早在四百多年前，科學家們就知道安慰劑的效用(placebo effect)，但是不知道原理為什麼。安慰劑效應的相反是 nocebo effect，兩者有何不同？舉個例來說，如果仿間流傳吃西藥對身體不好，病人就會覺得自己吃了藥以後身體哪都不舒服，這就是 nocebo effect。但是當人家跟他說喝鹼性水就會好，然後他喝了鹼性水之後，真得覺得病痛都消失了，這就是 placebo effect。
大部分 placebo effect 和 nocebo effect 的研究是來自 placebo analgesia 和 nocebo hyperalgesia，也就是安慰劑讓人有止痛的感覺，和反安慰劑效應讓人感覺更痛。管理和調節痛覺的神經迴路為 periaqueductal gray (PAG) - rostral ventromedial medulla (RVM) pathway，當大腦接收到疼痛的感覺後，一部份會經由 PAG 送到 RVM，然後 RVM 處理過後，再送到脊髓神經線路。
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到底為什麼安慰劑會有效用？可能目前大家會覺得是因為心理作用，大腦告訴你有效或沒效，然後心理影響生理。澳洲墨爾本大學和雪梨大學的科學家們，合作做了一個研究，想知道大腦到底在安慰劑效用裡扮演了什麼角色，於是找來了 27 位平均年齡 23 歲的志願者參與一個研究，在他們的手臂上戴了一個熱電擊(thermode)，這個熱電擊會加熱到一個讓人感到有點痛的溫度。之後，研究者們拿了三個藥膏，分別是止痛藥膏(pain reliver, lidocaine)、助痛藥膏(pain inducer, capsaicin)，塗了會變更痛，和普通的凡士林(Vaseline)，然後在參與者們手臂上被熱電擊燙到的地方塗藥膏，跟他們說，他們被塗的是哪一種藥膏，但其實三種都是凡士林。
兩天過後，問參與者有什麼感覺，同時用 fMRI 觀察他們的腦部變化，看腦中哪個部位變得很活躍。大部分的參與者都感覺到比較不痛(placebo effect)，或是感覺變得更痛(nocebo effect)。有三分之一的人在塗了止痛藥膏後都覺得有變得比較不痛，有超過一半的人覺得塗了助痛藥膏後，真的有變得比較痛。而這些感受，有反映在 fMRI 的結果上，參與者們的大腦裡，管理和調節痛覺的 PAG-RVM pathway，不管是安慰劑效應，還是 nocebo effect，都出現不同的反應。差別在於安慰劑效應會讓 RVM 變得活躍，但是降低 PAG 的活躍度，而 nocebo effect 則相反，PAG 變得活躍，RVM 的活耀度則變低。
Articles:
Science / Why do placebos work? Scientists identify key brain pathway (Oct 2021)
EurekAlert / Brainstem pathway modulates pain in placebo effect (Oct 2021)
Papers:
L Crawford et al, Brainstem mechanisms of pain modulation: a within-subjects 7T fMRI study of Placebo Analgesic and Nocebo Hyperalgesic Responses. J Neurosci (2021)
2021年11月6日 星期六
2021年9月18日 星期六
有了這個突變就不會得阿茲海默症了嗎？
這篇是快兩年前的新聞，本來想分享的，結果拖了一下疫情就來惹，然後就拖到現在。QQ
阿茲海默症有兩種：早發性(early-onset)和晚發性(late-onset, LOAD)。早發性是遺傳造成的，通常在四、五十歲左右就會出現症狀，晚發性的病因則不清楚，主要是老化，隨著年齡增長的病的機率越高，通常都是六十歲之後才開始出現症狀。早發性阿滋海默症主要是因為 PSEN1 (presenilin 1)、PSEN2 和 APP (amyloid protein precursor) 帶有突變，導致 β-amyloid (Aβ) 和 tau 堆積。除此之外，近來也發現 APOE4 也是致病基因之一。
相關文章：利用 ASO 治療阿茲海默症
不過之前發現，有位女性雖然帶有突變，照理說在五十歲前就會發病，但她在七十歲以後才出現輕微失智的症狀，當他到麻省綜合醫院(MGH)做腦部影像檢查時，引起了神經心理學家 Dr. Yakeel Quiroz 的注意。
這位女士是哥倫比亞人，來自全世界最大的遺傳性阿茲海默症家族，他的祖先是一對巴斯克人夫妻(Basque)，在三百多年前移居到哥倫比亞，這個家族目前約有六千人，其中有一千兩百人的 PSN1 帶有 E280A 這個突變，這個突變會產生大量的 Aβ，造成 Aβ 堆積。這個大家族裡帶有 E280A 的人中，有一半在在 44 歲以前就出現輕微的認知障礙(mild cognitive impairment, MCI)，然後在 49 歲以前出現失智症狀，他們也參與了 crenezumab 的臨床試驗。
這位女士讓人訝異的點是腦部 PET 影像顯示她的腦中雖然有大量的 Aβ 堆積，但是她在七十幾歲才出現輕微的認知障礙，比他的親戚晚了三十年，而且他的 Aβ 堆積比他親戚還多，值得注意的是他腦中的 tau 相對的少，這表示光是 Aβ 堆積不足以造成阿茲海默症，tau 才是主要原因嗎？Dr. Quiroz 想知道為什麼他的 Aβ 那麼多，但症狀卻那麼晚才出現，於是定序了其他和阿茲海默症有關的基因，結果發現他的 APOE3 帶有罕見的 Christchurch mutation (APOE3ch, R136S)。這個突變是於 1987 年在紐西蘭基督城(Christchurch)發現的，但是幾乎只出現在拉丁裔中，而兩個 copies 都帶有這個突變的機率大約是百萬分之一，而這位女士就是那個之一。
APOE 的功能是運送脂肪和膽固醇到表皮組織和腦部，因此也被認為和心血管疾病有關。APOE 基因是 polymorphic，有三種 isofoms (3 alleles, ε2, ε3, ε4)，主要不同為其中兩個氨基酸：APOE2 (C112/C158), APOE3 (C112/R158) & APOE4 (R112/R158)；可以有六種組合：ε2/ε2, ε2/ε3, ε2/ε4, ε3/ε3, ε3/ε4, ε4/ε4。其中 APOE4 被認為是阿茲海默症的致病基因之一，APOE2 比較少見但有研究顯示它會降低心血管疾病和 AD 致病機率，APOE3 目前屬於中性。大多數人帶的都是 APOE3，之前有研究顯示，在歐美亞非人種中，非洲人帶有 APOE4 的機率最高，東亞人帶 APOE4 的機率較低，且帶 APOE2 的機率較高。
要怎麼知道是 APOE3 基督城突變是延緩 AD 的原因？他們先是測試 APOE3 對 Aβ 的影響，發現在有 APOE3 的情況下，Aβ 會結塊(aggregates)，但是在 APOE3ch 的情況下，結塊的情況比較低，和有 APOE2 的情形差不多。另外，R136S 這個突變點剛好和 LDLR (lipoprotein receptors)，還有醣分子 heparan sulphate proteoglycans (HSPGs) 的結合有關，相較於 APOE3，APOE2 和 APOE3ch 和 LDLR 的結合度比較低。HSPGs 被認為會促進 Aβ 堆積和吸收細胞外的 tau，APOE3 和 HSPG 的結合會讓 tau 擴散到其他神經細胞，他們比較了不同 APOE 和 HSPGs 的結合度(binding affinity)，發現 APOE3ch 和 HSPGs 的結合度最低。
不過，也有人對此感到懷疑，原因是這位女士跟大家一樣帶好幾千個基因突變，要怎麼確定不是其他突變帶來的益處？另外，這個家族有七人帶有一個基督城突變，但還是很早就出現症狀，難道一定要兩個 copy 都有突變才會有效果嗎？但是，要是真的和 APOE3/heparin 的結合有關，那麼阻斷這個結合有可能成為治療阿茲海默症的方法之ㄧ。
Articles:
STAT / She was destined to get early Alzheimer’s, but didn’t. Did a rare mutation protect her? (Nov 2019)
KA Zalocusky et al, An Alzheimer’s-disease-protective APOE mutation. Nature Medicine (2019)
Papers:
JF Arboleda-Velasquez et al, Resistance to autosomal dominant Alzheimer’s disease in an APOE3 Christchurch homozygote: a case report. Nature Medicine (2019)
Zhou et al, Non-coding variability at the APOE locus contributes to the Alzheimer’s risk. Nature Comm (2019)
ME Belloy et al, A Quarter Century of APOE and Alzheimer's Disease: Progress to Date and the Path Forward. Neuron (2019)
阿茲海默症有兩種：早發性(early-onset)和晚發性(late-onset, LOAD)。早發性是遺傳造成的，通常在四、五十歲左右就會出現症狀，晚發性的病因則不清楚，主要是老化，隨著年齡增長的病的機率越高，通常都是六十歲之後才開始出現症狀。早發性阿滋海默症主要是因為 PSEN1 (presenilin 1)、PSEN2 和 APP (amyloid protein precursor) 帶有突變，導致 β-amyloid (Aβ) 和 tau 堆積。除此之外，近來也發現 APOE4 也是致病基因之一。
相關文章：利用 ASO 治療阿茲海默症
不過之前發現，有位女性雖然帶有突變，照理說在五十歲前就會發病，但她在七十歲以後才出現輕微失智的症狀，當他到麻省綜合醫院(MGH)做腦部影像檢查時，引起了神經心理學家 Dr. Yakeel Quiroz 的注意。
這位女士是哥倫比亞人，來自全世界最大的遺傳性阿茲海默症家族，他的祖先是一對巴斯克人夫妻(Basque)，在三百多年前移居到哥倫比亞，這個家族目前約有六千人，其中有一千兩百人的 PSN1 帶有 E280A 這個突變，這個突變會產生大量的 Aβ，造成 Aβ 堆積。這個大家族裡帶有 E280A 的人中，有一半在在 44 歲以前就出現輕微的認知障礙(mild cognitive impairment, MCI)，然後在 49 歲以前出現失智症狀，他們也參與了 crenezumab 的臨床試驗。
這位女士讓人訝異的點是腦部 PET 影像顯示她的腦中雖然有大量的 Aβ 堆積，但是她在七十幾歲才出現輕微的認知障礙，比他的親戚晚了三十年，而且他的 Aβ 堆積比他親戚還多，值得注意的是他腦中的 tau 相對的少，這表示光是 Aβ 堆積不足以造成阿茲海默症，tau 才是主要原因嗎？Dr. Quiroz 想知道為什麼他的 Aβ 那麼多，但症狀卻那麼晚才出現，於是定序了其他和阿茲海默症有關的基因，結果發現他的 APOE3 帶有罕見的 Christchurch mutation (APOE3ch, R136S)。這個突變是於 1987 年在紐西蘭基督城(Christchurch)發現的，但是幾乎只出現在拉丁裔中，而兩個 copies 都帶有這個突變的機率大約是百萬分之一，而這位女士就是那個之一。
APOE 的功能是運送脂肪和膽固醇到表皮組織和腦部，因此也被認為和心血管疾病有關。APOE 基因是 polymorphic，有三種 isofoms (3 alleles, ε2, ε3, ε4)，主要不同為其中兩個氨基酸：APOE2 (C112/C158), APOE3 (C112/R158) & APOE4 (R112/R158)；可以有六種組合：ε2/ε2, ε2/ε3, ε2/ε4, ε3/ε3, ε3/ε4, ε4/ε4。其中 APOE4 被認為是阿茲海默症的致病基因之一，APOE2 比較少見但有研究顯示它會降低心血管疾病和 AD 致病機率，APOE3 目前屬於中性。大多數人帶的都是 APOE3，之前有研究顯示，在歐美亞非人種中，非洲人帶有 APOE4 的機率最高，東亞人帶 APOE4 的機率較低，且帶 APOE2 的機率較高。
