新冠病毒(SARS-CoV-2)檢測 -- qPCR 和抗體檢測（續）

有看中研院那篇的就知道，目前檢測新冠病毒的方法有三：

1. qPCR：檢測體內是否有病毒 RNA，知道 primers 就可以用來檢測，不需要另外研發，相對準確，敏感度高(sensitivity)，但需四到六小時，包含運送檢體時間等等的 turnaround time 至少要一天。不過目前 UCSF, Mammoth 和加州 Public Health 部門合作研發的 SARS-CoV-2 DETECTR 利用 CRISPR 技術似乎可以快速檢測，加上 RNA extraction 的時間只要 45 分鐘。

2. 用抗體檢測體內抗原(也就是病毒)：跟 qPCR 比起來準確度較低(需要注意有沒有 cross-reactivity)，也需要時間研發，但是檢驗方法簡單，速度也快，turnaround time 約二十分鐘到一小時。（下圖的第三種 sandwich assay）

3. 用抗原(也就是病毒蛋白)檢測體內是否有抗體：研發時間沒上面那個長，比較簡單，檢驗方法也同樣簡單和快速，但需要等到症狀出現後，病患體內產生抗體才測得到，通常是用來追蹤是否曾經感染過。（下圖的第一種 direct assay 或第二種 indirect assay）

相關文章：新冠病毒(SARS-CoV-2)的檢測 -- qPCR 和抗體


Figure / Diagram of common ELISA formats (direct vs. sandwich assays)(Thermo Fisher)

註：抗體檢測的原理跟 ELISA 相同，可以固定抗原(antigen)去測體內抗體(antibody)，如上圖的第一種和第二種，這種只要有抗原就可以測，或是固定抗體去測體內是否有抗原，如上圖中的第三種，這種比較需要花時間先去研發出好的抗體。

相關文章：簡單檢測新冠病毒抗體

Nature 的這篇介紹了幾個正在研發的抗體檢測，第一個介紹的就是中研院楊老師的那個 LFIA！和大多數用 S (spike) protein 做抗原的抗體檢測不同的是中研院用的是 N (nucleocapsid) protein，其中一株抗體和 SARS 還有其他種冠狀病毒的 spike protein 沒有 cross-reactivity。不過看了這篇才知道，中研院的抗體是用 AI 去模擬 Ag-Ab interactions 後製造出來人造抗體 libraries，然後再用 phage display 去抓出抗體，而不是用動物去製造抗體，或是從康復患者體內釣出來，因此省掉了兩個月的時間。（也就是說中研院有抗體的基因序列，可以大量生產，也許可以測試是否能用於治療，不過我覺得 anti-spike 的抗體應該會比較有效果。）

相關文章：Phage display 和小抗體製造


Figure / Schematic representation of a LFIA device (Banerjee et al, Analyst 2018; doi: 10.1039/C8AN00307F)

抗體檢測大多用 LFIA (lateral flow immunoassay) 式的快篩，原理跟 ELISA 相同，只是長得像驗孕棒 XD。如上圖的 LFIA 所示，用的是 sandwich assay，也就是把抗體固定在檢測棒上面，然後先讓(可能含有病毒)的血液和帶有染劑的抗體混合，然後讓混合後的血液和抗體流過檢測棒，如果有血液含有抗原(也就是抗原)的話，就會被固定在檢測棒的抗體抓住。另一條 control line 是抓多餘的帶有染劑的抗體，也就是確認有足夠的抗體，並且有作用。因此如果血液中有病毒的話，就會有兩條線，沒有的話就會只出現 control line 那條線。

第二個介紹的是加拿大的公司 Sona Nanotech (Halifax-based)，他們是和 GE 合作研發的 LFIA，抗原用的是 spike protein 的 S1 domain，目前預估是六到八週內可以有供研究使用的產量。

如最之前說的，檢測體內是否有對抗病毒的抗體相對簡單，只要純化出抗原就可以下去測了，德國柏林的 Pharmact 已經有二十分鐘的抗體快篩檢測，用的抗原是 N protein 和 spike protein 的 S1 和 S2 domain，可以用來檢測患者體內是否有這兩個病毒蛋白的抗體，這個快篩可以檢測到 IgM 和 IgG，IgM 是人體受感染後最先產生的抗體，之後再產生 IgG。他們和 qPCR 結果做比較，結果顯示準確度很高 -- 100% true negative 和 0% false positive，不過缺點是敏感度低，因為一開始的 IgM 反應並不高，感染後的 4 - 10 天內測到的敏感度只有 70%，但是第 11 天到第 24 天可以測到 92.5%，IgG 在這幾天測到的比例也高達 98.6%，因此整體 false negative 比例約為 13%。

