare gene knockouts in adult humans with related parents. Science (2016)

10. MS Sabatine et al, Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease. NEJM (2017)

11. D Saleheen et al, Human knockouts and phenotypic analysis in a cohort with a high rate of consanguinity. Nature (2017)

12. The 1000 Genomes Project Consortium, A map of human genome variation from population-scale sequencing. Nature (2010)