這集的標題雖然是駱馬的小抗體(nanobodies)，但前半個小時是討論中國的 CoronaVac，同時他們也收到很多 email 詢問為什麼美國不也做 inactivated virus vaccine。
第一個用病毒做的疫苗是 Edward Jenner 的天花疫苗(smallpox, 1798)，為 inactivated Vaccinia virus。第二個 Pasteur 的狂犬病疫苗(rabies, 1885)，再來是黃熱症疫苗(yellow fever, 1935)和流感疫苗(influenza, 1936) [1]，流感疫苗剛開始是給軍方用，因為在第一次世界大戰時美軍人力因流感而有所損失 [2]。
至於為什麼美國不用病毒做新冠病毒的疫苗呢？他們解釋是美國已經研發其他種類的疫苗很久了，包括 mRNA 疫苗和 subunit 疫苗，所以可以直接拿來用，加上大藥廠已經砸很多錢在研發新型疫苗，因此拿來研發新冠病毒疫苗相對來講反而是比較簡單的。另一個可能原因是用病毒做疫苗需要用到 BSL3 的實驗室，不方便大量生產。
關於中國的 CoronaVac，他們提到 inactivated virus vaccine 通常是用 UV 或福馬林(formalin)去 inactivate viruses，但中國的這支疫苗是用 β-propiolactone (C3H4O2)，雖然它也被用來 inactivate viruses，不過它會和蛋白質反應，可能會改變蛋白結構，而且最近有幾篇研究顯示 β-propiolactone 會使 Spike 的 S1 脫離 [3, 4]，而可讓免疫系統產生中和抗體的 RBD 就在 S1，如果新冠病毒疫苗少惹 S1，那疫苗效用還剩多少？另外，如果要做 inactivated viruses，也會先評估用來 inactivate 的物質會不會改變病毒結構，是否每個 batch 的品質都穩定一致。之前的疫苗之所以用 inactivated viruses，是因為當時那個年代的技術就只能用 inactivated viruses，並不是因為它比較安全，如今的科技使疫苗不再局限於用 inactivated viruses。
相關文章：近期和新冠病毒抗體相關的研究
裡面還有一段對話滿好笑的(30:25)，CoronaVac 的臨床實驗是 Phase I/II 合在一起，通常是 Phase I 安全測試過了以後，換一批測試者做 Phase II。SinoVac 是一二期一起做，第一期只有七天，七天後如果沒出現問題就進入 Phase II [5]。然後其中一位就說，因為是用 inactivated viruses，如果真的有問題的話，七天後試驗者可能就掰掰了，既然七天後沒人死，就表示疫苗算是安全的。XD
(33:50) "... that the Chinese government enlisted army personnel for at least one of the phases for their trial and I thought we were critical of that for a while, but I think that's no longer a criticism."
".... yeah, we got a lot of pushback from people in China who said this is often done and it is often done, but they said it was licensed and it was actually a Phase II trial, so they should have just said it's a Phase III trial, right? instead of saying it was licensed for you."
"I think the issue there was is it okay to do that in troops, ..... I think I pointed out the U.S. can't exactly get on a moral high horse about what's been done."
還有一段莫名戳中我的笑點，是討論到 Phase III 是在中國、巴西和土耳其做的，最近還加了印尼。
(44:10) "I don't think they had enough cases in China to do the Phase III, right?"
"I think because at that point the pandemic was really under control such through lockdowns in China, they were actually having a hard time getting cases for their clinical trials, but uhh unfortunately, plenty of other countries had plenty of cases."