要怎麼知道是 APOE3 基督城突變是延緩 AD 的原因？他們先是測試 APOE3 對 Aβ 的影響，發現在有 APOE3 的情況下，Aβ 會結塊(aggregates)，但是在 APOE3ch 的情況下，結塊的情況比較低，和有 APOE2 的情形差不多。另外，R136S 這個突變點剛好和 LDLR (lipoprotein receptors)，還有醣分子 heparan sulphate proteoglycans (HSPGs) 的結合有關，相較於 APOE3，APOE2 和 APOE3ch 和 LDLR 的結合度比較低。HSPGs 被認為會促進 Aβ 堆積和吸收細胞外的 tau，APOE3 和 HSPG 的結合會讓 tau 擴散到其他神經細胞，他們比較了不同 APOE 和 HSPGs 的結合度(binding affinity)，發現 APOE3ch 和 HSPGs 的結合度最低。
不過，也有人對此感到懷疑，原因是這位女士跟大家一樣帶好幾千個基因突變，要怎麼確定不是其他突變帶來的益處？另外，這個家族有七人帶有一個基督城突變，但還是很早就出現症狀，難道一定要兩個 copy 都有突變才會有效果嗎？但是，要是真的和 APOE3/heparin 的結合有關，那麼阻斷這個結合有可能成為治療阿茲海默症的方法之ㄧ。
Articles:
STAT / She was destined to get early Alzheimer’s, but didn’t. Did a rare mutation protect her? (Nov 2019)
KA Zalocusky et al, An Alzheimer’s-disease-protective APOE mutation. Nature Medicine (2019)
Papers:
JF Arboleda-Velasquez et al, Resistance to autosomal dominant Alzheimer’s disease in an APOE3 Christchurch homozygote: a case report. Nature Medicine (2019)
Zhou et al, Non-coding variability at the APOE locus contributes to the Alzheimer’s risk. Nature Comm (2019)
ME Belloy et al, A Quarter Century of APOE and Alzheimer's Disease: Progress to Date and the Path Forward. Neuron (2019)
2021年8月1日 星期日
腺病毒疫苗引起血栓的可能機制
有兩篇，一篇是從 mRNA 角度，一篇是從 protein interaction 的角度。
五月時 CBC 報導的那篇研究是猜測腺病毒疫苗，也就是 AZ 和 J&J 疫苗，造成罕見血栓(vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia, VITT)的可能原因。這篇德國研究目前還只是刊在 ResearchSquare 上的 pre-print，尚未經過 peer-review，不過還滿有意思的，之前沒想過這個可能性。 簡單來說，原因就是 alternative splicing events。腺病毒疫苗和 mRNA 疫苗的差別，除了是否用病毒載體外，就是一個是 DNA，一個是 mRNA。（感覺好像在講廢話 XD）
現在想想一個正常基因在細胞內表現會發生的事：
1. DNA transcribed to RNA
2. RNA splicing
3. mRNA translated to polypeptide
這篇研究認為，問題就出在第二步。腺病毒進入細胞後，帶有 Spike ORF 的 DNA 序列轉錄成 RNA，然後就在這個地方，出現了額外的 RNA splicing，這個 RNA splicing 的結果就是產生了不同 truncated Spike，有的可能少了 C-terminus，有的可能少了 N-terminus，使可以到處游來游去的 soluble Spike，而這些到處遊走的 soluble Spike 就會到處和細胞表面的 ACE2 結合，當它們和血管細胞上的 ACE2 結合的話，就會造成血栓。
Figure / Predicted splicing sites within Spike ORF (E Kowarz et al, 2021)
他們用線上程式 SpliceRover online 和 Alternative Splice Site Predictor (ASSP) 分析比較 AZ 和 JJ 疫苗的 Spike sequence，發現 AZ 疫苗用的 Spike 序列比 JJ 的序列預測出來 RNA splicing sites 多(AZ: 24, JJ: 20)，這也許是為什麼 J&J 的血栓比例比 AZ 少了十倍。兩個疫苗都是 codon optimized Spike (GenBank: YP_009724390.1; Ref Seq: NC_045512.2)。
"The AZ sequence was deduced from a publication which describes the use of the GeneArt codon optimizer (Fisher Scientific), while the Johnson & Johnson sequence was obtained directly from the Janssen company (kindly provided by Roland Zahn)."
mRNA 疫苗沒這個問題，因為它們直接到第三步。有人認為，如果能夠把 DNA 序列 codon optimized 到沒有 RNA splicing sites 的話，也許就能解決出現血栓的問題。
有興趣的可以看原論文，他們有做 RT-PCR 和 luciferase assay 測是否有 RNA splicing 的狀況。
CBC / Researchers claim mystery of rare blood clots tied to COVID-19 vaccines solved, but experts urge caution
原論文：E Kowarz et al, “Vaccine-Induced Covid-19 Mimicry” Syndrome: Splice reactions within the SARS-CoV-2 Spike open reading frame result in Spike protein variants that may cause thromboembolic events in patients immunized with vector-based vaccines" (DOI: 10.21203/rs.3.rs-558954/v1)
AZ ChAdOx1nCoV-19 疫苗的論文：N van Doremalen et al, ChAdOx1 nCoV-19 vaccine prevents SARS-CoV-2 pneumonia in rhesus macaques. Nature (2020)
第二篇是加拿大 McMaster 大學的研究，之前說要收集打 AZ 疫苗後血栓患者的血液來研究，沒想到動作還挺快的，竟然還發表在 Nature 惹呢！
腺病毒疫苗引起的罕見血栓 VITT 有點類似 heparin 引發的血栓 HIT (heparin-induced thrombocytopenia)。血小板內有個蛋白叫 PF4，當血小板被活化後，便會把 PF4 釋放到血液裡。HIT 發生的是因為 heparin 會和 PF4 上一個特定的部位結合，兩者結合後會使 PF4 形成 tetramers，然後使 PF4 裡的一個 70 個氨基酸長的 neoepitopes 暴露出來，有些人體內的 IgG 會和 PF4 的這個 neoepitopes 結合，然後活化更多血小板。
註：heparin 是一個很大的多醣(polysaccharide)
VITT 和 HIT 相像的地方在於 VITT 患者體內有抗 PF4 的抗體，但是不需要有 heparin 就可以造成血栓，為什麼呢？因為 VITT 患者體內的某個 IgG 和 HIT 患者體內的 IgG 都是和 PF4 上的同一個地方結合嘛？還是和 heparin 用同一個 PF4 上的 binding site 呢？
他們拿了 VITT 患者的血液來測試，發現不需要有 heparin，患者的血液就可以活化血小板。之後，他們用 mutagenesis 找出了 PF4 上和患者血液中 IgG 的結合片段，結果發現這個片段和 heparin 在 PF4 上的 binding site 是一樣的，也就是說 VITT 患者裡的抗體本身在沒有 heparin 得情況下就可以活化血小板。
雖說是找到了造化血小板的 binding site，但還是不知道為什麼某些人在打了疫苗後體內會出現這種罕見的抗體。
CBC / McMaster lab to screen for rare antibody that causes blood clots after AstraZeneca vaccination
McMaster News / McMaster researchers identify how VITT happens
TN / Exact Mechanism of Vaccine-Induced Blood Disorders Identified
McMaster Platelet Immunology Lab / Antibody Epitopes in VITT
A Huynh et al, Antibody epitopes in vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia. Nature (2021)
五月時 CBC 報導的那篇研究是猜測腺病毒疫苗，也就是 AZ 和 J&J 疫苗，造成罕見血栓(vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia, VITT)的可能原因。這篇德國研究目前還只是刊在 ResearchSquare 上的 pre-print，尚未經過 peer-review，不過還滿有意思的，之前沒想過這個可能性。 簡單來說，原因就是 alternative splicing events。腺病毒疫苗和 mRNA 疫苗的差別，除了是否用病毒載體外，就是一個是 DNA，一個是 mRNA。（感覺好像在講廢話 XD）
現在想想一個正常基因在細胞內表現會發生的事：
1. DNA transcribed to RNA
2. RNA splicing
3. mRNA translated to polypeptide
這篇研究認為，問題就出在第二步。腺病毒進入細胞後，帶有 Spike ORF 的 DNA 序列轉錄成 RNA，然後就在這個地方，出現了額外的 RNA splicing，這個 RNA splicing 的結果就是產生了不同 truncated Spike，有的可能少了 C-terminus，有的可能少了 N-terminus，使可以到處游來游去的 soluble Spike，而這些到處遊走的 soluble Spike 就會到處和細胞表面的 ACE2 結合，當它們和血管細胞上的 ACE2 結合的話，就會造成血栓。
Figure / Predicted splicing sites within Spike ORF (E Kowarz et al, 2021)
他們用線上程式 SpliceRover online 和 Alternative Splice Site Predictor (ASSP) 分析比較 AZ 和 JJ 疫苗的 Spike sequence，發現 AZ 疫苗用的 Spike 序列比 JJ 的序列預測出來 RNA splicing sites 多(AZ: 24, JJ: 20)，這也許是為什麼 J&J 的血栓比例比 AZ 少了十倍。兩個疫苗都是 codon optimized Spike (GenBank: YP_009724390.1; Ref Seq: NC_045512.2)。
"The AZ sequence was deduced from a publication which describes the use of the GeneArt codon optimizer (Fisher Scientific), while the Johnson & Johnson sequence was obtained directly from the Janssen company (kindly provided by Roland Zahn)."
