做研究常常需要用到 KO (knock-out) mice 來確認目標蛋白質的重要性，或是主要功能是什麼。不過呢，人和老鼠還是有差別，我們可以把老鼠的某個基因 KO，但無法把人類的基因 KO。如果我們無法 KO 人類的基因，那總可以找本來就沒有某些基因的人來研究吧？
雖說近親繁殖會使隱性的突變和疾病顯現出來，例如某 A 帶的一對基因一個是正常的(X)，一個是突變沒功能的(x)，那他帶的這個基因就是 Xx。因為突變而喪失功能叫 loss-of-function (LoF)，假設某 B 是近親因此也有同樣的情形 (Xx)，兩個人通婚後生的小孩就會有 25% 的機會是 xx，也就是身體裡沒有正常功能的蛋白質 X，等於是人類的 X 基因 KO。這種近親通婚的情況目前在帕基斯坦還存在，他們常常會和自己的表親通婚，於是會出現讓隱性突變顯性表現出來的情形。然而，很多人即使因為這個情形而喪失了某些基因，但還是活得很健康，這表示這個基因不重要嗎？這些看似不重要的基因也許可以為藥物研發帶來什麼意義。
2000 年的時候，Daniel MacArthur 開始找人類沒有也不會有事的基因。那年他還是 Dr. Kathryn North 實驗室的大學生。Dr. North 是澳洲雪梨大學的教授，之前發現一對兄弟的 muscular dystrophy (MD) 早發症狀(early-onset)可能是因為 ACTN3 出問題，不過當他們確認了父母肌肉裡的蛋白表現時，發現並沒有正常的 ACTN3 蛋白，但是父母本身是健康的，表示兄弟倆的 MD 症狀並非是缺少 ACTN3 蛋白的緣故（他們後來也發現是另一個基因突變造成的）[1]。於是呢，Dr. North 便開始想找出有什麼基因是看似重要，但沒有也可以存活的，也許我們缺少了那個基因非但無害，反而還有好處，他把這個計畫叫做 Human Knockout Project。為 1000 Genomes Project [註] 的一部份，分析了 185 位的基因體，MacArthur 和同事發現健康的人平均有一百種 LoF variants 和二十個完全喪失功能的基因突變 [1, 8]。
健康人的 LoF variants 通常是這幾種情形 [8]：
- 兩個 alleles 只有一個有問題(heterogenous)，而有問題的那個雖然造成嚴重疾病，但因為是 recessive 所以(病徵)不會表現出來。
- 有問題的 alleles 雖然沒那麼嚴重，但也不至於造成疾病。
- 那個基因是多餘的(redundant)，也就是說有其他的基因可以取代它的功能。
- 不會影響基因的功能
2014 年的時候，MacArthur 和耶魯大學的 van Heel，還有英國倫敦大學(University of London)的 Richard Trembath 計畫花四年定序住在英國的倫敦東區的 25,000 位巴基斯坦裔英國人的基因，這些人的父母很多都是一等親(表親)通婚。2015 年的時候，他們開始這項計畫，Sanger Institute 也答應幫他們定序，預計 2017 年年底可以完成 [2]。2016 年的時候，他們把已經定序和分析了的 3222 位巴裔英國人的結果發表在 Science，發現他們真的缺少不少基因，在 821 人裡有 781 個基因共出現 847 種 variants，其中有 575 個 variants 是 LoF。有 38 個人缺少了之前以為很重要的基因，但只有 9 人因為缺少這些基因而生病 [3, 9]。
之後，MIT Broad Institute 的 Dr. Sekar Kathiresan 也做了類似的研究，他們分析了 10,503 位有參與長期心血管疾病和糖尿病研究的巴基斯坦人的基因，結果發表在這個月的 Nature。他們發現這些人的基因中有 1317 個是即便完全喪失功能(fully knock-out)也不會造成需要就醫的情形，有 1843 人至少有一個完全喪失功能的基因(就是兩個 alleles 都 KO)，有兩個人以上是同時有七個喪失功能的基因：PLA2G7 (Lp-PLA2), CYP2F1 (Cytochrome P450 2F1), TREH (Trehalase), A3GALT2 (α1,3-galactosyltransferase 2), NRG4 (neureglin 4), SLC9A3R1, APOC3 [5, 11]。
七個基因中有一個是 PLA2G7，其蛋白是 Lp-PLA2 (lipoprotein associated phospholipase A2)，這是和血塞有關的酵素，之前研究顯示如果血中的 Lp-PLA2 越高的話，心臟病發(heart attack)的機率就越高。GSK 在 2012 年花了三億美金(USD$3B)買下 Human Genome Sciences 研發抑制 Lp-PLA2 的藥物 Darapladib，不過它的兩個大型 phase III 臨床試驗都失敗 [7]。這個研究發現少了一個或一對 Lp-PLA2 基因的巴基斯坦人得到心血管疾病的機率並沒有比較低，也許可以解釋為什麼 Lp-PLA2 inhibitor 會失敗 [5, 11]。