之後駱馬小抗體的部分是討論德國研究團隊於上個月發表在 Science 的研究。之前有提過駱馬除了正常的 IgG，還有一種只有 heavy chain 的抗體 HCAb，以及釣出小抗體的噬菌體展示(phage display)。
相關文章：Phage display 和小抗體製造
在這篇之前，德州大學(U Texas)也在去年發表過他們抗 SARS 的小抗體，他們是把 SARS Spike 打入駱馬體內，然後釣出小抗體，經過 cyro-EM 分析發現效果最好的小抗體 VHH-72 是把 Spike RBD 固定在某個 conformation，使它無法動。他們把這個小抗體測試在假新冠病毒上(pseudovirus)，發現它也可以抑制新冠病毒。
相關文章：從駱馬體內得到的新冠病毒小抗體
德國的這個研究則是把新冠病毒的 Spike RBD 和用福馬林去活性過的新冠病毒打入駱馬後釣出小抗體，然後測試這些小抗體的中和效用(neutralizing activity)，發現其中一株中和效果最強的小抗體 VHH E 的 IC50 可到 60 nM [6]。VHH E 和其他小抗體不太一樣，它的 CDR3 特別長，雖然和 ACE2 結合的點和之前發現的小抗體 CC12.3 和 H11-D4 相同，但方向不一樣。之前研究發現，Spike RBD trimer 通常處在一個 up & down conformation 平衡的一個狀態，較常發生的狀態是沒有或三個中只有一個 RBD 處於 up conformation。雖然三個 RBD 都為 up conformation 的狀態很少見，但只有 up conformation 才可以和 ACE2 結合，只是不知道需要幾個 RBD 為 up conformation。
他們用 cryo-EM 分析 VHH E 和 ACE2 結合的狀態，發現和 VHH E 結合的大多是三個 RBD 都為 up conformation，並且各和一個 VHH E 結合，顯示 VHH E 會把 RBD 固定在 3-up conformation，而且一旦結合，RBD 就無法變回 down conformation。不免俗的，也要試試把兩、三個 VHH 連在一起看看效果會不會更好，當然也是用常用的 (GGGS)3 linker，結果發現 IC50 可以降到 pM range (930 pM for VHH EE, 520 pM for VHH EEE)。這篇研究和其他不同的地方是他們還有測試哪些突變會逃過 VHH 的中和作用，有趣的是如果某個突變可以逃過某個 VHH，大多的情況是它會對其他 VHH 更敏感，所以如果把兩個不同的 VHH 結合在一起，便沒有突變可以逃過 VHH。相反的，雖然 VHH EEE 有很強的中和作用，single mutantion 就可以讓病毒逃掉。
References:
1. S Plotkin, History of vaccination. PNAS (2014)
2. US CDC / Influenza Historic Timeline
3. Y Cai et al, Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science (2020)
4. AV Letarov et al, Free SARS-CoV-2 Spike Protein S1 Particles May Play a Role in the Pathogenesis of COVID-19 Infection. Biochemistry (2020)
5. Z Wu et al, Safety, tolerability, and immunogenicity of an inactivated SARS-CoV-2 vaccine (CoronaVac) in healthy adults aged 60 years and older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1/2 clinical trial. The Lancet (2021)
6. P Koenig et al, Structure-guided multivalent nanobodies block SARS-CoV-2 infection and suppress mutational escape. Science (2021)
2021年2月6日 星期六
2020年11月20日 星期五
抗新冠病毒的合成小抗體 sybodies
之前美國德州大學的研究團隊首先發表 Spike protein cyro-EM structure 後不久，又發表了一篇從駱馬身上釣出抗新冠病毒的小抗體 nanobodies。
相關文章：從駱馬體內得到的新冠病毒小抗體
nanobodis 是什麼呢？駱馬和鯊魚體內除了有普通的 IgG 之外，還有一種只有 heavy chain 的小抗體 HCAbs，其辨識抗原的 Fv (variable region)為 VHH，又稱為 nanobodies，近幾年因為體積小，相較傳統 IgG 易純化，開始受到注目。
相關文章：關於抗體和抗體藥的一些小知識
駱馬和鯊魚體內產生的小抗體是天然的，需要先把抗原打進駱馬體內，等牠們產生抗體後，從牠們的免疫細胞內抽出抗體的基因序列製造成 libraries，再用噬菌體展示(phage display)的技術釣出抗抗原的小抗體，這個普遍抓抗體的方法雖然不難，但費時費力，而且你需要先找到駱馬用 XD。
相關文章：Phage display 和小抗體製造