mRNA 疫苗沒這個問題，因為它們直接到第三步。有人認為，如果能夠把 DNA 序列 codon optimized 到沒有 RNA splicing sites 的話，也許就能解決出現血栓的問題。
有興趣的可以看原論文，他們有做 RT-PCR 和 luciferase assay 測是否有 RNA splicing 的狀況。
CBC / Researchers claim mystery of rare blood clots tied to COVID-19 vaccines solved, but experts urge caution
原論文：E Kowarz et al, “Vaccine-Induced Covid-19 Mimicry” Syndrome: Splice reactions within the SARS-CoV-2 Spike open reading frame result in Spike protein variants that may cause thromboembolic events in patients immunized with vector-based vaccines" (DOI: 10.21203/rs.3.rs-558954/v1)
AZ ChAdOx1nCoV-19 疫苗的論文：N van Doremalen et al, ChAdOx1 nCoV-19 vaccine prevents SARS-CoV-2 pneumonia in rhesus macaques. Nature (2020)
第二篇是加拿大 McMaster 大學的研究，之前說要收集打 AZ 疫苗後血栓患者的血液來研究，沒想到動作還挺快的，竟然還發表在 Nature 惹呢！
腺病毒疫苗引起的罕見血栓 VITT 有點類似 heparin 引發的血栓 HIT (heparin-induced thrombocytopenia)。血小板內有個蛋白叫 PF4，當血小板被活化後，便會把 PF4 釋放到血液裡。HIT 發生的是因為 heparin 會和 PF4 上一個特定的部位結合，兩者結合後會使 PF4 形成 tetramers，然後使 PF4 裡的一個 70 個氨基酸長的 neoepitopes 暴露出來，有些人體內的 IgG 會和 PF4 的這個 neoepitopes 結合，然後活化更多血小板。
註：heparin 是一個很大的多醣(polysaccharide)
VITT 和 HIT 相像的地方在於 VITT 患者體內有抗 PF4 的抗體，但是不需要有 heparin 就可以造成血栓，為什麼呢？因為 VITT 患者體內的某個 IgG 和 HIT 患者體內的 IgG 都是和 PF4 上的同一個地方結合嘛？還是和 heparin 用同一個 PF4 上的 binding site 呢？
他們拿了 VITT 患者的血液來測試，發現不需要有 heparin，患者的血液就可以活化血小板。之後，他們用 mutagenesis 找出了 PF4 上和患者血液中 IgG 的結合片段，結果發現這個片段和 heparin 在 PF4 上的 binding site 是一樣的，也就是說 VITT 患者裡的抗體本身在沒有 heparin 得情況下就可以活化血小板。
雖說是找到了造化血小板的 binding site，但還是不知道為什麼某些人在打了疫苗後體內會出現這種罕見的抗體。
CBC / McMaster lab to screen for rare antibody that causes blood clots after AstraZeneca vaccination
McMaster News / McMaster researchers identify how VITT happens
TN / Exact Mechanism of Vaccine-Induced Blood Disorders Identified
McMaster Platelet Immunology Lab / Antibody Epitopes in VITT
A Huynh et al, Antibody epitopes in vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia. Nature (2021)
2021年7月24日 星期六
CRISPR-Cas9 基因治療（下）-- 遺傳性澱粉樣蛋白疾病 hATTR
CRISPR-Cas9 大家應該都不陌生吧，此技術的發明者 Dr. Doudna 和 Dr. Charpentier 因此技術得了2020 年的諾貝爾化學獎。Dr. Doudna 和 Dr. Charpentier 在 2012 年的時候先於 Science 發表了用 CRISPR-Cas9 基因編輯的成果，之後在 2013 年要把這個技術申請專利的時候，所屬的 Berkeley 大學和 MIT 的 Dr. Zhang 開始了專利之戰。接著，2014 年時 Dr. Doudna 成立了 Intellia Therapeutics，而 Dr. Charpentier 也已於 2013 年在瑞士成立了生技公司 CRISPR Therapeutics。
相關文章：CRISPR-Cas9 的專利大戰和爭議
CRISPR-Cas9 用於治療上，CRISPR Therapeutics 似乎搶先了一步，它和 Vertex Pharmaceuticals 合作研發了用於治療血液疾病的 CTX001，並於 2018 年開始了臨床試驗，2019 年五月時宣佈了用於治療鐮刀型紅血球疾病(sickle cell disease, SCD)的乙型地中海貧血(transfusion-dependent β thalassemia, TBT)的第一、二期臨床試驗結果，那時最先是兩個臨床試驗各一位患者，兩位患者的臨床試驗結果也於今年一月發表在 NEJM [1]。
CTX001 治療是把造血幹細胞(hematopoietic stem cells, HSP)抽出來，利用 CRISPR-Cas9 調控血紅蛋白，再把修正過後的紅血球輸回病患體內。TBT 患者在治療前每年需要接受多次輸血，而在接受治療九個月後便不再需要輸血。SCD 患者在治療前每年會發生多次 vaso-occlusive crises (VOCs)，在治療後便不再出現 VOCs。兩位病患在治療後觀察一年的期間內，HbF 都持續穩定的增加，雖然治療中都出現不適的情況，不過診斷過後排除是治療造成的 [1]。CTX001 已於 2019 四月拿到 FDA Fast Track Designation，Vertex 計劃在未來兩年內送 FDA，並於今年四月宣布給 CRISPR Therapeutics $900M 在研發、量產和上市上 [2]。
相關文章：CRISPR-Cas9 基因治療（上）-- 遺傳性血液疾病
相較於 CRISPR Therapeutics，Dr. Doudna 的 Intellia Therapeutics 今年六月才在 NEJM 上發表了其 NTLA-2001 的第一期臨床試驗結果 [3]。NTLA-2001 是用來治療 hereditary transthyretin amyloidosis (hATTR)。ATTR 有兩種，一種是隨著年齡增長得病機率越大的 wild-type (senile) ATTR，另一種是罕見且會致命的遺傳性 ATTR (hATTR)。TTR (transthyretin, 轉甲狀腺素蛋白)是個只有 14 kDa 的小蛋白，主要功能是運送甲狀腺素(thyroxine)和視黃醇(retinol)，在肝臟中和成後，通常以 tetramer (55 kDa) 的型態遊走在腦脊液(cerebrospinal fluid, CSF)和血液中。
Wild-type ATTR 是因為正常的 TTR 隨著年齡增長而變得不穩定，使得蛋白容易出現摺疊錯誤(misfold)的情況。摺疊錯誤的 TTR 無法組合成 tetramer，而是以 monomer 或 dimer 的型態存在，並且當這些 misfold monomer 碰在一起時，會變成 aggregates，跟造成阿茲海默症的 β-amyloid aggregates 一樣會堆積在組織細胞或神經細胞中，導致細胞死亡，稱為 amyloidogenesis [4]。hATTR 則是因為 TTR 基因突變而造成的，突變的 TTR 比正常的 TTR 更不穩定，更容易摺疊錯誤和堆積。
ATTR 主要發生在心臟和神經系統，目前用來治療 ATTR 的基因療法有兩個，皆已於 2018 年拿到美國 FDA 許可：Alnylam (Nasdaq: ALNY) 的 Onpattro (patisiran) [5] 和 Ionis Pharmaceuticals, Inc. (NASDAQ: IONS) 的 TEGSEDI (inotersen) [6]。Onpattro 用的是 small interfering RNA (siRNA, aka RNA interference, RNAi)，是第一個得到 FDA 許可的 RNA 療法，是利用 NLP (lipid nanoparticles) 把 siRNA 直接送進肝臟裡，使 TTR 的 mRNA 不能被轉譯成蛋白質，TTR 表現可以降低 80% [5-8]。TEGSEDI 則是 antisense oligonucleotides (ASO)，一樣是針對 TTR mRNA，使正常和突變的 TTR mRNA 被降解，無法轉譯成蛋白，同樣可以降低 TTR 表現 80% [6]。
Intellia Therapeutics 和 Regeneron Pharmaceuticals 合作研發的 NTLA-2001 也是利用 NLP 把 CRISPR-Cas9 送進體內，使 CRISPR-Cas9 進入肝臟細胞後可以造成 indels (insertions or deletions) 阻斷 TTR 基因，降低 TTR 的表現和血液裡的 TTR 含量。Intellia 於於去年十月底宣布他們將在英國和紐西蘭開始第一期臨床試驗，參與人數為 38 人，主要是檢測其安全性和有效性 [7]。
今年六月底，Intellia 在 Peripheral Nerve Society (PNS) Annual Meeting 發表了第一期臨床試驗的期中報告，同時也發表在 NEJM，論文裡的參與人數為六位患者，分為兩組不同劑量：0.1 mg/kg 和 0.3 mg/kg。ATTR 患者以靜脈注射的方式接受了一劑 NTLA-2001，然後在 28 天後測量其血清中 TTR 含量。結果顯示接受低劑量(0.1 mg/kg)的患者，其血清的 TTR 減少了 52%，而高劑量組(0.3 mg/kg)的血清 TRR 則減少了 87% [8-11]，比 Onpattro 和 Tegsedi 的 80% 還要好一些，不過 NTLA-2001 的優勢在於它只需一劑，Onpattro 則需每三週施打一次，Tegsedi 也要每週一次 [6, 8]。副作用方面，只有三個人出現輕微副作用，沒有觀察到嚴重副作用。臨床結果發表當週也是他們的 IPO，以每股 $145 的價格上市 [12]。
CTX001 和 NTLA-2001 不同的地方在於 CTX001 是把目標細胞抽出來基因編輯，NTLA-2001 則是需要把 CRISPR-Cas9 送進體內，因此如何讓它到準確地達目標器官或細胞是需要克服的瓶頸。雖說 Intellia 第一期臨床試驗目前看來頗為成功，但因為目標器官是肝臟，大多經由靜脈施打的 liposomes 都會先被肝臟吸收。Dr. Doudna 日前在 CNBC 訪問時表示，CRISPR 基因治療能有局限，要如何把 CRISPR-Cas9 送進目標器官裡仍是個需要解決的難題 [13]，不過要是能克服這個瓶頸，未來便可應用在更多疾病治療上。
Clinical trial: NCT04601051
[2022-09-29 update]
Intellia 研發的、用來治療遺傳性澱粉樣蛋白疾病(hereditary transthyretin amyloidosis, hATTR)的 CRISPR 基因療法 NTLA-2001 的最新報告顯示，只需一劑就夠了。在靜脈施打一劑 NTLA-2001(0.7-mg/kg) 的 28 天後，TTR 降了 93%。
而他們的另一個藥物 NTLA-2002 正在第 1/2 期臨床試驗中，是用來治療罕見疾病 hereditary angioedema (HAE, 遺傳性血管性水腫)，病徵是血液中的 bradykinin (緩激肽, 血管擴張劑)上升，血管外部的體液堆積擠壓到血管，造成血液流通或淋巴液流通不順暢，導致手腳和臉部等部位水腫。HAE 是一種顯性的遺傳疾病，因此只要父母其中之一有這個突變的基因，小孩就有 50% 的機會得到。HAE 是由於 C1 inhibitor (C1-INH) 不足所引起的，C1 inhibitor 是一種 serine protease inhibitor，由基因 SERPING1 表現，SERPING1 的突變會導致 C1 inhibitor 無法表現或是功能缺失。後來研究發現，除了 SERPING1 外，factor XII (F12), plasminogen (PLG) and angiopoietin 1 (ANGPT 1) 的突變也會造成 HAE，95% 的 HAE 是由 SERPING1 突變造成的。C1 inhibitor 主要是抑制 F12 和 kallikrein，因此 C1-INH 不足或功能不正常會導致 F12 和 kallikrein 無法被調控，進而造成 bradykinin 上升。NTLA-2002 即是針對 kallikrein，最新的臨床節果顯示 75 mg 的劑量可以在施打八週後降低血液中 92% 的 kallikrein。
References:
1. H Frangoul et al, CRISPR-Cas9 Gene Editing for Sickle Cell Disease and β-Thalassemia. NEJM (2020)
2. Vertex / Vertex Pharmaceuticals and CRISPR Therapeutics Amend Collaboration for Development, Manufacturing and Commercialization of CTX001™ in Sickle Cell Disease and Beta Thalassemia (April 2021)
3. JD Gillmore et al, CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis. NEJM (2021)
4. GY Park et al, Diagnostic and Treatment Approaches Involving Transthyretin in Amyloidogenic Diseases. Int J Mol Sci (2019)
5. US FDA / FDA approves first-of-its kind targeted RNA-based therapy to treat a rare disease (Aug 2018)
6. Ionis / Akcea and Ionis Receive FDA Approval of TEGSEDI™ (inotersen) for the Treatment of the Polyneuropathy of Hereditary Transthyretin-Mediated Amyloidosis in Adults
7. Gene Online / Intellia Trials CRISPR Drug as Permanent Cure to Fatal Hereditary Disease (Oct 2020)
8. MedCity News / Intellia’s early CRISPR trial data validate a drug pipeline and the gene-editing field (June 2021)
9. CRISPR News / Clinical Trial Update: Positive Data for First Ever In Vivo CRISPR Medicine (June 2021)
10. Clinical Trials Arena / Intellia and Regeneron report positive data of CRISPR therapy for ATTR (June 2021)
11. Intellia and Regeneron Announce Landmark Clinical Data Showing Deep Reduction in Disease-Causing Protein After Single Infusion of NTLA-2001, an Investigational CRISPR Therapy for Transthyretin (ATTR) Amyloidosis (June 2021)
12. BioSpace / Intellia Tops Busy Period with $600 Million IPO
13. CNBC / How CRISPR gene editing will treat diseases in future: Nobel-winning Intellia co-founder Jennifer Doudna
14. Intellia / Intellia Therapeutics Announces Positive Interim Clinical Data for its Second Systemically Delivered Investigational CRISPR Candidate, NTLA-2002 for the Treatment of Hereditary Angioedema (HAE) (Sept 2022)