關於患者體內的免疫反應可參考：武漢肺炎輕症患者體內的免疫反應


其他相關文章：關於武漢病毒(SARS-CoV-2) Cryo-EM 那篇論文的閒聊



Article:

Nature / Fast, portable tests come online to curb coronavirus pandemic (March 2020)


Papers:

JP Broughton et al, Rapid Detection of 2019 Novel Coronavirus SARS-CoV-2 Using a CRISPR-based DETECTR Lateral Flow Assay. MedRxiv (2020)

R Banerjee & A Jaiswal, Recent advances in nanoparticle-based lateral flow immunoassay as a point-of-care diagnostic tool for infectious agents and diseases. Analyst (2018)

簡單檢測新冠病毒抗體

這篇研究提供了簡易的檢測方法，而且有詳細的 protocol，不過還沒有經過 peer-review (這篇之後在五月時刊在 Nature Medicine)，研究團隊是在紐約的 Icahn School of Medicine at Mount Sinai。總之非常簡單，有在純化蛋白和做 ELISA 的實驗室都可以做到，不需要 P3 實驗室，就差能不能自己抽血而已。（好想試 XD）

主要是純化抗原，然後用 ELISA 檢測人體內是否有新冠病毒的抗體，之前澳洲得那篇研究顯示在症狀開始後第七天，患者血液裡可以測到 IgM，這篇則是在症狀開始的第三天就可以檢測到抗體。（如果不懂抗體檢測的，可以去看中研院的那篇解釋。XD）

相關文章：武漢肺炎輕症患者體內的免疫反應

抗原：
1. Spike-thrombin-foldon-6xHis
2. SS-RBD-6xHis

- SARS-CoV-2 Spike protein (full-length): M1-P1213; GenBank MN908947.3
- RBD (receptor-binding domain): R319-F541
- SS: signal peptide (M1-S14)
- thrombin: thrombin cleavage site
- foldon: T4 foldon (trimer)

Expressing vectors:
1. mammalian: pCAGGS; Epi293F cells
2. baculovirus: pFastBacDual

Purification:
1. Ni-NTA (room temp)
2. Buffer exchange to PBS

Human serum samples:
1. 大概五十個血清庫裡的檢體，年齡範圍在 20 到 65 歲以上，應該都是健康個體，是用來檢測 ELISA 的背景訊號的，確認檢測的 specificity。
2. 三位康復患者的血清
3. 十二位新冠病毒急性患者的血清

患者血清檢體：
1. 新冠病毒患者症狀開始後第二、四、六和二十天
2. 新冠病毒患者康復後(同個體)：症狀開始後第三十天
3. 冠狀病毒 NL63 和 229E 的患者：NL63 也是用 ACE2
4. 其他傳染病患者康復後：包括登革熱患者

註：會引起疾病的人類冠狀病毒至少有七種，其中有四種是全球季節性的，未引起輕微的呼吸道疾病，包括有 HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 和 HCoV-229E，其中 NL63 和 229E 為 alphacoronavirus，另外兩個則是 betacoronavirus。會引起重症的 SARS 和 MERS，以及目前的 SARS-CoV-2 也是 betacoronavirus。

ELISA:
1. Coating: 2 ug/ml (in PBS), 50 ul/well, O/N at 4C
2. Blocking: 3% milk (PBS-T), 1h at room temp
3. Serum: diluted in 1% milk/PBS-T, 2 hrs at room temp
4. 2'Ab: goat-anti-human IgG HRP (1:3000, in PBS-T), 1 h at room temp


Figure / Reactivity of control and SARS-CoV-2 convalescent sera to different spike antigens (Amanat et al, medRxiv 2020)


結果：

1. 在 mammalian cells 裡的表現竟然比較好，mRBD (mammalian RBD) 可以達到 25-50 mg/L，mSpike (mammalian Spike) 也有 5 mg/L，RBD 的表現在 insect cells (iRBD) 則只有 1.5 mg/L，iSpike (insect Spike) 也只有 0.5 mg/L。