2018 年的時候，瑞士蘇黎世大學的研究團隊研發了三個針對細胞膜蛋白(membrane proteins)不同面的人造合成小抗體 libraries，這三個 libraries 的不同主要在於 CDR3 的長度，不同的長度會和蛋白表變不同的地方結合[註1]，而從這些 libraries 釣出來的合成小抗體(synthetic nanobodies) 稱為 sybodies。
註1：他們把這三個 libraries 稱為 concave, loop, convex。Concave 的 CDR3 比較短，只有六個氨基酸長，主要透過它們 concave surface 和抗原結合。 Loop 的 CDR3 則是中長度(12 a.a.)，是一個 loop 的形狀，可以進到接受器(receptor)的 cavity 而結合。Convex 的 CDR3 最長(16 a.a.)，會形成一個 hydrophobic core 和抗原結合。
Figure / Selection of sybodies against membrane proteins within three weeks (Zimmermann et al, eLife 2018)
EMBL Hamburg 的研究團隊這個月在 Nature Comm 發表了他們的研究，他們從三個 sybody libraries 裡共釣出 85 個合成小抗體，純化了其中 62 個後，檢測了它們的 binding affinity，其中有六個和 Spike RBD 結合力很強，Kd 範圍約為 10 nM - 60 nM，其中以 Sb23 這株小抗體最強。
小抗體的結合力強，那是否有抑制病毒的作用呢？他們掃了 36 個小抗體，測試它們的中合力(neutralizaiton activity)，發現其中十一個小抗體的 IC50 < 20 ug/ml，六個的 IC50 < 5 ug/ml，Sb23 的 IC50 則只有 0.6 ug/ml (48 pM)，當它和 Fc 接在一起後，IC50 可達到 0.007 ug/ml (0.56 pM)，未來有望用於治療。
IC50 用 ug/ml 來表示真是不習慣啊，於是我把它換算成 pM 惹。
Sb23 (MW = 12.5 kDa)
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFPVESENMHWYRQAPGKEREWVAAIYSTGGWTLYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAVQVGYWYEGQGTQVTVS
Articles:
EMBL Press release / cientists identify synthetic mini-antibody to combat COVID-19
TN / Synthetic Mini-Antibody Binds to and Neutralizes SARS-CoV-2 (Nov 2020)
Addgene blog / No Llamas Required - Synthetic Nanobodies Against Membrane Proteins (June 2020)
Papers:
TF Custodio et al, Selection, biophysical and structural analysis of synthetic nanobodies that effectively neutralize SARS-CoV-2. Nature Comm (2020)
I Zimmermann et al, Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife (2018)
相關文章：從駱馬體內得到的新冠病毒小抗體
nanobodis 是什麼呢？駱馬和鯊魚體內除了有普通的 IgG 之外，還有一種只有 heavy chain 的小抗體 HCAbs，其辨識抗原的 Fv (variable region)為 VHH，又稱為 nanobodies，近幾年因為體積小，相較傳統 IgG 易純化，開始受到注目。
相關文章：關於抗體和抗體藥的一些小知識
駱馬和鯊魚體內產生的小抗體是天然的，需要先把抗原打進駱馬體內，等牠們產生抗體後，從牠們的免疫細胞內抽出抗體的基因序列製造成 libraries，再用噬菌體展示(phage display)的技術釣出抗抗原的小抗體，這個普遍抓抗體的方法雖然不難，但費時費力，而且你需要先找到駱馬用 XD。
相關文章：Phage display 和小抗體製造
2018 年的時候，瑞士蘇黎世大學的研究團隊研發了三個針對細胞膜蛋白(membrane proteins)不同面的人造合成小抗體 libraries，這三個 libraries 的不同主要在於 CDR3 的長度，不同的長度會和蛋白表變不同的地方結合[註1]，而從這些 libraries 釣出來的合成小抗體(synthetic nanobodies) 稱為 sybodies。
註1：他們把這三個 libraries 稱為 concave, loop, convex。Concave 的 CDR3 比較短，只有六個氨基酸長，主要透過它們 concave surface 和抗原結合。 Loop 的 CDR3 則是中長度(12 a.a.)，是一個 loop 的形狀，可以進到接受器(receptor)的 cavity 而結合。Convex 的 CDR3 最長(16 a.a.)，會形成一個 hydrophobic core 和抗原結合。
Figure / Selection of sybodies against membrane proteins within three weeks (Zimmermann et al, eLife 2018)