15. FIERCE Biotech / Intellia's gene editing therapies both post early successes as evidence grows for CRISPR potential
16. Biopharma Dive / Intellia offers first look at CRISPR drug for rare swelling disorder
相關文章：CRISPR-Cas9 的專利大戰和爭議
CRISPR-Cas9 用於治療上，CRISPR Therapeutics 似乎搶先了一步，它和 Vertex Pharmaceuticals 合作研發了用於治療血液疾病的 CTX001，並於 2018 年開始了臨床試驗，2019 年五月時宣佈了用於治療鐮刀型紅血球疾病(sickle cell disease, SCD)的乙型地中海貧血(transfusion-dependent β thalassemia, TBT)的第一、二期臨床試驗結果，那時最先是兩個臨床試驗各一位患者，兩位患者的臨床試驗結果也於今年一月發表在 NEJM [1]。
CTX001 治療是把造血幹細胞(hematopoietic stem cells, HSP)抽出來，利用 CRISPR-Cas9 調控血紅蛋白，再把修正過後的紅血球輸回病患體內。TBT 患者在治療前每年需要接受多次輸血，而在接受治療九個月後便不再需要輸血。SCD 患者在治療前每年會發生多次 vaso-occlusive crises (VOCs)，在治療後便不再出現 VOCs。兩位病患在治療後觀察一年的期間內，HbF 都持續穩定的增加，雖然治療中都出現不適的情況，不過診斷過後排除是治療造成的 [1]。CTX001 已於 2019 四月拿到 FDA Fast Track Designation，Vertex 計劃在未來兩年內送 FDA，並於今年四月宣布給 CRISPR Therapeutics $900M 在研發、量產和上市上 [2]。
相關文章：CRISPR-Cas9 基因治療（上）-- 遺傳性血液疾病
相較於 CRISPR Therapeutics，Dr. Doudna 的 Intellia Therapeutics 今年六月才在 NEJM 上發表了其 NTLA-2001 的第一期臨床試驗結果 [3]。NTLA-2001 是用來治療 hereditary transthyretin amyloidosis (hATTR)。ATTR 有兩種，一種是隨著年齡增長得病機率越大的 wild-type (senile) ATTR，另一種是罕見且會致命的遺傳性 ATTR (hATTR)。TTR (transthyretin, 轉甲狀腺素蛋白)是個只有 14 kDa 的小蛋白，主要功能是運送甲狀腺素(thyroxine)和視黃醇(retinol)，在肝臟中和成後，通常以 tetramer (55 kDa) 的型態遊走在腦脊液(cerebrospinal fluid, CSF)和血液中。
Wild-type ATTR 是因為正常的 TTR 隨著年齡增長而變得不穩定，使得蛋白容易出現摺疊錯誤(misfold)的情況。摺疊錯誤的 TTR 無法組合成 tetramer，而是以 monomer 或 dimer 的型態存在，並且當這些 misfold monomer 碰在一起時，會變成 aggregates，跟造成阿茲海默症的 β-amyloid aggregates 一樣會堆積在組織細胞或神經細胞中，導致細胞死亡，稱為 amyloidogenesis [4]。hATTR 則是因為 TTR 基因突變而造成的，突變的 TTR 比正常的 TTR 更不穩定，更容易摺疊錯誤和堆積。
ATTR 主要發生在心臟和神經系統，目前用來治療 ATTR 的基因療法有兩個，皆已於 2018 年拿到美國 FDA 許可：Alnylam (Nasdaq: ALNY) 的 Onpattro (patisiran) [5] 和 Ionis Pharmaceuticals, Inc. (NASDAQ: IONS) 的 TEGSEDI (inotersen) [6]。Onpattro 用的是 small interfering RNA (siRNA, aka RNA interference, RNAi)，是第一個得到 FDA 許可的 RNA 療法，是利用 NLP (lipid nanoparticles) 把 siRNA 直接送進肝臟裡，使 TTR 的 mRNA 不能被轉譯成蛋白質，TTR 表現可以降低 80% [5-8]。TEGSEDI 則是 antisense oligonucleotides (ASO)，一樣是針對 TTR mRNA，使正常和突變的 TTR mRNA 被降解，無法轉譯成蛋白，同樣可以降低 TTR 表現 80% [6]。
Intellia Therapeutics 和 Regeneron Pharmaceuticals 合作研發的 NTLA-2001 也是利用 NLP 把 CRISPR-Cas9 送進體內，使 CRISPR-Cas9 進入肝臟細胞後可以造成 indels (insertions or deletions) 阻斷 TTR 基因，降低 TTR 的表現和血液裡的 TTR 含量。Intellia 於於去年十月底宣布他們將在英國和紐西蘭開始第一期臨床試驗，參與人數為 38 人，主要是檢測其安全性和有效性 [7]。
今年六月底，Intellia 在 Peripheral Nerve Society (PNS) Annual Meeting 發表了第一期臨床試驗的期中報告，同時也發表在 NEJM，論文裡的參與人數為六位患者，分為兩組不同劑量：0.1 mg/kg 和 0.3 mg/kg。ATTR 患者以靜脈注射的方式接受了一劑 NTLA-2001，然後在 28 天後測量其血清中 TTR 含量。結果顯示接受低劑量(0.1 mg/kg)的患者，其血清的 TTR 減少了 52%，而高劑量組(0.3 mg/kg)的血清 TRR 則減少了 87% [8-11]，比 Onpattro 和 Tegsedi 的 80% 還要好一些，不過 NTLA-2001 的優勢在於它只需一劑，Onpattro 則需每三週施打一次，Tegsedi 也要每週一次 [6, 8]。副作用方面，只有三個人出現輕微副作用，沒有觀察到嚴重副作用。臨床結果發表當週也是他們的 IPO，以每股 $145 的價格上市 [12]。
CTX001 和 NTLA-2001 不同的地方在於 CTX001 是把目標細胞抽出來基因編輯，NTLA-2001 則是需要把 CRISPR-Cas9 送進體內，因此如何讓它到準確地達目標器官或細胞是需要克服的瓶頸。雖說 Intellia 第一期臨床試驗目前看來頗為成功，但因為目標器官是肝臟，大多經由靜脈施打的 liposomes 都會先被肝臟吸收。Dr. Doudna 日前在 CNBC 訪問時表示，CRISPR 基因治療能有局限，要如何把 CRISPR-Cas9 送進目標器官裡仍是個需要解決的難題 [13]，不過要是能克服這個瓶頸，未來便可應用在更多疾病治療上。
Clinical trial: NCT04601051
[2022-09-29 update]
Intellia 研發的、用來治療遺傳性澱粉樣蛋白疾病(hereditary transthyretin amyloidosis, hATTR)的 CRISPR 基因療法 NTLA-2001 的最新報告顯示，只需一劑就夠了。在靜脈施打一劑 NTLA-2001(0.7-mg/kg) 的 28 天後，TTR 降了 93%。
而他們的另一個藥物 NTLA-2002 正在第 1/2 期臨床試驗中，是用來治療罕見疾病 hereditary angioedema (HAE, 遺傳性血管性水腫)，病徵是血液中的 bradykinin (緩激肽, 血管擴張劑)上升，血管外部的體液堆積擠壓到血管，造成血液流通或淋巴液流通不順暢，導致手腳和臉部等部位水腫。HAE 是一種顯性的遺傳疾病，因此只要父母其中之一有這個突變的基因，小孩就有 50% 的機會得到。HAE 是由於 C1 inhibitor (C1-INH) 不足所引起的，C1 inhibitor 是一種 serine protease inhibitor，由基因 SERPING1 表現，SERPING1 的突變會導致 C1 inhibitor 無法表現或是功能缺失。後來研究發現，除了 SERPING1 外，factor XII (F12), plasminogen (PLG) and angiopoietin 1 (ANGPT 1) 的突變也會造成 HAE，95% 的 HAE 是由 SERPING1 突變造成的。C1 inhibitor 主要是抑制 F12 和 kallikrein，因此 C1-INH 不足或功能不正常會導致 F12 和 kallikrein 無法被調控，進而造成 bradykinin 上升。NTLA-2002 即是針對 kallikrein，最新的臨床節果顯示 75 mg 的劑量可以在施打八週後降低血液中 92% 的 kallikrein。
References:
1. H Frangoul et al, CRISPR-Cas9 Gene Editing for Sickle Cell Disease and β-Thalassemia. NEJM (2020)
2. Vertex / Vertex Pharmaceuticals and CRISPR Therapeutics Amend Collaboration for Development, Manufacturing and Commercialization of CTX001™ in Sickle Cell Disease and Beta Thalassemia (April 2021)
3. JD Gillmore et al, CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis. NEJM (2021)
4. GY Park et al, Diagnostic and Treatment Approaches Involving Transthyretin in Amyloidogenic Diseases. Int J Mol Sci (2019)
5. US FDA / FDA approves first-of-its kind targeted RNA-based therapy to treat a rare disease (Aug 2018)
6. Ionis / Akcea and Ionis Receive FDA Approval of TEGSEDI™ (inotersen) for the Treatment of the Polyneuropathy of Hereditary Transthyretin-Mediated Amyloidosis in Adults
7. Gene Online / Intellia Trials CRISPR Drug as Permanent Cure to Fatal Hereditary Disease (Oct 2020)
8. MedCity News / Intellia’s early CRISPR trial data validate a drug pipeline and the gene-editing field (June 2021)
9. CRISPR News / Clinical Trial Update: Positive Data for First Ever In Vivo CRISPR Medicine (June 2021)
10. Clinical Trials Arena / Intellia and Regeneron report positive data of CRISPR therapy for ATTR (June 2021)
11. Intellia and Regeneron Announce Landmark Clinical Data Showing Deep Reduction in Disease-Causing Protein After Single Infusion of NTLA-2001, an Investigational CRISPR Therapy for Transthyretin (ATTR) Amyloidosis (June 2021)
12. BioSpace / Intellia Tops Busy Period with $600 Million IPO
13. CNBC / How CRISPR gene editing will treat diseases in future: Nobel-winning Intellia co-founder Jennifer Doudna
14. Intellia / Intellia Therapeutics Announces Positive Interim Clinical Data for its Second Systemically Delivered Investigational CRISPR Candidate, NTLA-2002 for the Treatment of Hereditary Angioedema (HAE) (Sept 2022)
15. FIERCE Biotech / Intellia's gene editing therapies both post early successes as evidence grows for CRISPR potential
16. Biopharma Dive / Intellia offers first look at CRISPR drug for rare swelling disorder
2021年6月25日 星期五
次單位疫苗(高端 & Novavax)和 mRNA 疫苗的差異
之前看到網路上在吵高端和 Moderna 到底一不一樣，基本上以疫苗型態來講，是不一樣的，因為一個是 mRNA，一個是蛋白質。不過，為什麼有人說高端是把 Moderna 的東西搬過來呢？這裡要先瞭解一下生物最基本的 central dogma。生科的應該都學過 central dogma，就是一個基因序列 (DNA) 要先轉成 mRNA (transcription)，再轉譯成蛋白質 (translation)。
然後，再來說一下高端和 Moderna 疫苗相同和不同地方：
1. 相同：Spike cDNA sequence（因為一個是 DNA，一個是 mRNA，所以我用 cDNA 來表示他們序列是相同的。）根據高端第一期臨床報告內寫的，他用來表現的 Spike 基因序列是根據 Moderna mRNA 的序列 [1]，Moderna 的 Spike mRNA 序列是把兩個氨基酸突變，讓它更穩定 [2]，蛋白結構是根據德州大學 Wrapp et al 第一個發表 Spike cryo-EM 的那篇 [3]。不過雖然 Spike 的 cDNA 序列是一樣的，但不能說技術是相同的。
2. 不同：一個是 mRNA 直接打入人體內，一個是把 cDNA 放進 expression vector，然後在動物細胞裡表現 Spike 蛋白之後，把 Spike 蛋白純化出來後，再打進人體。所以，基本上是不同的技術。另外，兩者的佐劑也不同。
那效果會不會一樣呢？很難講，因為有很多變因。
「理論上」抗原（也就是 Spike）應該會是一樣的（不看 post-translational modification，然後也都 folding properly 的話），因為都是在動物細胞裡表現，只是一個是人類細胞，一個是倉鼠細胞(CHO cells)，不過雖然在細胞裡表現出來是一樣的，但純化的過程中有可能會改變蛋白質的 conformation。另外的變因就是疫苗的佐劑，不同的佐劑引起的免疫反應也會不同，然後就是 mRNA 和蛋白質引起的免疫反應也會有差，所以就算是從相同的 DNA 序列做出來的不同種的疫苗，效果也不見得會相同。
另外，最近 Novavax 的三期臨床結果出來了，效果非常的好，讓有些人認為同是次單位疫苗的高端會不會效果也這麼好。我個人是覺得 Novavax 的效果會這麼好，是因為它的佐劑會讓 Spike protein 黏在一起變得像 virus-like particle (VLP)，整體結構更像病毒，高端是不是這樣就不知道了。
References:
[1] S Hsieh et al, First-in-Human Trial of a Recombinant Stabilized Prefusion SARS-CoV-2 Spike Protein Vaccine with Adjuvant of Aluminum Hydroxide and CpG 1018. medRxiv (2021)
高端的 phase I 報告裡寫它用的設計是依據這個："S-2P protein is a recombinant version of the S protein developed by the laboratory of Dr. Barney S. Graham (Vaccine Research Center, National Institute of Allergy and Infectious Diseases[NIAID], U.S.A.), and is a stabilized prefusion S ectodomain, encoding residues 1-1208 of SARS-CoV-2 spike protein with two proline substitutions at residues 986 and 987, a “GSAS” substitution at residues 682–685 to abolish the furin cleavage site, and a T4 fibritin trimerization motif at the C-terminus."
