不需用細胞和病毒的中和抗體檢測

快速抗體檢測，這是之前新加坡大學和 Duke University 合作的那個，他們測的是體內的中和抗體(neutralizing antibodies)，就是可以和病毒結合，使它不能感染細胞，有抑制病毒作用的抗體。

要測體內是否有中和抗體，需要做抗體中和檢測(virus neutralization test, VNT)，簡單來說就是把抗體和病毒先混在一起 incubate，一個小時後再把抗體和病毒的混合物來拿來感染細胞，看看感染率有多少。中和抗體越多，可以抑制的病毒也就愈多，感染的細胞也就越少。通常這種檢測用的是原本的、活的病毒，所以要測新冠病毒的中和抗體的話，用的就是新冠病毒，不過如果要用新冠病毒，就需要 BSL3 的實驗室。在這篇論文裡，他們用的方法是 surrogate VNT (sVNT)，不需要用活的病毒，也不需要細胞，所以在 BSL2 實驗室就可以做，而且論文說他們在新加坡(n=175)和中國(n=50)的患者群身上測試結果，99.93% specificity (準確度) & 95-100% sensitivity (敏感度)。



相關文章：新冠病毒(SARS-CoV-2)的檢測 -- qPCR 和抗體

不用病毒，也不用細胞，要怎麼測試呢？因為我們已經知道新冠病毒感染是透過它的 spike protein RBD (receptor-binding domain) 和人類細胞表面的接受器 ACE2 結合而進入細胞的，所以他們認為只要在 ELISA plate 上測試就可以了，看了論文裡的圖示，其實就是普通的 ELISA，把 ACE2 coat 在 ELISA 上面，當作是細胞表面，然後把患者血清和 RBD 混合，RBD 已經是 HRP-conjugate，之後再把混合後的 Ab/RBD-HRP 加到 ACE2-coated ELISA plate，最後測訊號看看有多少 RBD 和 ACE2 結合，訊號越低的就表示血清裡中和抗體的含量越高。

他們還和兔子、老鼠、駱馬和人類的其他十五個 mAb 做比較，看看他們的 sVNP 是否能分別出普通抗體和有中和作用的抗體，結果顯示那些 mAb 在他們的 sVNP 檢測裡只有微弱的中和病毒的效用，有的甚至沒有，表示 sVNP 測到的是中和抗體的含量，而不是所有抗新冠病毒的抗體 [註]。

註：並不是所有抗新冠病毒的抗體都是中和抗體，有抑制病毒的效用，之前有研究顯示只有 anti-Spike S1 和 anti-Spike RBD 的抗體有抑制病毒的效用。

相關文章：近期和新冠病毒抗體相關的研究

除此之外，論文裡說他們的 sVNT 測的是所有中和病毒的 isotypes，也就是包括 IgG 和 IgM，不像其他大多數的抗體檢測，只有測 IgG 或 IgM。他們用了不同濃度的 IgM 和 IgG 抗體去測，都可以測到中和抗體，即便 IgG 和 IgM 量都很低，也可以測出中和抗體 70-90% 的抑制功效，表示他們的 sVNT 的敏感度很高。另外，他們也試了不同動物的中和抗體和普通抗體，也就是把 RBD 或整顆病毒打入動物體內，被打入 RBD 的動物體內產生的抗體便都會是有抑制效用的中和抗體，打入整顆病毒的可能只有部分是中和抗體，結果顯示皆可測到中和抗體，不過被打入 RBD 的動物血清抑制病毒的效力比較高。

最後，就是測試準確度了，看看 sVNT 是否可分別出 SARS, 新冠病毒和其他的冠狀病毒。實驗結果顯示感冒冠狀病毒(229E, NL63 or OC43)患者的血清裡並沒有測到可抑制新冠病毒的抗體，而 SARS 康復患者的血清內則有一點點，顯示有一點 cross-reactivity。不過當把 SARS sVNT 和 SARS-CoV-2 sVNT 放在一起比較的話，是可以看出分別的，SARS 康復患者的血清對 SARS RBD 的抑制效果比 SARS-CoV-2 要好。

雖然他們在 sVNT 裡 SARS 患者的血清和新冠病毒是有 cross-reactivity，但其他研究團隊用病毒和細胞系統的中和檢測(conventional VNT, cVNT)中是沒有的，所以這表示 sVNT 的敏感度比較高嗎？我覺得有意思的是 SARS 康復患者的血清裡仍測得到中和抗體，大家都知道 SARS 已經過去十七年了，這表示感染過 SARS 後，體內的抗體能維持十七年，而不是之前認為的只有三年嗎？他們有跟 2003 年時，感染不到一年後採的血清相比，十七年後血清內的中和抗體量是比感染不到一年時低，但也沒有說低很多。