EMBL Hamburg 的研究團隊這個月在 Nature Comm 發表了他們的研究，他們從三個 sybody libraries 裡共釣出 85 個合成小抗體，純化了其中 62 個後，檢測了它們的 binding affinity，其中有六個和 Spike RBD 結合力很強，Kd 範圍約為 10 nM - 60 nM，其中以 Sb23 這株小抗體最強。
小抗體的結合力強，那是否有抑制病毒的作用呢？他們掃了 36 個小抗體，測試它們的中合力(neutralizaiton activity)，發現其中十一個小抗體的 IC50 < 20 ug/ml，六個的 IC50 < 5 ug/ml，Sb23 的 IC50 則只有 0.6 ug/ml (48 pM)，當它和 Fc 接在一起後，IC50 可達到 0.007 ug/ml (0.56 pM)，未來有望用於治療。
IC50 用 ug/ml 來表示真是不習慣啊，於是我把它換算成 pM 惹。
Sb23 (MW = 12.5 kDa)
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFPVESENMHWYRQAPGKEREWVAAIYSTGGWTLYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAVQVGYWYEGQGTQVTVS
Articles:
EMBL Press release / cientists identify synthetic mini-antibody to combat COVID-19
TN / Synthetic Mini-Antibody Binds to and Neutralizes SARS-CoV-2 (Nov 2020)
Addgene blog / No Llamas Required - Synthetic Nanobodies Against Membrane Proteins (June 2020)
Papers:
TF Custodio et al, Selection, biophysical and structural analysis of synthetic nanobodies that effectively neutralize SARS-CoV-2. Nature Comm (2020)
I Zimmermann et al, Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife (2018)
2020年5月15日 星期五
從駱馬體內得到的新冠病毒小抗體
哎呀呀，已經有人做了啊。這篇的研究團隊是之前做 Spike protein Cyro-EM 的那個，原來他們也有做駱馬(llama)的小抗體研究啊。
相關文章：關於武漢病毒(SARS-CoV-2) Cryo-EM 那篇論文的閒聊
如果有看過我之前關於小抗體那篇的，就知道駱馬和鯊魚除了有普通的 IgG 之外，還有一種只有 heavy chain 的小抗體 HCAbs (heavy chain antibodies)，如果只取它的 Fv (variable region)，體積會更小，稱為 VHH 或是 nanobodies (Nbs)。這種小抗體要顧慮的地方比傳統 IgG 要少一些，例如不用考慮是否醣化(glycosylation)，加上也較容易生產製造，所以近來也引起關注，可望作為另一種型態的抗體藥。
相關文章：關於抗體和抗體藥的一些小知識
根據文中所述，他們自 2016 年起就用駱馬研發對抗 SARS 和 MARS 的小抗體。駱馬被先後打入 SARS 和 MERS 的 Spike protein 後體內會產上對抗 Spike protein 的抗體，他們在打入抗原的六週後取出駱馬的淋巴球，然後再用噬菌體展示(phage display)從中釣出可以和 Spike protein 結合的小抗體。他們從從駱馬淋巴球裡抓到七個 MERS 的小抗體和五個 SARS 的小抗體，得到了小抗體的基因序列後，便在酵母菌裡大量表現，然在再用 ELISA 確認它是否真的能夠和病毒結合。經過試驗發現其中一個 VHH 可以中和 SARS，為 VHH-72，並且和 MERS 的 S protein 沒有 cross-reactivity。
註 1：抗原(antigen)對免疫系統來講就是外來物，因此可以是病毒或細菌，免疫系統在外來物入侵後即會產生抗體(antibody)對抗外來物。
註 2：一隻駱馬可以被打入五種抗原，之後在用 phage display 把分別的小抗體釣出來，想更瞭解細節的可參考之前的《 Phage display 和小抗體製造 》這篇。
接著，他們想測試這些 VHH 是否可以抑制病毒，於是他們改造了基改過無害的 lentivirus VSV，讓它們在表面表現 S protein，假裝是 SARS，然後看看這些假 SARS 病毒是否能夠進入細胞，結果顯示和假 SARS 或假 MERS 結合力很強的 VHH 可以抑制病毒，結合力若的則沒有抑制的效果，其中以 VHH-72 的效果最好，9 nM 就可以達到抑制的效果。另外，VHH-72 雖然和 SARS S protein RBD 的結合力很強，但是 ELISA 的結果顯示它對 SARS S protein NTD (N-terminal domain) 沒有反應，表示 VHH-72 是透過和 RBD 結合來抑制病毒。
這個研究裡我比較訝異的是他們也分析了小抗體和病毒結合的 crystal structure，發現 VHH 抑制病毒的機制應該是把 Spike 的 RBD 固定在某個 conformation，使它不能動。VHH-72 是透過其 CDR2 和 CDR3 和病毒結合，但結合點和 ACE2 似乎不同，和 ACE2 競爭的不是 CDR2 或 CDR3，而是比較遠的 FR (framework region)。