七個基因中還有一個是 APOC3，其蛋白是 ApoC3 (apolipoprotein C3)，它是 chylomicrons, VLDL (very low density lipoprotein) 和 HDL (high-density lipoprotein)裡的其中一個蛋白，會讓肝臟無法吸收富含甘油三酯(triglycerides, TGs)的脂肪粒(TG-rich lipoproteins, TRLs)，使食物中的脂肪無法從體內循環中被清除，使得高血液中的 TRLs 升高。之前研究顯示當血中的 ApoC3 和 TRLs 過高的話，會造成高三酸甘油酯症(hypertriglyceridemia)；而如果抑制 ApoC3 的話，則應該可以促進脂肪代謝。而在這個研究裡，有一整個家庭，包括雙親和九個孩子，全部都缺少 APOC3 基因，即便他們喝了一杯充滿脂肪的奶昔，但血液中的脂肪量卻很少會上升。這個家庭雖然缺少 ApoC3，但身體健康，表示如果用藥物抑制 ApoC-III 來治療應該是安全的 [5, 6, 11]。
另一個跟 ApoC-III 類似情況的是 PCSK9。德州大學 Southwestern Medical Center 的心血管疾病專家 Helen Hobbs 說他和同事之前懷疑過，有些人的壞膽固醇(LDL, low-density lipoprotein)異常的低是因為 PCSK9 喪失功能。他們找到一位個案是 34 歲的女士，她的一對 PCSK9 都因為突變而喪失功能，造成她的 LDL 極低但身體卻是健康的。因為這個研究，藥廠發現可以用藥物抑制 PCSK9 來降低膽固醇 [1]。事實上，PCSK9 inhibtor 已經進入臨床試驗階段，今年三月的時候，結果發表在 NEJM 中 [10]。這個藥物是 Amgen 的 evolocumab (Repatha)，顯示不但可以降低血液中的膽固醇(up to 59%)，也可以在已經服用降膽固醇藥物 statins 的病患身上再降低 20% 因心血管疾病致死的風險 [4]。
註：為 The 1000 Genomes Project Consortium 的計畫，目的是深入了解 genotype (基因)和 phenotype (表現出來的徵狀)的關係， genotype 如何影響 phenotype [12]。其中合作者眾多，有 Baylor College of Medicine, Broad Institute (MIT, Harvard), Illumina, Life Technologies, Roche, Wellcome Trust Sanger Institute, Cold Spring Harbor Laboratory, EBI, Yale, Stanford 等等。
這個計畫下面有三個主要計畫：
1. 從四個族群裡選出 179 人做全基因底定序(low-coverage WGS)
2. 兩代基因定序(high-coverage WGS)，基本為父母和孩子三人的(mother-father-child trios)。
3. 從幾個族群裡選出 679 人做目標性定序(targeted sequencing)
Articles:
1.
J Kaiser, The Hunt for Missing Genes. Science (2014)
2.
J Kaiser, East London study to explore high disease rates in south Asians (2015)
3.
J Kaiser, Human ‘knockouts’ reveal genes we don’t need. Science (2016)
4.
H Ledford, Genome-based cholesterol drug boosts heart health. Nature (2017)
5.
J Kaiser, Human ‘knockouts’ may reveal why some drugs fail. Science (2017)
6.
Science News / Gene knockouts in people provide drug safety, effectiveness clues (2017)
7.
Science Daily / New genetic research can significantly improve drug development (2016)
Papers:
8.
DG MacArthur et al, A Systematic Survey of Loss-of-Function Variants in Human Protein-Coding Genes. Science (2012)
9.
VM Narasimhan et al, Health and population effects of rare gene knockouts in adult humans with related parents. Science (2016)
10.
MS Sabatine et al, Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease. NEJM (2017)
11.
D Saleheen et al, Human knockouts and phenotypic analysis in a cohort with a high rate of consanguinity. Nature (2017)
12.
The 1000 Genomes Project Consortium, A map of human genome variation from population-scale sequencing. Nature (2010)