2. 在 insect cells 裡表現的 RBD 大小比在動物細胞裡較小，可能是因為在動物細胞裡表現的有被醣化，所以在蛋白膠上顯現的 band 會比較高。

3. 症狀出現後第三天就可以測到抗體

4. 所有新冠患者的血清都和 Spike 還有 RBD 有強烈反應，對 Spike 的反應比 RBD 強，其他傳染病患者的血清則沒反應。

5. 用 mRBD 和 mSpike 測出來的康復患者血清和健康個體血清的差距比較大，相較於 iRBD 和 iSpike，差距比較顯著。

6. 冠狀病毒 299E 和 NL63 患者的血清也對新冠病毒的 Spike 和 RBD 沒反應，表示沒有 cross-reactivity。

7. ELISA 的結果也可以分辨出其他傳染病患者和康復後的新冠患者。

8. 抗體 CR3022 對 mSpike 和 mRBD 有強烈反應。（關於 CR3022 可參考這篇：近期和新冠病毒抗體相關的研究）

9. 那五十幾個血清庫裡的血清對 mRBD 和 mSpike 沒反應，但是大多數卻對 229E 和 NL63 的 Spike protein 有強烈反應。

10. 有反應的抗體種類為 IgG3, IgM 和 IgA

11. 基於安全考量，他們也是惹 heat inactive serum，效果和沒有 heat-inactivated treated serum 差不多，一樣可以測到抗體，表示不需要 P3 實驗室就可以做。

12. 有不少新冠病毒康復患者的血清可以中和病毒，實驗結果顯示可以抑制病毒感染，這和 US CDC Okba et al 發表的結果是一致的。



Article:

Science / New blood tests for antibodies could show true scale of coronavirus pandemic (March 2020)


Papers:

F Amanat et al, A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine (2020)

F Amanat et al, A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in human. medRxiv (2020)

Okba et al, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2−Specific Antibody Responses in Coronavirus Disease 2019 Patients. US CDC Emerging Infectious Diseases (2020)

鬧血荒怎麼辦？把血液全部變成 O 型血！

血型的不同在於它們表面帶有不同的抗原(antigen)和抗體，血型 A 型的紅血球表面帶有 Type A antigen 和抗體 anti-B，B 型的人帶有 Type B antigen 和抗體 anti-A，AB 型的則帶有 A, B 兩種抗原但是不帶有抗體，O 型的人則不帶有抗原，但是帶有 anti-A 和 anti-B 兩種抗體。


Figure / Blood Groups and Red Cell Antigens - Chapter 5 The ABO blood group

抗原和其對應的抗體相結合，例如抗原 Type A antigen 和抗體 anti-A 結合的話就會引發免疫反應造成溶血(hemolysis)，所以不同血型的人不能互相輸血，但是 AB 型的人可以接受所有人的血，因為他不帶有抗體，而 O 型可以捐血給所有人，因為它不帶有 A, B antigens 。

如果血庫缺少某種血或需要某種血怎麼辦？要是可以把所有的血全部變成 O 型血就好了，這樣不管需要哪種血都可以輸 O 型血。

UBC 的研究團隊在這篇研究中，發現人類的腸道菌中有兩種酵素可以把紅血球上的 Type A antigen 移除使它變成 O 型。紅血球表面的抗原，其實就是不同的醣連結 (carbohydrate chains)，A 型的比 O 型的多帶了個 GalNAc (N-acetylgalactosamine)，B 型的則是多帶惹 galactose。

他們掃了上萬個腸道菌基因，發現腸道菌 Flavonifractor plautii 的兩個酵素 N-acetylgalactosamine deacetylase (GalNAc deacetylase) 和 α-galactosidases (GalNase)，這兩個酵素合作的話，可以有效去除紅血球上的 Type A antigen，也就是把某部分的醣切掉，使它變成成 O 型紅血球上較短的醣連結。同理，也可以把 B 型紅血球表面的抗原去除，使它變成 O 型。


Figure / Blood Types and Carbohydrate Chemistry

UBC 團隊目前只試惹 A 型血，因為它比較普遍。不過，真的要用於輸血之前，要先有確認所有的 A 型紅血球都有被轉換成 O 型才行。


Article:

Science News / Type A blood converted to universal donor blood with help from bacterial enzymes (June 2019)


Paper:

P Rahfeld et al, An enzymatic pathway in the human gut microbiome that converts A to universal O type blood. Nature Microbiology (2019)