Figure / The Crystal Structure of SARS VHH-72 Bound to the SARS-CoV-1 RBD (Wrapp et al, Cell 2020)
因為新冠病毒的 Spike protein 和 SARS 的很像，所以他們想知道 VHH-72 是否也可以抑制 SARS-CoV-2 的感染。他們發現 VHH-72 也會和新冠病毒的 S protein RBD 結合，但是 binding affinity 比較低。他們的 crystal structure 分析結果顯示 VHH-72 是和 SARS S RBD 的 R426 接合，而這個氨基酸在 SARS-CoV-2 則是 N439，這可能是造成 binding affinity 的原因。為了增強 binding affinity，他們試了兩種方法：一是用 (GGGS)3 linker 把兩個 VHH-72 尾接頭的連在一起(VHH-72-VHH-72)，一是在它後面接一個 IgG Fc (VHH-72-Fc)。ELISA 測試的結果顯示，這兩種都會會 SARS S 和 SARS-CoV-2 S 結合，並且細胞實驗顯示 VHH-72-Fc 可以抑制假 SARS 和假 SARS-CoV-2。
有意思的是 VHH-72 在病毒 S protein 的結合點似乎和之前發表過的抗體不同，倒是和 CR3022 類似，不過 CR3022 並無法抑制 SARS-CoV-2。
相關文章：近期和新冠病毒抗體相關的研究
哦，另外還有一個重要的點，就是這個小抗體可以在動物細胞裡大量表現，別以為這沒什麼，你如果遇過那種在三種細菌株裡都表現不出來，要不就表現出來但是不 soluble 的 VHH 就知道苦了。（現在每天都在和 phage display 還有 VHH 奮戰的苦主 QQ）
其實這篇研究的另一半是 MERS 和它的 VHH，有興趣的人可以看看。
Article:
UT NEWS / Antibodies from Llamas Could Help in Fight Against COVID-19 (Apr 2020)
TN / Llama Antibodies Could Help Fight Against COVID-19 (May 2020)
Paper:
Wrapp et al, Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-Domain Camelid Antibodies. Cell (2020)
相關文章：關於武漢病毒(SARS-CoV-2) Cryo-EM 那篇論文的閒聊
如果有看過我之前關於小抗體那篇的，就知道駱馬和鯊魚除了有普通的 IgG 之外，還有一種只有 heavy chain 的小抗體 HCAbs (heavy chain antibodies)，如果只取它的 Fv (variable region)，體積會更小，稱為 VHH 或是 nanobodies (Nbs)。這種小抗體要顧慮的地方比傳統 IgG 要少一些，例如不用考慮是否醣化(glycosylation)，加上也較容易生產製造，所以近來也引起關注，可望作為另一種型態的抗體藥。
相關文章：關於抗體和抗體藥的一些小知識
根據文中所述，他們自 2016 年起就用駱馬研發對抗 SARS 和 MARS 的小抗體。駱馬被先後打入 SARS 和 MERS 的 Spike protein 後體內會產上對抗 Spike protein 的抗體，他們在打入抗原的六週後取出駱馬的淋巴球，然後再用噬菌體展示(phage display)從中釣出可以和 Spike protein 結合的小抗體。他們從從駱馬淋巴球裡抓到七個 MERS 的小抗體和五個 SARS 的小抗體，得到了小抗體的基因序列後，便在酵母菌裡大量表現，然在再用 ELISA 確認它是否真的能夠和病毒結合。經過試驗發現其中一個 VHH 可以中和 SARS，為 VHH-72，並且和 MERS 的 S protein 沒有 cross-reactivity。
註 1：抗原(antigen)對免疫系統來講就是外來物，因此可以是病毒或細菌，免疫系統在外來物入侵後即會產生抗體(antibody)對抗外來物。
註 2：一隻駱馬可以被打入五種抗原，之後在用 phage display 把分別的小抗體釣出來，想更瞭解細節的可參考之前的《 Phage display 和小抗體製造 》這篇。
接著，他們想測試這些 VHH 是否可以抑制病毒，於是他們改造了基改過無害的 lentivirus VSV，讓它們在表面表現 S protein，假裝是 SARS，然後看看這些假 SARS 病毒是否能夠進入細胞，結果顯示和假 SARS 或假 MERS 結合力很強的 VHH 可以抑制病毒，結合力若的則沒有抑制的效果，其中以 VHH-72 的效果最好，9 nM 就可以達到抑制的效果。另外，VHH-72 雖然和 SARS S protein RBD 的結合力很強，但是 ELISA 的結果顯示它對 SARS S protein NTD (N-terminal domain) 沒有反應，表示 VHH-72 是透過和 RBD 結合來抑制病毒。
這個研究裡我比較訝異的是他們也分析了小抗體和病毒結合的 crystal structure，發現 VHH 抑制病毒的機制應該是把 Spike 的 RBD 固定在某個 conformation，使它不能動。VHH-72 是透過其 CDR2 和 CDR3 和病毒結合，但結合點和 ACE2 似乎不同，和 ACE2 競爭的不是 CDR2 或 CDR3，而是比較遠的 FR (framework region)。