[2] KS Corbett et al, SARS-CoV-2 mRNA vaccine design enabled by prototype pathogen preparedness. Nature (2020)
Moderna mRNA publication: "Within 24 h of the release of genomic sequences of SARS-CoV-2 isolates on 10 January 2020, the 2P mutations were substituted into S protein residues 986 and 987 to produce prefusion-stabilized SARS-CoV-2 S(2P) protein for structural analysis and serological assay development in silico, without additional experimental validation. Within 5 days of the release of the sequence, current good manufacturing practice (cGMP) production of mRNA–LNP encoding the SARS-CoV-2 S(2P) as a transmembrane-anchored protein with the native furin cleavage site (mRNA-1273) was initiated in parallel with preclinical evaluation."
[3] Wrapp et al, Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science (2020)
相關文章：近期和新冠病毒抗體相關的研究
然後，再來說一下高端和 Moderna 疫苗相同和不同地方：
1. 相同：Spike cDNA sequence（因為一個是 DNA，一個是 mRNA，所以我用 cDNA 來表示他們序列是相同的。）根據高端第一期臨床報告內寫的，他用來表現的 Spike 基因序列是根據 Moderna mRNA 的序列 [1]，Moderna 的 Spike mRNA 序列是把兩個氨基酸突變，讓它更穩定 [2]，蛋白結構是根據德州大學 Wrapp et al 第一個發表 Spike cryo-EM 的那篇 [3]。不過雖然 Spike 的 cDNA 序列是一樣的，但不能說技術是相同的。
2. 不同：一個是 mRNA 直接打入人體內，一個是把 cDNA 放進 expression vector，然後在動物細胞裡表現 Spike 蛋白之後，把 Spike 蛋白純化出來後，再打進人體。所以，基本上是不同的技術。另外，兩者的佐劑也不同。
那效果會不會一樣呢？很難講，因為有很多變因。
「理論上」抗原（也就是 Spike）應該會是一樣的（不看 post-translational modification，然後也都 folding properly 的話），因為都是在動物細胞裡表現，只是一個是人類細胞，一個是倉鼠細胞(CHO cells)，不過雖然在細胞裡表現出來是一樣的，但純化的過程中有可能會改變蛋白質的 conformation。另外的變因就是疫苗的佐劑，不同的佐劑引起的免疫反應也會不同，然後就是 mRNA 和蛋白質引起的免疫反應也會有差，所以就算是從相同的 DNA 序列做出來的不同種的疫苗，效果也不見得會相同。
另外，最近 Novavax 的三期臨床結果出來了，效果非常的好，讓有些人認為同是次單位疫苗的高端會不會效果也這麼好。我個人是覺得 Novavax 的效果會這麼好，是因為它的佐劑會讓 Spike protein 黏在一起變得像 virus-like particle (VLP)，整體結構更像病毒，高端是不是這樣就不知道了。
References:
[1] S Hsieh et al, First-in-Human Trial of a Recombinant Stabilized Prefusion SARS-CoV-2 Spike Protein Vaccine with Adjuvant of Aluminum Hydroxide and CpG 1018. medRxiv (2021)
高端的 phase I 報告裡寫它用的設計是依據這個："S-2P protein is a recombinant version of the S protein developed by the laboratory of Dr. Barney S. Graham (Vaccine Research Center, National Institute of Allergy and Infectious Diseases[NIAID], U.S.A.), and is a stabilized prefusion S ectodomain, encoding residues 1-1208 of SARS-CoV-2 spike protein with two proline substitutions at residues 986 and 987, a “GSAS” substitution at residues 682–685 to abolish the furin cleavage site, and a T4 fibritin trimerization motif at the C-terminus."
[2] KS Corbett et al, SARS-CoV-2 mRNA vaccine design enabled by prototype pathogen preparedness. Nature (2020)
Moderna mRNA publication: "Within 24 h of the release of genomic sequences of SARS-CoV-2 isolates on 10 January 2020, the 2P mutations were substituted into S protein residues 986 and 987 to produce prefusion-stabilized SARS-CoV-2 S(2P) protein for structural analysis and serological assay development in silico, without additional experimental validation. Within 5 days of the release of the sequence, current good manufacturing practice (cGMP) production of mRNA–LNP encoding the SARS-CoV-2 S(2P) as a transmembrane-anchored protein with the native furin cleavage site (mRNA-1273) was initiated in parallel with preclinical evaluation."
[3] Wrapp et al, Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science (2020)
相關文章：近期和新冠病毒抗體相關的研究
2021年6月18日 星期五
AZ/mRNA 疫苗混打的研究整理(20210725 update)
疫苗混合施打似乎是種趨勢，加拿大也加入了，因為 AZ 的罕見血栓問題，National Advisory Committee on Immunization (NACI) 前兩週也建議第一劑施打 AZ 的第二劑可以改選 Pfizer 或 Moderna。因為 Moderna 不足，第一劑施打 Moderna 的第二劑也可以改打 Pfizer。
Science / Mixing COVID-19 vaccines appears to boost immune responses
[2020-06-17 更新] NACI 宣布第一劑施打 AZ 的人第二劑建議改成 mRNA 疫苗。
CBC News / Vaccine committee says provinces should give AstraZeneca recipients a different vaccine for second dose
"An mRNA vaccine is now preferred as the second dose for individuals who received a first dose of the AstraZeneca/COVISHIELD vaccine, based on emerging evidence of a potentially better immune response from this mixed vaccine schedule," NACI said in a statement released today. The "mixed vaccine schedule" refers to the practice of using different products for the first and second doses.
Summary of National Advisory Committee on Immunization statement of June 17, 2021
For second doses, NACI recommends that:
An mRNA vaccine is now preferred as the second dose for individuals who received a first dose of the AstraZeneca/COVISHIELD vaccine, based on emerging evidence of a potentially better immune response from this mixed vaccine schedule and to mitigate the potential risk of VITT associated with viral vector vaccines.
Second doses: What you need to know
- Emerging evidence from studies in Germany suggests a potentially better immune response, including against variants of concern, when a first dose of the AstraZeneca vaccine is followed by a second dose of the Pfizer-BioNTech mRNA vaccine, compared to two doses of the AstraZeneca vaccine.
- Evidence continues to suggest a first dose of the AstraZeneca vaccine followed by a second dose of the Pfizer-BioNTech mRNA vaccine has a good safety profile. As such, NACI recommends that an mRNA COVID-19 vaccine is now preferred as the second dose for individuals who received a first dose of the AstraZeneca/COVISHIELD vaccine.
- Receiving an mRNA vaccine as a second dose also mitigates the rare risk of VITT that is associated with viral vector vaccines. The rate of VITT after the second dose of the AstraZeneca/COVISHIELD vaccine appears to be lower than with the first dose but has increased over time, with current estimates of approximately 1 per 600,000 people vaccinated.
- Individuals should consider talking to a health care professional to help understand the best option for their situation.
目前有四個臨床實驗報告，分別是英國、西班牙和德國的三個。
英國：AZ & BNT (Com-COV, Phase II)
RH Shaw et al, Heterologous prime-boost COVID-19 vaccination: initial reactogenicity data. Lancet (2021)
X Liu et al, Safety and Immunogenicity Report from the Com-COV Study – a Single-Blind Randomised Non-Inferiority Trial Comparing Heterologous And Homologous Prime-Boost Schedules with An Adenoviral Vectored and mRNA COVID-19 Vaccine. SSRN (2021)
時間：Feb 21-26, 2021
Participants: 50-69 years, total 830 participants
Combination (prime - boost):
1. AZ - AZ (10%)
2. AZ - BNT (34%)
3. BNT - BNT (21%)
4. BNT - AZ (41%)
(): 第二劑後的發燒比例
Interval: 28-day (4-week, 463 participants), 84-day (12-week, 367 participants)
疫苗反應(reactogenicity)：AZ - BNT 的在第二劑後的反應，包括發燒、頭痛、肌肉痠痛、疲倦等等，比兩劑都是 AZ 的比例高，BNT - AZ 的則是第二劑後的反應比兩劑都是 BNT 的比例高。沒有比較間隔四週和十二週的差別，間隔十二週的有疫苗反應的比例是否比間隔四週的低？
免疫反應(immunogenicity)：以抗 Spike IgG 的抗體量來說，第一劑施打的兩週後，BNT 是 AZ 的 6.5 倍（GMC 843 & 129 ELU/ml, respectively)：四週後，BNT 是 AZ 的三倍左右（GMC 1597 & 555 ELU/ml, respectively）。免疫細胞反應的話，則是 AZ 比較高，第一劑兩週後 AZ 是 BNT 的 4.6 倍(160 vs. 35 SFC/10^6 PBMCs)，四週後 AZ 則是 BNT 的 3.4 倍(54 vs. 16)，不過跟兩週後的反應相比，兩者都下降了不少。
第二劑施打的 28 天後，測到的 anti-Spike IgG 抗體量 AZ/BNT 是 AZ/AZ 的 9.2 倍（GMC 12,906 ELU/ml & 1,392 ELU/ml, respectively)，BNT/AZ 則只有 BNT/BNT 的一半左右（GMC 7,133 ELU/ml & 14,080 ELU/ml, respectively)。AZ/BNT 則和兩劑都是 BNT 的差不多。中和抗體量的話，AZ/BNT 則是 AZ/AZ 的 8.5 倍。他們也測了免疫 T cells 的反應，AZ/BNT (185 SFC/10^6 PBMCs)的最高，是 AZ/AZ (50 SFC) 的三倍多，BNT/BNT (80 SFC) 和 BNT/AZ (99 SFC) 的兩倍左右。
註：SFC/10^6 PBMCs = spot forming cells (SFC) per 10^6 peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)
西班牙：AZ & BNT (CombiVacS, Phase II)
AM Borobia et al, Immunogenicity and reactogenicity of BNT162b2 booster in ChAdOx1-S-primed participants (CombiVacS): a multicentre, open-label, randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet (2021)
時間：April 24 -30, 2021
Participants: 18-60 years, 663 participants (448 BNT, 225 no vaccine)
Combination:
1. AZ (prime) - BNT (boost)
2. AZ (prime) only
Interval: 8-9 weeks (273 participants, 61%), 10-12 weeks (176 participants, 39%)
疫苗反應(reactogenicity)：對疫苗反應的比例，輕微的有 68%，中度的有 30%，其中打針部位疼痛的有 88%，頭痛的有 44%，肌肉酸痛的有 43%，發燒的只有 2.5%，沒有觀察到有嚴重副作用，觀察時間為第二劑施打後十四天內。
免疫反應(immunogenicity)：第二劑施打十四天內便觀察到強烈的免疫反應，所以人兩週後都可檢測到中和抗體，比控制組多 45 倍，並且也有強烈的 T cell 反應。但要注意的是控制組是沒施打第二劑的，而不是兩劑都施打 AZ 或 BNT 的。