他們也和普通的 cVNT 做比較，看結果是否一樣，sVNT 的結果是否可以轉譯成 cVNT，看起來結果是一樣的，表示 sVNT 應該可以取代 cVNT。剛需要花上兩三天的 cVNT 相比，sVNT 花的時間是要短得多，一天內可以搞定，不過論文中說只要一、兩個小時也 .... incubation 就兩個小時惹，再加處理血清和做 ELISA 本身的時間，總共也要花個三、四個小時吧，雖然他們用 RBD-HRP 就可以少一個小時的 incubation time, but still.... 不過它的好處是普通實驗室就可以做惹。



原論文：

CW Tan et al, A SARS-CoV-2 surrogate virus neutralization test based on antibody-mediated blockage of ACE2–spike protein–protein interaction. Nature Biotech (2020)

近期和新冠病毒抗體相關的研究

可能現在大家都知道 SARS 和 SARS-CoV-2 都是利用自身的 spike protein (S protein) 和人類細胞表面的 ACE2 結合而進入細胞的，因此阻斷 S protein 和 ACE2 的結合變成目前藥物研發的主要標靶，最近好幾篇研究都是關於用抗體去達到這個目的。

SARS-CoV-2 S protein 位於病毒的表面，是個醣化蛋白(glycoprotein)，會三個組成一體(trimer)。S protein 本身又大致分成三個 domains: N-terminal S1, S2 & C-terminal TM (transmembrane) domain，S1 和 S2 之間有個 furin cleavage site，S1 裡包含了 RBD (receptor-binding domain)，負責和 ACE2 結合，結合了之後 S1/S2 會被切開露出 S2，CoVs 的 S2 會進一步在 S2' site 再切割一次，這個切割會露出 S2 的 fusion peptide，可以讓病毒和細胞膜結合，使其進入細胞內。


Figure / Structure of 2019-nCoV S in the prefusion conformation (Wrapp et al, Science 2020)

Walls et al 發表在 Cell 的研究顯示 SARS-CoV-2 和 ACE 結合的 affinity 和 SARS 的差不多，他們也發現和 SARS不同的是 SARS-CoV-2 有個 furin cleavage site，SARS 的是一個 arginine (R)，SARS-CoV-2 則是 RRAR。SARS S protein 的 S1/S2 cleavage site 可以被細胞內蛋白酶 CatB/L (cathepsins B/L, cysteine protease) 和 TMPRESS2 (serine protease) 切割， 因此 Hoffmann et al 他們也測試了這兩個蛋白酶，看看他們是否也能切割 SARS-CoV-2 的 S protein，結果顯示除了 furin protease，SARS-CoV-2 也用 TMPRSS2，CatB/L 則是可有可無。另外，臨床使用的 serine protease inhibitor camostate mysylate，同時也是 TMPRSS2 inhibitor，也顯示可以抑制 SARS-CoV-2 進入細胞。如果和 CatB/L inhibitor E-64d 一起使用，則可以完全阻止病毒感染，在沒有 TMPRSS2 的情況下，SARS-CoV-2 也可以用 CatB/L。

Hoffmann et al 除了發現 SARS 和 SARS-CoV-2 都是透過 ACE2 進入細胞，而且帶有 ACE2 抗體的血清可以阻止這兩個病毒進入細胞外，也發現從 SARS 康復患者體內取出 anti-SARS 的抗體是 anti-S antibodies。他們取了三位 SARS 康復患者的血清測試，發現可以降低 SARS-CoV-2 感染，雖然效用比 SARS 較低。不過，他們把 SARS S1 打入兔子體內後產生的抗體可以有效抑制 SARS 和 SARS-CoV-2 感染細胞。另外，Walls et al 他們的結構研究顯示 SARS 和 SARS-CoV-2 的 S proteins 非常相似，SARS 的抗體很可能會和 SARS-CoV-2 有 cross-reactivity 而可以也抑制 SARS-CoV-2，於是他們把 SARS- S 打入老鼠體內，然後測試其產生的抗體是否能抑制 SARS-CoV-2，結果發現可以。由以上看來，對抗 SARS 的抗體或是疫苗可能對現在的 SARS-CoV-2 也多少有某種程度的效用。