Figure / The Crystal Structure of SARS VHH-72 Bound to the SARS-CoV-1 RBD (Wrapp et al, Cell 2020)
因為新冠病毒的 Spike protein 和 SARS 的很像，所以他們想知道 VHH-72 是否也可以抑制 SARS-CoV-2 的感染。他們發現 VHH-72 也會和新冠病毒的 S protein RBD 結合，但是 binding affinity 比較低。他們的 crystal structure 分析結果顯示 VHH-72 是和 SARS S RBD 的 R426 接合，而這個氨基酸在 SARS-CoV-2 則是 N439，這可能是造成 binding affinity 的原因。為了增強 binding affinity，他們試了兩種方法：一是用 (GGGS)3 linker 把兩個 VHH-72 尾接頭的連在一起(VHH-72-VHH-72)，一是在它後面接一個 IgG Fc (VHH-72-Fc)。ELISA 測試的結果顯示，這兩種都會會 SARS S 和 SARS-CoV-2 S 結合，並且細胞實驗顯示 VHH-72-Fc 可以抑制假 SARS 和假 SARS-CoV-2。
有意思的是 VHH-72 在病毒 S protein 的結合點似乎和之前發表過的抗體不同，倒是和 CR3022 類似，不過 CR3022 並無法抑制 SARS-CoV-2。
相關文章：近期和新冠病毒抗體相關的研究
哦，另外還有一個重要的點，就是這個小抗體可以在動物細胞裡大量表現，別以為這沒什麼，你如果遇過那種在三種細菌株裡都表現不出來，要不就表現出來但是不 soluble 的 VHH 就知道苦了。（現在每天都在和 phage display 還有 VHH 奮戰的苦主 QQ）
其實這篇研究的另一半是 MERS 和它的 VHH，有興趣的人可以看看。
Article:
UT NEWS / Antibodies from Llamas Could Help in Fight Against COVID-19 (Apr 2020)
TN / Llama Antibodies Could Help Fight Against COVID-19 (May 2020)
Paper:
Wrapp et al, Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-Domain Camelid Antibodies. Cell (2020)
2018年10月7日 星期日
Phage display 和奈米抗體製造
之前聊過抗體的一些知識，這篇來介紹如何用 phage display (噬菌體展示)來製造抗體，這邊說的抗體是奈米抗體 VHH，也就是 nanobodies (Nbs)。如果還記得之前說過的，駱駝除了正常的 IgG 抗體外，還有一種只有 heavy chain 的小抗體(HCAbs)，而 VHH 就是它的 variable region，很小，只有 14kDa 左右。和用老鼠產生抗體的方式類似，只是這是把抗原打到羊駝(llama, alpaca, 屬於駱駝科 Familiy: Camelidae)體內。
整個用 phage display 研發小抗體的步驟大概是：
Figure / Phagemid pMECS. VHH gene is fused to gIII gene of bacteriophage. (Vincke et al 2002)
Phagemid 本身有包含 bacteriophage (噬菌體)的一些東西(e.g., f1 origin)，所以除了會複製外，在 helper phage M13 的加入下 [註1]，會在細菌裡 package 成一個個的 phage particles。把 VHH 的 DNA library subclone 進 phagemid 裡面是為了讓它和 phage 的 gene III 連結在一起 [註2]，gene III 的蛋白質 product 是噬菌體的外層蛋白 g3p (g3 protein)，也就是 coat protein [註3]。把 VHH 的 DNA library 和 gene III 連結在一起的話，那當 phagemid 在複製和 package 成 phage 的時候，就會和 g3p 一起表現在 phage 的表面（下圖 P3 的地方），這就是 phage display (噬菌體展示)，把抗體展示在噬菌體表面。
Figure / Microbiology: Chapter 11 - Molecular Biology of Viruses (W. W. Norton)
註1：f1 和 M13 phage 都屬於 inovirus (ssDNA virus)，M13 有十個 genes，gene I 到 gene X，它們的 protein products 即是 g1p 到 g10p。Phage display 裡常用的 helper phage 是 M13KO7，可以幫助噬菌體把 phagemid 包進 phage particle 裡面。
"M13KO7 is able to replicate in the absence of phagemid DNA. In the presence of a phagemid bearing a wild-type M13 or f1 origin, single-stranded phagemid is packaged preferentially and secreted into the culture medium.This allows easy production of single-stranded phagemid DNA for mutagenesis or sequencing." （摘自 NEB 的產品網頁）