德國 #1：AZ & BNT (COVIM, Phase 2/3)
D Hillus et al, Safety, reactogenicity, and immunogenicity of homologous and heterologous prime-boost immunisation with ChAdOx1-nCoV19 and BNT162b2: a prospective cohort study. medRxiv (2021)
時間：Dec 27, 2020 - May 21, 2021
Participants: 29-51 years, 340 healthcare workers
Combination & Interval:
1. BNT (prime) - BNT (boost): 3 weeks
2. AZ (prime) - BNT (boost): 10-12 weeks
疫苗反應(reactogenicity)：對疫苗的反應比較嚴重情況大多是在第一劑 AZ 施打後和兩劑都是 BNT 的第二劑 BNT，包括發燒、疲憊、頭痛和肌肉酸痛等等，AZ/BNT 在第二季後的反應稍微低一點。
AZ (prime, 86%) - BNT (boost, 51.5%)
BNT (prime, 39%) - BNT (boost, 65%)
(): 第一劑或第二劑後的副作用比例
免疫反應(immunogenicity)：打了第二劑的三週後，兩組的 anti-Spike IgG 抗體量差不多，中和抗體量也差不多，但是 AZ/BNT 那組的 T cell 反應比較高。
由以上知道，AZ/BNT 兩者間隔 10-12 週是可行的，疫苗的副作用在可以忍受的範圍，沒有觀察到嚴重副作用，而且免疫反應很好。限制就是沒跟 AZ/AZ 比較，不知道疫苗副作用和疫苗反應是否比較大，另外就是這個臨床試驗的參與者年紀都在六十歲以下，不知道六十歲以上是否可行，不過這個年齡層的研究英國有做。
德國 #2：AZ & BNT
R Groß et al, Heterologous ChAdOx1 nCoV-19 and BNT162b2 prime-boost vaccination elicits potent neutralizing antibody responses and T cell reactivity. medRxiv (2021)
時間：not mentioned
Participants: 26, aged 25-46
Combination & Interval: 8 weeks (56 days)（都是 AZ/BNT，沒有對照組。）
疫苗反應(reactogenicity)：大部分人多是第一劑 AZ (prime)後比較大，第二劑 BNT (boost)後比較小。88% 的人表示在第一劑 AZ 後有輕微到中度副作用，以頭痛、畏寒、發燒和疲憊居多。81% 的人表示在第二劑 BNT 後有輕微到中度副作用，主要是疲憊和一點肌肉酸痛。兩劑後都有的副作用是施打部位疼痛，分別為 92% (AZ) 和 85% (BNT)。相較之下，間隔四週的疫苗反應比較大，相隔八週和十二週的都還好。
免疫反應(immunogenicity)：有六成的人在第一劑的兩週後就可測到抗體，IgG 在一個月到達到高峰。在第二劑的 BNT 施打一週後，所有人都可測到 IgG，九成的人可測到 IgA，但是在兩週後所有人都可測到 IgG 和 IgA，抗體量也在第二劑一週到兩週後增加了一百到八千倍，是兩劑都打 BNT 的八倍。所有人在第二劑的兩週後也都有中和抗體，對抗 VOC (variant of concern) B.1.1.7 (alpha, 英國株)的抗體是兩劑都打 BNT 的近四倍，對抗 VOC B1.351 (beta, 南非株)和 B.1.617 (delta, 印度株)的效力也比較好。另外，AZ/BNT 引起的 T cell 反應在第二劑的兩週後也很好。不過，文章裡面並沒有兩劑都是 BNT 對照組的資料，例如人數和年齡層等等，不知道是怎麼比出來的。
德國 #3：AZ & BNT/Moderna (not clinical trial, recruited from real world)
T Schmidt et al, Immunogenicity and reactogenicity of heterologous ChAdOx1 nCoV-19/mRNA vaccination. Nature Medicine (2021)
時間：Jan - April, 2021
Participants: 250 (mostly Saarland University Medical Center employee)
1. AZ (prime) - AZ (boost): 55, aged (mean) 48.6
2. AZ (prime) - BNT or Moderna (boost): 97, aged (mean) 40.7
3. homologous BNT/Moderna (prime) - BNT/Moderna (boost): 64, aged (mean) 44.5
註：在今年三月德國宣佈暫時停止施打 AZ 疫苗後，六十歲以上的被建議第二劑還是打 AZ，六十歲以下的則是建議換打 mRNA 疫苗，不過要選第二劑還是打 AZ 也是可以的，因此兩劑都打 AZ 的那組年齡層會比較高。
Combination & Interval:
1. AZ (prime) - AZ (boost): 10.8 weeks
2. AZ (prime) - BNT or Moderna (boost): 11.2 weeks
3. homologous BNT/Moderna (prime) - BNT/Moderna (boost): 4.3 weeks
疫苗反應(reactogenicity)：大部分都出現在施打後一週內，不管第一劑還是第二劑，都有施打部位疼痛的現象。以第一劑來講，AZ 疫苗引起的反意比較大，包括發燒、畏寒、頭痛和疲憊等等。第二劑的話，AZ 產生不適感的比例少很多，mRNA 疫苗的話則不管第一劑是打 AZ 還是 mRNA 疫苗，兩者的不適感都差不多，雖然比第二劑是 AZ 的還要大，但是比第一劑打 AZ 後的小很多，且在可以忍受的範圍內。雖然英國 Com-COV 的臨床試驗中，混打的不適反應比兩者打一樣的嚴重很多，不過可能是因為英國的兩劑只相隔四週，這個結果和德國的另一個報告(Groß et al, medRvix 2021)相符合。
免疫反應(immunogenicity)：所有人體內都有抗 Spike IgG 抗體，不過施打 AZ-mRNA 疫苗和兩劑 mRNA 疫苗的 IgG 比兩劑都 AZ 還要高十倍左右。中和抗體的話，AZ-mRNA 疫苗和兩劑都是 mRNA 疫苗用 sNT (surrogate neutralization test)測出來都有 100% 的抑制力(inhibitory activity)，兩劑都是 AZ 的比較低。另外，AZ-mRNA 疫苗和兩劑 mRNA 疫苗可以引起顯著的 CD4+ T (helper) cells 反應，比兩劑都是 AZ 的高很多。有趣的是 AZ-mRNA 疫苗引起最高的 CD8+ (killer) T cell 反應，不只比兩劑都是 AZ 的高很多，也比兩劑都是 mRNA 疫苗的還高。
新聞稿：idw / Medical study: Mix-and-match vaccines generate a particularly strong immune response
"This provides quite striking evidence that a double dose of the AstraZeneca vaccine is not able to mobilize the body’s immune responses as strongly as the other two vaccination regimens."
其實我覺得這也不算很意外，J&J 都可以只有一劑了，AZ 為什麼需要兩劑，而且 AZ 用的還是人類體內不會有的黑猩猩腺病毒？照理說效果應該要比 J&J 還要好，一個可能的原因就是 J&J 評估過後認為第二劑並沒有讓效果更好，所以就乾脆不要第二劑。如果是這樣的話，兩劑的 AZ 沒有比第一劑 AZ 第二劑 BNT 的效果好，也算是預料之內吧？
德國 #4：AZ & BNT (CoCo Study, Phase I/II)
J Barros-Martins et al, Immune responses against SARS-CoV-2 variants after heterologous and homologous ChAdOx1 nCoV-19/BNT162b2 vaccination. Nature Medicine (2021)
時間：Jan 2021 - ongoing
Participants: 1493 healthcare professionals (HCPs) from Hannover Medical School with potential contact to SARS-CoV-2, 19-64 yrs (mean = 38 yrs)
Combination & intervals:
1. AZ (prime) - BNT (boost): 2-3 months; 55 participants
2. AZ (prime) - AZ (boost): 2-3 months; 32 participants
3. BNT (prime) - BNT (boost): 21 days; 46 participants
疫苗反應(reactogenicity)：n/a
免疫反應(immunogenicity)：
1. AZ primed: anti-Spike IgG declined by 42%; anti-Spike IgA declined by 66% after 30 days; only 44%-53% individuals have detectable Spike-specific memory B cells; 施打兩到三週後，大多數人都有產生抗武漢株的中和抗體，但有產生抗英國株(alpha, B.1.1.7)、南非株(beta, B.1.135)和巴西株(gamma, P.1)的中和抗體的人卻不多，只有 19% (alpha), 5.7% (beta), 14% (gamma) 的人有產生中和抗體，而且中和抗體量也很低。
2. AZ/AZ: anti-Spike IgG increases 2.9-fold; Spike-specific memory B cells increases (~2.5-fold) in all individuals; 抗武漢株和英國株的中和抗體皆有增加，但抗南非株和巴西株的中和抗體沒什麼增加，也就是非常低。CD4+ (helper) 和 CD8+ (killer) T cells 皆有增加。 3. AZ/BNT: anti-Spike IgG increases 11.5-fold; Spike-specific memory B cells increases (~6.5-fold) in all individuals; 抗武漢株、英國株、南非株和巴西株的中和抗體皆大幅增加，但中和抗體量以抗武漢株的最高，再來是英國株，抗南非株和巴西株的較低。CD4+ (helper) 和 CD8+ (killer) T cells 皆有增加，而且比 AZ/AZ 組合高很多。
總結：不管在抗武漢株和 VOCs 的中和抗體，還是 T cells 免疫反應上，AZ/BNT 的效果都比 AZ/AZ 組好，而中和抗體量則和 BNT/BNT 的則差不多。
瑞典：AZ/Moderna (CoVacc)
J Normark et al, Heterologous ChAdOx1 nCoV-19 and mRNA-1273 Vaccination. NEJM (2021)
時間：March 2021 - ongoing
Participants: 88; plan to enroll up to 3000
Combination:
1. AZ/AZ: 37 participants; 28-62 yrs (mean = 46 yrs)
2. AZ/Moderna: 51 participants, 23-59 yrs (mean = 40 yrs)
Intervals: 9-12 weeks
疫苗反應(reactogenicity)：頭痛、畏寒和肌肉酸痛的情況在第二劑 Moderna 組的比例比較多，但嚴重程度兩組差不多。
免疫反應(immunogenicity)：
1. AZ/AZ: 第二劑施打七到十天後，anti-Spike & anti-RBD IgG 比施打當天高五倍，anti-Spike IgG 量則維持到施打後三十天後。中和抗體量則比施打當天高一倍，一個月後則比一週後高了 1.6-1.7 倍，但沒有可對抗南非株的中和抗體，和德國(#4)的結果一致。
2. AZ/Moderna: 第二季施打七到十天後，anti-Spike IgG 比施打當天高 115 倍，而且維持到施打後三十天後，anti-RBD 則比施打當天高 125 倍。中和抗體量則比施打當天高 20 倍，第二季施打七到十天後，一個月後則比一週後高了 1.6-1.7 倍，並且有抗南非株(B.1.135)的中和抗體。
（按圖可以放大）
Science / Mixing COVID-19 vaccines appears to boost immune responses
[2020-06-17 更新] NACI 宣布第一劑施打 AZ 的人第二劑建議改成 mRNA 疫苗。
CBC News / Vaccine committee says provinces should give AstraZeneca recipients a different vaccine for second dose
"An mRNA vaccine is now preferred as the second dose for individuals who received a first dose of the AstraZeneca/COVISHIELD vaccine, based on emerging evidence of a potentially better immune response from this mixed vaccine schedule," NACI said in a statement released today. The "mixed vaccine schedule" refers to the practice of using different products for the first and second doses.
Summary of National Advisory Committee on Immunization statement of June 17, 2021
For second doses, NACI recommends that:
An mRNA vaccine is now preferred as the second dose for individuals who received a first dose of the AstraZeneca/COVISHIELD vaccine, based on emerging evidence of a potentially better immune response from this mixed vaccine schedule and to mitigate the potential risk of VITT associated with viral vector vaccines.
Second doses: What you need to know
- Emerging evidence from studies in Germany suggests a potentially better immune response, including against variants of concern, when a first dose of the AstraZeneca vaccine is followed by a second dose of the Pfizer-BioNTech mRNA vaccine, compared to two doses of the AstraZeneca vaccine.
- Evidence continues to suggest a first dose of the AstraZeneca vaccine followed by a second dose of the Pfizer-BioNTech mRNA vaccine has a good safety profile. As such, NACI recommends that an mRNA COVID-19 vaccine is now preferred as the second dose for individuals who received a first dose of the AstraZeneca/COVISHIELD vaccine.
- Receiving an mRNA vaccine as a second dose also mitigates the rare risk of VITT that is associated with viral vector vaccines. The rate of VITT after the second dose of the AstraZeneca/COVISHIELD vaccine appears to be lower than with the first dose but has increased over time, with current estimates of approximately 1 per 600,000 people vaccinated.