不過，有趣的是之前 Cryo-EM 的那篇試了三個 SARS 的 anti-S RBD 的抗體(S230, m396, 80R)，想說竟然結構那麼像，不知道有沒有 cross-reactivity，沒想到那三個抗體都無法辨識 SARS-CoV-2。這個結果和 Walls et al 還有 Hoffmann et al 的不同的原因可能是因為這兩篇的研究產生的 polyclonal antibodies 可能抓到的是 S protein 的 S2 domain，而這篇用的是 anti-RBD (S1) antibodies。

相關文章：關於武漢病毒(SARS-CoV-2) Cryo-EM 那篇論文的閒聊

這個月，Scripps Research 的團隊在 Science 發表了 SARS 抗體和 SARS-CoV-2 結合的研究，他們發現 SARS 和新冠病毒和抗體的結合點幾乎一樣，也許是為什麼 SARS 抗體和 SARS-CoV-2 會有 cross-reactivity 的原因。他們研究的一個 SARS 的抗體 CR3022 是荷蘭的一家藥廠 Crucell Holland B.V. 於 2016 年從 SARS 康復患者體內釣出的，年初的時候有研究發現 CR3022 和新冠病毒有 cross-reactivity，於是 Scripps Dr. Wilson 的研究團段想知道這個抗體是怎麼和 SARS-CoV-2 結合的，結果發現這個抗體和 SARS 及 SARS-CoV-2 S protein RBD 結合的點非常相似。有趣的是病毒和 CR3022 的這個結合點和它和 ACE2 的結合點有些距離，因此不存在競爭的關係。另外，這個結合點在平常的狀態並不在病毒的表面，而是當 RBD 處於某種狀態下才會出現在表面的地方。在細胞實驗中，CR3022 雖然可中和 SARS，但卻無法中和 SARS-CoV-2。因為有太多迷點，所以目前還不了解和 CR3022 的這個結合點在病毒感染的真正功能是什麼，不過至少知道這個抗體是用不同的機制來抑制病毒感染。



Articles:

TN / Clues to SARS-CoV-2 Vulnerability Emerge (April 2020)


Publications:

AC Walls et al, Structure, Function, and Antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein. Cell (2020)

M Hoffmann et al, SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell (2020)

M Yuan et al, A highly conserved cryptic epitope in the receptor-binding domains of SARS-CoV-2 and SARS-CoV. Science (2020)

D Wrapp et al, Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science (2020)

UBC 研發的藥物將進入臨床試驗 -- soluble hrsACE2

前兩天 Cell 刊登了之前 UBC 研發用來治療 COVID-19 的藥物 [1]，這個研究有多個團隊參與，包括了溫哥華的生技公司 STEMCELL Techonologies。他們研發的藥物 APN01 (human recombinant soluble angiotensin-converting enzyme 2; hrsACE2) 很快便會進入臨床試驗，由歐洲的生技公司 Apeiron Biologics 進行。


這個研究團段已經研究 SARS 很久了，在之前的研究中，知道了：

1. SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都是透過 spike protein 的 RBD (receptor-binding domain) 和人類的 ACE2 結合而進入細胞 [2]。
2. SARS-CoV-2 和 ACE2 的 affinity 比 SARS 強
3. 老鼠實驗中，大量表現 ACE2 的基轉老鼠在感染 SARS 後的病況比較嚴重 [2]。
4. ACE2 除了表現在肺部的表皮細胞，也表現在心臟、腎臟、血管和腸胃細胞，這可能是為什麼有些病患有腸胃道等等的症狀 [1]。
5. 之前的細胞實驗顯示 protease inhibitor camostat mesylate 可以抑制 SARS-CoV-2 的繁殖
6. hrsACE2 已在 2017 年時進入第一、二期的臨床試驗，原本是要用來治療 ARDS (acute respiratory distress syndrome, 急性呼吸窘迫症候群) [3]。


Figure / Possible intervention of SARS-CoV-2 replication (Science 2020, doi:10.1126/science.abb8497)

說是藥物，其實 hrsACE2 就是合成的人類 ACE2，他們的想法是既然 SARS-CoV-2 是透過 ACE2 進入細胞的，那他們就把大量的合成 ACE2 打入體內，使他們和病毒結合，當病毒表面的 RBD 都被合成的 ACE2 塞滿之後，就沒辦法再和細胞表面的 ACE2 結合了，進而達到抑制病毒感染的效果，跟抗體藥類似的概念。