註2：下面提供的 protocol 裡用的 phagemid 是 pMECS，它帶有 f1 origin 和 gene III。
註3：如果對病毒還算熟悉的話，就是類似病毒的 capsid proteins 或是 envelope proteins。M13 的 g3p 是在的尾端，Expasy 的 ViralZone 有不錯的介紹：Inovirus - M13 phage。
要讓噬菌體把 VHH 表現在它的表面，需要把 phagemid 轉入細菌中，這樣它才有辦法在細菌裡面 package 成一個個的 phage，並且在細菌中大量繁殖，而這些會表現 VHH 的 phage 就是 phage library。
因為一隻羊駝裡可以打入好幾種抗原，所以產生的抗體是對抗不同抗原的混合，因此上面做出來的 phage library 其實是各種抗體的混合。例如你在一隻駱駝裡打入 A, B, C 三個抗原，牠體內就會產生 anti-A, anti-B 和 anti-C 的奈米抗體，你的 phage library 也就會是這三種抗體的混合，如果你要從中挑出 anti-A 的 nanobodies，這時候就要做 biopanning 。
那要怎麼挑出來呢？
就是用 A 抗原去挑，把 A 固定在盤子上後，加入 phage library，這時候表現有 anti-A nanobodies 的 phage 就會 bind A，然後把其他不會 bind A 抗原的 phage 都洗掉，再把會 bind A 抗原的 phage 洗出來(elution)，就是你的 anti-A phage library 惹。Anti-B 和 anti-C 的 phage 也可以用同樣方法挑出來，這個步驟就是 biopanning。
Figure / Scheme of phage display (T Schirrmann et al, Molecules 2011; doi: 10.3390/molecules16010412)
上圖中可以看到每個 phage 的尾巴都表現不同的抗體，這些抗體會和它可以辨識的抗原結合，然後其他的抗原的抗體或是 non-specific binding 會被洗掉，而可以和抗原結合的抗體則會被挑出來，在 helper phage 的幫助之下再度感染細菌，使這些帶有能夠辨識抗原的抗體的噬菌體 amplify。經過 amplification 的噬菌體再進入下一輪的 biopanning，把 binding 比較弱的和其他的 non-specific binding 再洗掉，這樣重複個兩三輪。
之後這些各別的 anti-A, anti-B 和 anti-C phage library 可以用 ELISA 的方法(i.e., phage ELISA)挑出 individual phage clones，例如找出 affinity 最高、最 specific，或是最 stable 的 nanobodies。挑出來的 phage clones 可以萃取出它們的 phagemid，定序之後就可以知道這些 nanobodies 的 DNA sequences。
詳細的 protocol 可以參考這篇：
C Vincke et al, Generation of Single Domain Antibody Fragments Derived from Camelids and Generation of Manifold Constructs. Antibody Engineering (2012)
延伸閱讀： 關於抗體和抗體藥的一些小知識
奈米抗體(nanobodies)的開發流程
整個用 phage display 研發小抗體的步驟大概是：
- Purify antigen (純化抗原)
- Immunization (把抗原打到動物體內讓他們產生抗體)
- Library building (製造抗體 library)：整個過程包括抽取動物的免疫細胞(lymphocytes)，從免疫細胞裡抽取 RNA，把 RNA 轉成 cDNA，PCR amplification，clone 到 phagemid 裡面後再 transform 到細菌裡做成細菌的 library。之後用 phage 去感染細菌，轉成 phage library。
- Biopanning & phage amplification: 從含有各種抗體基因的 phage library 裡面把不跟抗原反應的抗體洗掉，抓出和抗原抓出相對應的抗體。
- Phage ELISA: 利用 ELISA 釣出 positive clones，這個步驟是要從 biopanning 出來的一堆 phage 裡一個個挑出真的會和抗原反應的抗體。
- Sequencing of positive clones：定序從 phage library 釣出來的抗體，知道序列後就可以大量生產。
- Cloning into expression vector & purification: 把抗體的基因轉到 expression expression vector 後就可以大量表現和純化抗體。
Figure / Phagemid pMECS. VHH gene is fused to gIII gene of bacteriophage. (Vincke et al 2002)
噬菌體的構造