- Individuals should consider talking to a health care professional to help understand the best option for their situation.
目前有四個臨床實驗報告，分別是英國、西班牙和德國的三個。
英國：AZ & BNT (Com-COV, Phase II)
RH Shaw et al, Heterologous prime-boost COVID-19 vaccination: initial reactogenicity data. Lancet (2021)
X Liu et al, Safety and Immunogenicity Report from the Com-COV Study – a Single-Blind Randomised Non-Inferiority Trial Comparing Heterologous And Homologous Prime-Boost Schedules with An Adenoviral Vectored and mRNA COVID-19 Vaccine. SSRN (2021)
時間：Feb 21-26, 2021
Participants: 50-69 years, total 830 participants
Combination (prime - boost):
1. AZ - AZ (10%)
2. AZ - BNT (34%)
3. BNT - BNT (21%)
4. BNT - AZ (41%)
(): 第二劑後的發燒比例
Interval: 28-day (4-week, 463 participants), 84-day (12-week, 367 participants)
疫苗反應(reactogenicity)：AZ - BNT 的在第二劑後的反應，包括發燒、頭痛、肌肉痠痛、疲倦等等，比兩劑都是 AZ 的比例高，BNT - AZ 的則是第二劑後的反應比兩劑都是 BNT 的比例高。沒有比較間隔四週和十二週的差別，間隔十二週的有疫苗反應的比例是否比間隔四週的低？
免疫反應(immunogenicity)：以抗 Spike IgG 的抗體量來說，第一劑施打的兩週後，BNT 是 AZ 的 6.5 倍（GMC 843 & 129 ELU/ml, respectively)：四週後，BNT 是 AZ 的三倍左右（GMC 1597 & 555 ELU/ml, respectively）。免疫細胞反應的話，則是 AZ 比較高，第一劑兩週後 AZ 是 BNT 的 4.6 倍(160 vs. 35 SFC/10^6 PBMCs)，四週後 AZ 則是 BNT 的 3.4 倍(54 vs. 16)，不過跟兩週後的反應相比，兩者都下降了不少。
第二劑施打的 28 天後，測到的 anti-Spike IgG 抗體量 AZ/BNT 是 AZ/AZ 的 9.2 倍（GMC 12,906 ELU/ml & 1,392 ELU/ml, respectively)，BNT/AZ 則只有 BNT/BNT 的一半左右（GMC 7,133 ELU/ml & 14,080 ELU/ml, respectively)。AZ/BNT 則和兩劑都是 BNT 的差不多。中和抗體量的話，AZ/BNT 則是 AZ/AZ 的 8.5 倍。他們也測了免疫 T cells 的反應，AZ/BNT (185 SFC/10^6 PBMCs)的最高，是 AZ/AZ (50 SFC) 的三倍多，BNT/BNT (80 SFC) 和 BNT/AZ (99 SFC) 的兩倍左右。
註：SFC/10^6 PBMCs = spot forming cells (SFC) per 10^6 peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)
西班牙：AZ & BNT (CombiVacS, Phase II)
AM Borobia et al, Immunogenicity and reactogenicity of BNT162b2 booster in ChAdOx1-S-primed participants (CombiVacS): a multicentre, open-label, randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet (2021)
時間：April 24 -30, 2021
Participants: 18-60 years, 663 participants (448 BNT, 225 no vaccine)
Combination:
1. AZ (prime) - BNT (boost)
2. AZ (prime) only
Interval: 8-9 weeks (273 participants, 61%), 10-12 weeks (176 participants, 39%)
疫苗反應(reactogenicity)：對疫苗反應的比例，輕微的有 68%，中度的有 30%，其中打針部位疼痛的有 88%，頭痛的有 44%，肌肉酸痛的有 43%，發燒的只有 2.5%，沒有觀察到有嚴重副作用，觀察時間為第二劑施打後十四天內。
免疫反應(immunogenicity)：第二劑施打十四天內便觀察到強烈的免疫反應，所以人兩週後都可檢測到中和抗體，比控制組多 45 倍，並且也有強烈的 T cell 反應。但要注意的是控制組是沒施打第二劑的，而不是兩劑都施打 AZ 或 BNT 的。
德國 #1：AZ & BNT (COVIM, Phase 2/3)
D Hillus et al, Safety, reactogenicity, and immunogenicity of homologous and heterologous prime-boost immunisation with ChAdOx1-nCoV19 and BNT162b2: a prospective cohort study. medRxiv (2021)
時間：Dec 27, 2020 - May 21, 2021
Participants: 29-51 years, 340 healthcare workers
Combination & Interval:
1. BNT (prime) - BNT (boost): 3 weeks
2. AZ (prime) - BNT (boost): 10-12 weeks
疫苗反應(reactogenicity)：對疫苗的反應比較嚴重情況大多是在第一劑 AZ 施打後和兩劑都是 BNT 的第二劑 BNT，包括發燒、疲憊、頭痛和肌肉酸痛等等，AZ/BNT 在第二季後的反應稍微低一點。
AZ (prime, 86%) - BNT (boost, 51.5%)
BNT (prime, 39%) - BNT (boost, 65%)
(): 第一劑或第二劑後的副作用比例
免疫反應(immunogenicity)：打了第二劑的三週後，兩組的 anti-Spike IgG 抗體量差不多，中和抗體量也差不多，但是 AZ/BNT 那組的 T cell 反應比較高。
由以上知道，AZ/BNT 兩者間隔 10-12 週是可行的，疫苗的副作用在可以忍受的範圍，沒有觀察到嚴重副作用，而且免疫反應很好。限制就是沒跟 AZ/AZ 比較，不知道疫苗副作用和疫苗反應是否比較大，另外就是這個臨床試驗的參與者年紀都在六十歲以下，不知道六十歲以上是否可行，不過這個年齡層的研究英國有做。
德國 #2：AZ & BNT
R Groß et al, Heterologous ChAdOx1 nCoV-19 and BNT162b2 prime-boost vaccination elicits potent neutralizing antibody responses and T cell reactivity. medRxiv (2021)
時間：not mentioned
Participants: 26, aged 25-46
Combination & Interval: 8 weeks (56 days)（都是 AZ/BNT，沒有對照組。）
疫苗反應(reactogenicity)：大部分人多是第一劑 AZ (prime)後比較大，第二劑 BNT (boost)後比較小。88% 的人表示在第一劑 AZ 後有輕微到中度副作用，以頭痛、畏寒、發燒和疲憊居多。81% 的人表示在第二劑 BNT 後有輕微到中度副作用，主要是疲憊和一點肌肉酸痛。兩劑後都有的副作用是施打部位疼痛，分別為 92% (AZ) 和 85% (BNT)。相較之下，間隔四週的疫苗反應比較大，相隔八週和十二週的都還好。
免疫反應(immunogenicity)：有六成的人在第一劑的兩週後就可測到抗體，IgG 在一個月到達到高峰。在第二劑的 BNT 施打一週後，所有人都可測到 IgG，九成的人可測到 IgA，但是在兩週後所有人都可測到 IgG 和 IgA，抗體量也在第二劑一週到兩週後增加了一百到八千倍，是兩劑都打 BNT 的八倍。所有人在第二劑的兩週後也都有中和抗體，對抗 VOC (variant of concern) B.1.1.7 (alpha, 英國株)的抗體是兩劑都打 BNT 的近四倍，對抗 VOC B1.351 (beta, 南非株)和 B.1.617 (delta, 印度株)的效力也比較好。另外，AZ/BNT 引起的 T cell 反應在第二劑的兩週後也很好。不過，文章裡面並沒有兩劑都是 BNT 對照組的資料，例如人數和年齡層等等，不知道是怎麼比出來的。
德國 #3：AZ & BNT/Moderna (not clinical trial, recruited from real world)
T Schmidt et al, Immunogenicity and reactogenicity of heterologous ChAdOx1 nCoV-19/mRNA vaccination. Nature Medicine (2021)
時間：Jan - April, 2021
Participants: 250 (mostly Saarland University Medical Center employee)
1. AZ (prime) - AZ (boost): 55, aged (mean) 48.6
2. AZ (prime) - BNT or Moderna (boost): 97, aged (mean) 40.7
3. homologous BNT/Moderna (prime) - BNT/Moderna (boost): 64, aged (mean) 44.5
註：在今年三月德國宣佈暫時停止施打 AZ 疫苗後，六十歲以上的被建議第二劑還是打 AZ，六十歲以下的則是建議換打 mRNA 疫苗，不過要選第二劑還是打 AZ 也是可以的，因此兩劑都打 AZ 的那組年齡層會比較高。
Combination & Interval:
1. AZ (prime) - AZ (boost): 10.8 weeks
2. AZ (prime) - BNT or Moderna (boost): 11.2 weeks
3. homologous BNT/Moderna (prime) - BNT/Moderna (boost): 4.3 weeks
疫苗反應(reactogenicity)：大部分都出現在施打後一週內，不管第一劑還是第二劑，都有施打部位疼痛的現象。以第一劑來講，AZ 疫苗引起的反意比較大，包括發燒、畏寒、頭痛和疲憊等等。第二劑的話，AZ 產生不適感的比例少很多，mRNA 疫苗的話則不管第一劑是打 AZ 還是 mRNA 疫苗，兩者的不適感都差不多，雖然比第二劑是 AZ 的還要大，但是比第一劑打 AZ 後的小很多，且在可以忍受的範圍內。雖然英國 Com-COV 的臨床試驗中，混打的不適反應比兩者打一樣的嚴重很多，不過可能是因為英國的兩劑只相隔四週，這個結果和德國的另一個報告(Groß et al, medRvix 2021)相符合。
免疫反應(immunogenicity)：所有人體內都有抗 Spike IgG 抗體，不過施打 AZ-mRNA 疫苗和兩劑 mRNA 疫苗的 IgG 比兩劑都 AZ 還要高十倍左右。中和抗體的話，AZ-mRNA 疫苗和兩劑都是 mRNA 疫苗用 sNT (surrogate neutralization test)測出來都有 100% 的抑制力(inhibitory activity)，兩劑都是 AZ 的比較低。另外，AZ-mRNA 疫苗和兩劑 mRNA 疫苗可以引起顯著的 CD4+ T (helper) cells 反應，比兩劑都是 AZ 的高很多。有趣的是 AZ-mRNA 疫苗引起最高的 CD8+ (killer) T cell 反應，不只比兩劑都是 AZ 的高很多，也比兩劑都是 mRNA 疫苗的還高。
新聞稿：idw / Medical study: Mix-and-match vaccines generate a particularly strong immune response
"This provides quite striking evidence that a double dose of the AstraZeneca vaccine is not able to mobilize the body’s immune responses as strongly as the other two vaccination regimens."