在他們的細胞實驗中，hrsACE2 可以有效的中合病毒，使其無法接觸 ACE2 和進入細胞，但是老鼠的 mrsACE2 便沒有抑制的效果。然後他們試驗在基改的小血管和腎臟，受到 SARS-CoV-2 感染的基改器官在感染的三到六天後都可以檢測到病毒，而加惹 hrsACE2 後則明顯地降低了病毒感染；同樣的，老鼠的 mrsACE2 則沒有抑制 SARS-CoV-2 感染的效果。

要注意的是：
1. hrsACE2 跟其他的抗體一樣，無法完全抑制病毒感染，抑制效果和劑量相關，但也不排除有除了 ACE2 之外的 co-receptor 的可能。
2. hrsACE2 主要是抑制病毒進入細胞，如果病毒已進入細胞，hrsACE2 就沒有太大作用。
3. 這個實驗著重在血管和腎臟細胞，但 SARS-CoV-2 感染的主要器官是肺部。



Articles:

UBC News / Trial drug can significantly block early stages of COVID-19 in engineered human tissues

Science / WHO launches global megatrial of the four most promising coronavirus treatments (March 2020)


Publication:

1. V Monteil et al, Inhibition of SARS-CoV-2 infections in engineered human tissues using clinical-grade soluble human ACE2. Cell (2020)

2. K Kuba et al, A crucial role of angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) in SARS coronavirus-induced lung injury. Nature Medicine (2005)

3. Y Imai et al, Angiotensin-converting enzyme 2 protects from severe acute lung failure. Nature (2005)

關於武漢病毒(SARS-CoV-2) Cryo-EM 那篇論文的閒聊

應該有人已經看過這篇論文了，是武漢病毒(SARS-CoV-2)的 cryo-EM，沒想到這麼快就做出來了。

簡單介紹一下這個病毒的 background：

1. enveloped, (+)RNA viruses：病毒的特點就是自帶基因和蛋白很少，都是用宿主細胞的，越小的病毒越是如此。（就像是平常住外面、兩三個禮拜回家一次的人，回去不用帶太多東西，因為可以用家裡的，可能只要帶牙刷、手機和錢包回去就好惹。XD）

2. 大部分病毒的主要自帶基因分為兩種：structural 和 non-structural (NS)。Structural 是組成病毒實體的蛋白，例如 envelope proteins 和 capsid proteins。Non-structural 則是負責病毒複製，例如 transcription factors (TFs) 或是 RNA polymerase (RdRp)。武漢病毒主要的自帶基因有 spike protein (S protein, 屬於 envelope protein), nucleoprotein (N protein), RNA polymerase。同一個家族的病毒通常自帶的基因都差不多，例如武漢病毒和 SARS 都自帶 spike protein 和 N protein。


Figure / Betacoronavirus virion (ViralZone 2020)

3. 武漢病毒和 SARS 的 spike protein 相似度為 86%，和蝙蝠冠狀病毒 RaTG13 的相似度則高達 98%，主要的差異是武漢病毒有一段 "RRAR" furin recognition site，而蝙蝠 RaTG13 和 SARS 的 protease cleavage site 則是只有一個 arginine (R)，在流感病毒裡，其 hemagglutinin protein 帶有 furin binding site 的通常是毒性比較強的病毒株。除此之外，武漢病毒和 RaTG13 S protein 的 RBD 有十七個氨基酸不同。

4. 跟 SARS-CoV 屬於同樣的 species，進入宿主細胞的機制也差不多，是經由它表面的 spike protein 結合宿主細胞的 ACE2 (angiotensin-converting enzyme 2)。

5. Spike protein 是個 glycoprotein，也就是說它會被醣化(glycosylated)。通常 envelope viruses 的表面蛋白(envelope protein)是 glycoprotein。S protein 的結構主要分為幾個 domains：SS (signal sequence), NTD (N-terminal domain), RBD (receptor-binding domain), SD1/2 (subdomain 1, 2), TM (transmembrane domain) 和 CT (C-terminal tail) 等等其他一些小的 domains。三個 S proteins 會結合在一起形成一個 trimer，然後和 ACE2 接合以進入宿主細胞，負責和 ACE2 結合的為 RBD。

我朋友是做 protein binding 研究的，看到這篇的重點是 SARS 和 SARS-CoV-2 的 spike protein 結構非常像，但是抗體竟然沒有 cross reactivity，幾個已發表的 SARS-CoV RBD-specific 抗體都對 SARS-CoV-2 沒反應。而我純化蛋白做太多了，看到的重點都是怎麼純化這個蛋白。XD