Phagemid 本身有包含 bacteriophage (噬菌體)的一些東西(e.g., f1 origin)，所以除了會複製外，在 helper phage M13 的加入下 [註1]，會在細菌裡 package 成一個個的 phage particles。把 VHH 的 DNA library subclone 進 phagemid 裡面是為了讓它和 phage 的 gene III 連結在一起 [註2]，gene III 的蛋白質 product 是噬菌體的外層蛋白 g3p (g3 protein)，也就是 coat protein [註3]。把 VHH 的 DNA library 和 gene III 連結在一起的話，那當 phagemid 在複製和 package 成 phage 的時候，就會和 g3p 一起表現在 phage 的表面（下圖 P3 的地方），這就是 phage display (噬菌體展示)，把抗體展示在噬菌體表面。
Figure / Microbiology: Chapter 11 - Molecular Biology of Viruses (W. W. Norton)
註1：f1 和 M13 phage 都屬於 inovirus (ssDNA virus)，M13 有十個 genes，gene I 到 gene X，它們的 protein products 即是 g1p 到 g10p。Phage display 裡常用的 helper phage 是 M13KO7，可以幫助噬菌體把 phagemid 包進 phage particle 裡面。
"M13KO7 is able to replicate in the absence of phagemid DNA. In the presence of a phagemid bearing a wild-type M13 or f1 origin, single-stranded phagemid is packaged preferentially and secreted into the culture medium.This allows easy production of single-stranded phagemid DNA for mutagenesis or sequencing." （摘自 NEB 的產品網頁）
註2：下面提供的 protocol 裡用的 phagemid 是 pMECS，它帶有 f1 origin 和 gene III。
註3：如果對病毒還算熟悉的話，就是類似病毒的 capsid proteins 或是 envelope proteins。M13 的 g3p 是在的尾端，Expasy 的 ViralZone 有不錯的介紹：Inovirus - M13 phage。
要讓噬菌體把 VHH 表現在它的表面，需要把 phagemid 轉入細菌中，這樣它才有辦法在細菌裡面 package 成一個個的 phage，並且在細菌中大量繁殖，而這些會表現 VHH 的 phage 就是 phage library。
怎麼釣出你要的奈米抗體？
因為一隻羊駝裡可以打入好幾種抗原，所以產生的抗體是對抗不同抗原的混合，因此上面做出來的 phage library 其實是各種抗體的混合。例如你在一隻駱駝裡打入 A, B, C 三個抗原，牠體內就會產生 anti-A, anti-B 和 anti-C 的奈米抗體，你的 phage library 也就會是這三種抗體的混合，如果你要從中挑出 anti-A 的 nanobodies，這時候就要做 biopanning 。
那要怎麼挑出來呢？
就是用 A 抗原去挑，把 A 固定在盤子上後，加入 phage library，這時候表現有 anti-A nanobodies 的 phage 就會 bind A，然後把其他不會 bind A 抗原的 phage 都洗掉，再把會 bind A 抗原的 phage 洗出來(elution)，就是你的 anti-A phage library 惹。Anti-B 和 anti-C 的 phage 也可以用同樣方法挑出來，這個步驟就是 biopanning。
Figure / Scheme of phage display (T Schirrmann et al, Molecules 2011; doi: 10.3390/molecules16010412)
上圖中可以看到每個 phage 的尾巴都表現不同的抗體，這些抗體會和它可以辨識的抗原結合，然後其他的抗原的抗體或是 non-specific binding 會被洗掉，而可以和抗原結合的抗體則會被挑出來，在 helper phage 的幫助之下再度感染細菌，使這些帶有能夠辨識抗原的抗體的噬菌體 amplify。經過 amplification 的噬菌體再進入下一輪的 biopanning，把 binding 比較弱的和其他的 non-specific binding 再洗掉，這樣重複個兩三輪。
之後這些各別的 anti-A, anti-B 和 anti-C phage library 可以用 ELISA 的方法(i.e., phage ELISA)挑出 individual phage clones，例如找出 affinity 最高、最 specific，或是最 stable 的 nanobodies。挑出來的 phage clones 可以萃取出它們的 phagemid，定序之後就可以知道這些 nanobodies 的 DNA sequences。
詳細的 protocol 可以參考這篇：
C Vincke et al, Generation of Single Domain Antibody Fragments Derived from Camelids and Generation of Manifold Constructs. Antibody Engineering (2012)
延伸閱讀： 關於抗體和抗體藥的一些小知識
訂閱：
文章 (Atom)