其實我覺得這也不算很意外，J&J 都可以只有一劑了，AZ 為什麼需要兩劑，而且 AZ 用的還是人類體內不會有的黑猩猩腺病毒？照理說效果應該要比 J&J 還要好，一個可能的原因就是 J&J 評估過後認為第二劑並沒有讓效果更好，所以就乾脆不要第二劑。如果是這樣的話，兩劑的 AZ 沒有比第一劑 AZ 第二劑 BNT 的效果好，也算是預料之內吧？
德國 #4：AZ & BNT (CoCo Study, Phase I/II)
J Barros-Martins et al, Immune responses against SARS-CoV-2 variants after heterologous and homologous ChAdOx1 nCoV-19/BNT162b2 vaccination. Nature Medicine (2021)
時間：Jan 2021 - ongoing
Participants: 1493 healthcare professionals (HCPs) from Hannover Medical School with potential contact to SARS-CoV-2, 19-64 yrs (mean = 38 yrs)
Combination & intervals:
1. AZ (prime) - BNT (boost): 2-3 months; 55 participants
2. AZ (prime) - AZ (boost): 2-3 months; 32 participants
3. BNT (prime) - BNT (boost): 21 days; 46 participants
疫苗反應(reactogenicity)：n/a
免疫反應(immunogenicity)：
1. AZ primed: anti-Spike IgG declined by 42%; anti-Spike IgA declined by 66% after 30 days; only 44%-53% individuals have detectable Spike-specific memory B cells; 施打兩到三週後，大多數人都有產生抗武漢株的中和抗體，但有產生抗英國株(alpha, B.1.1.7)、南非株(beta, B.1.135)和巴西株(gamma, P.1)的中和抗體的人卻不多，只有 19% (alpha), 5.7% (beta), 14% (gamma) 的人有產生中和抗體，而且中和抗體量也很低。
2. AZ/AZ: anti-Spike IgG increases 2.9-fold; Spike-specific memory B cells increases (~2.5-fold) in all individuals; 抗武漢株和英國株的中和抗體皆有增加，但抗南非株和巴西株的中和抗體沒什麼增加，也就是非常低。CD4+ (helper) 和 CD8+ (killer) T cells 皆有增加。 3. AZ/BNT: anti-Spike IgG increases 11.5-fold; Spike-specific memory B cells increases (~6.5-fold) in all individuals; 抗武漢株、英國株、南非株和巴西株的中和抗體皆大幅增加，但中和抗體量以抗武漢株的最高，再來是英國株，抗南非株和巴西株的較低。CD4+ (helper) 和 CD8+ (killer) T cells 皆有增加，而且比 AZ/AZ 組合高很多。
總結：不管在抗武漢株和 VOCs 的中和抗體，還是 T cells 免疫反應上，AZ/BNT 的效果都比 AZ/AZ 組好，而中和抗體量則和 BNT/BNT 的則差不多。
瑞典：AZ/Moderna (CoVacc)
J Normark et al, Heterologous ChAdOx1 nCoV-19 and mRNA-1273 Vaccination. NEJM (2021)
時間：March 2021 - ongoing
Participants: 88; plan to enroll up to 3000
Combination:
1. AZ/AZ: 37 participants; 28-62 yrs (mean = 46 yrs)
2. AZ/Moderna: 51 participants, 23-59 yrs (mean = 40 yrs)
Intervals: 9-12 weeks
疫苗反應(reactogenicity)：頭痛、畏寒和肌肉酸痛的情況在第二劑 Moderna 組的比例比較多，但嚴重程度兩組差不多。
免疫反應(immunogenicity)：
1. AZ/AZ: 第二劑施打七到十天後，anti-Spike & anti-RBD IgG 比施打當天高五倍，anti-Spike IgG 量則維持到施打後三十天後。中和抗體量則比施打當天高一倍，一個月後則比一週後高了 1.6-1.7 倍，但沒有可對抗南非株的中和抗體，和德國(#4)的結果一致。
2. AZ/Moderna: 第二季施打七到十天後，anti-Spike IgG 比施打當天高 115 倍，而且維持到施打後三十天後，anti-RBD 則比施打當天高 125 倍。中和抗體量則比施打當天高 20 倍，第二季施打七到十天後，一個月後則比一週後高了 1.6-1.7 倍，並且有抗南非株(B.1.135)的中和抗體。
（按圖可以放大）2021年6月5日 星期六
CH 上關於新冠疫苗的討論 20210604
這篇只是簡單記錄一下昨天在 ClubHouse 上聽到的討論，前半段是討論 Nature Medicine 那篇論文 [1]，應該很多人都看過了，就不在這篇裡敘述（除非哪天心血來潮想寫一下）。
1.
台灣的 CDMO：台康、永昕產能 2000 L，之前有接洽過 AZ 看能不能代工，但似乎因為量產達不到而不了了之。要擴大量產需要大量資金，需要政府幫忙，like Samsung Biologics。
韓國的 CDMO：1,5000L bioreactor x 8~10
2.
瑞士的疫苗施打率很低，因為買不到，於是和 Moderna 合作，由瑞士公司 Lonza 生產以供內需，徵召碩博士生去做疫苗，月薪七千瑞士法郎，為期三到六個月。
3.
有人問：聯亞有二期三期合併，高端感覺還要很久，為什麼現在都在討論高端，沒有在討論聯亞？
答：因為高端有股票上市吧哈哈 XD
4.
台灣的二期要多少人？當初有人在討論要一千人還是三千人，講一千人想的是還是要三期，擴大到三千人想的是二期過了就直接 EUA。三千人的來源是 FDA 的 safety guideline，TFDA 先設了這個 criteria 後高端和聯亞才把臨床設計做成第二期三千人。
5.
高端計畫在巴拉圭做 1:7 的三期臨床試驗。台灣的二期沒有真的雙盲，三期才有雙盲。二期預計六月解盲，但沒什麼好解盲的，一定是成功的，有抗體就是打疫苗，沒抗體就是打食鹽水，二期只看一點點 efficacy 沒那麼重要，三期看 efficacy 比較重要。
6.
台灣和後來才出來的新冠疫苗會越來越沒有做傳統三期的條件，因此 WHO 前兩天才開會討論 Nature Medicine 那篇 paper [1]，看能不能做 immunobridging，用中和抗體效價取代傳統三期。
7.
台灣好像有兩家公司做 mRNA，但是技術不夠。
8.
mRNA & adenoviral vaccine CQA (critical quality attribute) 應該沒有 biological potency assays，mRNA 所知的 guideline 是看 purity, identity, in vitro expression (WB)。Adenovirus 的話可能是 strain identity, TCID50 assay, qPCR，但是病毒的 batch-to-batch variability 很高，包括用於 gene therapy 的 AAV，不知道各廠是如何確定每個 batch 的品質是一致的。
9.
關於 Nature Medicine 那篇有些 limitations，例如每個疫苗檢測的方法都不一樣、不知道康復者的抗體是感染幾天後的，要怎麼知道康復者體內的哪幾株中和抗體(neutralizaing antibodies)是有保護力的等等。
註：那篇裡面分析的疫苗有 Moderna (mRNA-1273), Novavax (NVX-CoV2373), BioNtech/Pfizer (BNT162b2), Sputnik V (rAd26-S+rAd5-S), Oxfored/AZ (ChAdOx1 nCoV-19), J&J Janssen (Ad26.COV2.S) 和中國的科興疫苗 CoronaVac (inactivated)，中和抗體的分析結果和 Phase III 的差不多，兩支 mRNA 的表現最好，中和抗體也最多，科興的最差，中和抗體也最少。
相關文章：又一篇新冠病毒的小抗體研究
如果真的要做 immunobridging，要用哪些抗體當作 markers 或 reference，每隻疫苗產生的抗體都不太一樣，要怎麼確定有產生那幾株抗體就表示有保護力？如果某個疫苗沒產生那些抗體，就代表沒保護力嗎？之前有研究顯示，不只抗體有保護力，感染後產生的 T cells 也有保護力，這些要包括在內嗎？
相關文章：新冠病毒感染者體內 T 細胞的免疫反應
Moderna 在青少年的臨床試驗上，便是看免疫反應 [2, 3]，但那是因為是同一隻抗體，檢測的方法也是一致的。
10.
Regeneron mAb cocktail 只有兩株抗體 [4]，是從老鼠體內釣出來後再 humanized。
References:
1. DS Khoury et al, Neutralizing antibody levels are highly predictive of immune protection from symptomatic SARS-CoV-2 infection. Nature Medicine (2021)
2. Moderna Press Release / Moderna Announces TeenCOVE Study of its COVID-19 Vaccine in Adolescents Meets Primary Endpoint and Plans to Submit Data to Regulators in Early June (May 2021)
3. UMass Med News / Moderna’s TeenCOVE study of COVID-19 vaccine, with UMMS participants, meets primary endpoints (May 2021)
4. FDA / Coronavirus (COVID-19) Update: FDA Authorizes Monoclonal Antibodies for Treatment of COVID-19 (Nov 2020)
1.
台灣的 CDMO：台康、永昕產能 2000 L，之前有接洽過 AZ 看能不能代工，但似乎因為量產達不到而不了了之。要擴大量產需要大量資金，需要政府幫忙，like Samsung Biologics。
韓國的 CDMO：1,5000L bioreactor x 8~10
2.
瑞士的疫苗施打率很低，因為買不到，於是和 Moderna 合作，由瑞士公司 Lonza 生產以供內需，徵召碩博士生去做疫苗，月薪七千瑞士法郎，為期三到六個月。
3.
有人問：聯亞有二期三期合併，高端感覺還要很久，為什麼現在都在討論高端，沒有在討論聯亞？
答：因為高端有股票上市吧哈哈 XD
4.
台灣的二期要多少人？當初有人在討論要一千人還是三千人，講一千人想的是還是要三期，擴大到三千人想的是二期過了就直接 EUA。三千人的來源是 FDA 的 safety guideline，TFDA 先設了這個 criteria 後高端和聯亞才把臨床設計做成第二期三千人。
5.
高端計畫在巴拉圭做 1:7 的三期臨床試驗。台灣的二期沒有真的雙盲，三期才有雙盲。二期預計六月解盲，但沒什麼好解盲的，一定是成功的，有抗體就是打疫苗，沒抗體就是打食鹽水，二期只看一點點 efficacy 沒那麼重要，三期看 efficacy 比較重要。
6.
台灣和後來才出來的新冠疫苗會越來越沒有做傳統三期的條件，因此 WHO 前兩天才開會討論 Nature Medicine 那篇 paper [1]，看能不能做 immunobridging，用中和抗體效價取代傳統三期。
7.
台灣好像有兩家公司做 mRNA，但是技術不夠。
8.
mRNA & adenoviral vaccine CQA (critical quality attribute) 應該沒有 biological potency assays，mRNA 所知的 guideline 是看 purity, identity, in vitro expression (WB)。Adenovirus 的話可能是 strain identity, TCID50 assay, qPCR，但是病毒的 batch-to-batch variability 很高，包括用於 gene therapy 的 AAV，不知道各廠是如何確定每個 batch 的品質是一致的。
9.
關於 Nature Medicine 那篇有些 limitations，例如每個疫苗檢測的方法都不一樣、不知道康復者的抗體是感染幾天後的，要怎麼知道康復者體內的哪幾株中和抗體(neutralizaing antibodies)是有保護力的等等。
註：那篇裡面分析的疫苗有 Moderna (mRNA-1273), Novavax (NVX-CoV2373), BioNtech/Pfizer (BNT162b2), Sputnik V (rAd26-S+rAd5-S), Oxfored/AZ (ChAdOx1 nCoV-19), J&J Janssen (Ad26.COV2.S) 和中國的科興疫苗 CoronaVac (inactivated)，中和抗體的分析結果和 Phase III 的差不多，兩支 mRNA 的表現最好，中和抗體也最多，科興的最差，中和抗體也最少。
相關文章：又一篇新冠病毒的小抗體研究
如果真的要做 immunobridging，要用哪些抗體當作 markers 或 reference，每隻疫苗產生的抗體都不太一樣，要怎麼確定有產生那幾株抗體就表示有保護力？如果某個疫苗沒產生那些抗體，就代表沒保護力嗎？之前有研究顯示，不只抗體有保護力，感染後產生的 T cells 也有保護力，這些要包括在內嗎？
相關文章：新冠病毒感染者體內 T 細胞的免疫反應
Moderna 在青少年的臨床試驗上，便是看免疫反應 [2, 3]，但那是因為是同一隻抗體，檢測的方法也是一致的。
10.
Regeneron mAb cocktail 只有兩株抗體 [4]，是從老鼠體內釣出來後再 humanized。
References:
1. DS Khoury et al, Neutralizing antibody levels are highly predictive of immune protection from symptomatic SARS-CoV-2 infection. Nature Medicine (2021)
2. Moderna Press Release / Moderna Announces TeenCOVE Study of its COVID-19 Vaccine in Adolescents Meets Primary Endpoint and Plans to Submit Data to Regulators in Early June (May 2021)
3. UMass Med News / Moderna’s TeenCOVE study of COVID-19 vaccine, with UMMS participants, meets primary endpoints (May 2021)
4. FDA / Coronavirus (COVID-19) Update: FDA Authorizes Monoclonal Antibodies for Treatment of COVID-19 (Nov 2020)
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