1. 竟然可以從 293 cells 純化到 0.5mg/L 的蛋白。
2. 純化它的 ectodomain (1-1208)就夠研究和 ACE2 的 binding。
3. 純化它的 ectodomain 只要過兩個 columns：affinity + SEC，而且在 SEC 是只有一個 670kDa 的 single peak。


* RaTG13 spike protein: QHR63300.2
* SARS-CoV spike protein: NP_828851.1
* SARS-CoV-2 spike protein: QHD43416.1



原論文：

D Wrapp et al, Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science (2020)

關於謠言 | 武漢病毒的源頭到底是哪裡？

之前盲眼的尼安德塔石器匠已經寫過了，這篇只是我自己的整理。


Figure / Coronavirus virion (Scientific Animation)

1.
美國 University of North Carolina 於 2015 年十一月，發表了一篇關於 SARS 的研究在 Nature Medicine，說明 SARS 是依靠它的表面蛋白 SHC014 從動物身上傳染到人類身上的。SARS 和 MERS 原本是寄生在其他動物身上的，是怎麼跨物種傳染到人類身上呢？研究顯示中國蝙蝠帶的類 SARS 病毒 RsSHC014-CoV 和人類 SARS 病毒的 SCH014 序列很相似，但是有 15 個氨基酸不同，而這些不同決定 SCH014 是否能和人類的血管酵素(angiotensin converting enzyme II, ACE2)結合。他們把可以感染老鼠的 SARS-CoV 病毒改成可以表現蝙蝠冠狀病毒的表面蛋白 SHC014，結果顯示這個基改冠狀病毒可以和人類的血管收縮轉化酶(angiotensin converting enzyme II, ACE2)結合，並且可以有效的在人類呼吸道細胞中複製繁殖，顯示蝙蝠冠狀病毒很可能透過 SHC014 突變而傳染到人類身上。這篇研究出來以後引發許多討論，認為這類研究太危險，要是基改後的病毒不小心外洩可能會造成很大的問題。NIH 其實在 2013 年就決定停止給這類危險病毒的相關研究 funding，會給這個研究 funding 是因為可以幫助科學家們了解 SARS 的傳染機制，同時這個研究也在法令公佈之前就開始了。

2.
2017 年的時候，Nature 發了一篇關於中國蓋 BSL-4 實驗室的文章，最近被拿出來討論，因為網傳說這次的武漢病毒和其 BSL-4 lab 有關。中國在 2003 年的時候決定在武漢蓋第一個 BSL-4 級的實驗室，但因為種種因素，直到 2014 年年底才完成。實驗室有分四個等級，普通大學裡的只到 BSL-2，如果研究有用到癌症細胞或是人類病毒之類的，需要 BSL-2，通常做研究的都會用到，會有一個專屬的負壓細胞培養小房間。BSL-4 是最高等級，加拿大只有一個，就是 Winnepeg 的那個 National Microbiology Laboratory，會用到這個等級實驗室的有伊波拉病毒和 SARS。

武漢實驗室蓋完開始用之後，引來了一些質疑，像是中國是否可以 use it properly，尤其在他們官僚文化嚴重的情況下，是否會遵守只用規則。除此之外，中國還在哈爾濱、北京和昆明還再蓋共三個 BSL-4 lab，這也讓人質疑，中國是否需要那麼多個 BSL-4 lab，尤其是北京的 BSL-4 lab 曾外洩 SARS 多次。

3.
最近病毒分析結果認為和武漢病毒最相近的是雲南蝙蝠帶有的 RaTG13，而這株病毒為武漢病毒所擁有，上週武漢病毒所的石正麗發表在 Nature 的研究顯示武漢病毒和 RaTG12 的相似度為 96.2%，和 SARS 則只有 79.5%。另外，Nature Medicine 那篇基改 SARS 的研究石正麗也有參與，於是謠言四起，2017 年的那篇文章[2]因此最近在前面加了這段表示謠言未經證實，科學家們認為來源為那個市場："Editors’ note, January 2020: Many stories have promoted an unverified theory that the Wuhan lab discussed in this article played a role in the coronavirus outbreak that began in December 2019. Nature knows of no evidence that this is true; scientists believe the most likely source of the coronavirus to be an animal market."



News:

The Scientist / Lab-Made Coronavirus Triggers Debate (2015)

Nature / Inside the Chinese lab poised to study world's most dangerous pathogens

Science / Mining coronavirus genomes for clues to the outbreak’s origins (2020)


Publication:

VD Menachery et al, A SARS-like cluster of circulating bat coronaviruses shows potential for human emergence. Nature Medicine (2015)

P Zhou et al, A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature (2020)