微整形美容新科技 - mRNA 抗老除皺

mRNA 除了用來當疫苗，還可以用來微整形。現在的除皺微整形有肉毒桿菌、電波拉皮和玻尿酸等等，可能過不久後就會出現 mRNA 除皺。XD

目前的 mRNA 疫苗是用脂質奈米微粒(lipid nanoparticles)運送 mRNA 進入細胞，但是這會引起免疫反應。德州大學阿德森癌症中心(University of Texas MD Anderson Cancer Center)的研究團隊研發了一種產生胞外體(extracellular vesicles, EV)的技術，可以用來運送 mRNA。

什麼是胞外體（外泌體）？

胞外體是由細胞分泌出來的囊泡，是人體細胞本來就會自然產生的東西，胞外體包括外泌體(exosomes)和 microvesicles，是細胞用來運送大分子物質，例如核酸(nucleic acids)和蛋白質等等。由於是自然產生，所以不像現在 mRNA 疫苗用的 NLP (nanoparticle) 會引發不必要的免疫反應，可以打入體內多次，並且可以以用來運送很大的人類基因和蛋白。

現在可以用簡單便宜的方式讓細胞產生大量的 EV，而且夠大的足以打包大的基因或蛋白質。研究團隊研發的一種細胞奈米穿透 cellular nanoporation (CNP) 技術可以在細胞膜上打奈米級的小洞，然後把 mRNA 送進細胞內，使細胞可以把 mRNA 包進將被分泌出的胞外體中。

結合胞外體和 mRNA 技術恢復你的膠原蛋白

導致老化的其中一個原因是陽光照射，紫外線破壞了皮膚裡的膠原蛋白，而老化的細胞也會停止生產膠原蛋白，使皮膚產生皺紋。研究團隊想知道是否可以利用 mRNA 技術使細胞製造膠原蛋白，改善老化的現象。

研究團隊用紫外線照射無毛老鼠六十天，使牠的皮膚老化產生皺紋，然後用胞外體做為送膠原蛋白(COL1A1) mRNA 的載體，打入老鼠的皮下細胞裡。控制鼠則是用常用的 A 酸(0.05% retinoic acid)治療，另有部分老鼠則是沒接受除皺治療或是沒接受紫外線照射，然後用顯微鏡觀察老鼠的皺紋數量。

經過 28 天共五次(Day 0, 4, 7, 14, 21)低劑量的治療後，老化鼠的皺紋在治療第七天後開始減少，在第 14 天開始平均皺紋數和沒經過紫外線照射的一樣，比用 A 酸治療的老鼠皺紋數少了一半。不過除皺的效果在四週後就漸漸消退，然後在 56 天後皺紋數量就和治療前一樣了。由於效果只維持四週，研究團隊想要讓效果維持久一點，他們用了微針貼片以均勻地注射 EV 進老鼠的深層真皮層，打一次一劑十五分鐘可改善膠原蛋白的生產，結果效果延長了一倍，可以維持近兩個月。

跟 NLP 相比，EV 不會引起免疫反應，老鼠施打後也沒有產生紅腫的反應。不過，目前的技術還無法使胞外體針對特定的組織細胞，大量生產胞外體也是個挑戰。



Articles:

MD Anderson Cancer Center | Scientists develop novel mRNA delivery method using extracellular vesicles

New Scientist | Anti-wrinkle patch uses microneedle injections to restore skin

GEN News | mRNA Loaded Natural Delivery Vehicle Reduces Wrinkles in Aging Skin



Paper:

You et al, Intradermally delivered mRNA-encapsulating extracellular vesicles for collagen-replacement therapy. Nature Biomedical Engineering (2023)

CRISPR-Cas9 基因治療（下）-- 遺傳性澱粉樣蛋白疾病 hATTR

CRISPR-Cas9 大家應該都不陌生吧，此技術的發明者 Dr. Doudna 和 Dr. Charpentier 因此技術得了2020 年的諾貝爾化學獎。Dr. Doudna 和 Dr. Charpentier 在 2012 年的時候先於 Science 發表了用 CRISPR-Cas9 基因編輯的成果，之後在 2013 年要把這個技術申請專利的時候，所屬的 Berkeley 大學和 MIT 的 Dr. Zhang 開始了專利之戰。接著，2014 年時 Dr. Doudna 成立了 Intellia Therapeutics，而 Dr. Charpentier 也已於 2013 年在瑞士成立了生技公司 CRISPR Therapeutics。

相關文章：CRISPR-Cas9 的專利大戰和爭議

CRISPR-Cas9 用於治療上，CRISPR Therapeutics 似乎搶先了一步，它和 Vertex Pharmaceuticals 合作研發了用於治療血液疾病的 CTX001，並於 2018 年開始了臨床試驗，2019 年五月時宣佈了用於治療鐮刀型紅血球疾病(sickle cell disease, SCD)的乙型地中海貧血(transfusion-dependent β thalassemia, TBT)的第一、二期臨床試驗結果，那時最先是兩個臨床試驗各一位患者，兩位患者的臨床試驗結果也於今年一月發表在 NEJM [1]。

CTX001 治療是把造血幹細胞(hematopoietic stem cells, HSP)抽出來，利用 CRISPR-Cas9 調控血紅蛋白，再把修正過後的紅血球輸回病患體內。TBT 患者在治療前每年需要接受多次輸血，而在接受治療九個月後便不再需要輸血。SCD 患者在治療前每年會發生多次 vaso-occlusive crises (VOCs)，在治療後便不再出現 VOCs。兩位病患在治療後觀察一年的期間內，HbF 都持續穩定的增加，雖然治療中都出現不適的情況，不過診斷過後排除是治療造成的 [1]。CTX001 已於 2019 四月拿到 FDA Fast Track Designation，Vertex 計劃在未來兩年內送 FDA，並於今年四月宣布給 CRISPR Therapeutics $900M 在研發、量產和上市上 [2]。

相關文章：CRISPR-Cas9 基因治療（上）-- 遺傳性血液疾病



相較於 CRISPR Therapeutics，Dr. Doudna 的 Intellia Therapeutics 今年六月才在 NEJM 上發表了其 NTLA-2001 的第一期臨床試驗結果 [3]。NTLA-2001 是用來治療 hereditary transthyretin amyloidosis (hATTR)。ATTR 有兩種，一種是隨著年齡增長得病機率越大的 wild-type (senile) ATTR，另一種是罕見且會致命的遺傳性 ATTR (hATTR)。TTR (transthyretin, 轉甲狀腺素蛋白)是個只有 14 kDa 的小蛋白，主要功能是運送甲狀腺素(thyroxine)和視黃醇(retinol)，在肝臟中和成後，通常以 tetramer (55 kDa) 的型態遊走在腦脊液(cerebrospinal fluid, CSF)和血液中。

Wild-type ATTR 是因為正常的 TTR 隨著年齡增長而變得不穩定，使得蛋白容易出現摺疊錯誤(misfold)的情況。摺疊錯誤的 TTR 無法組合成 tetramer，而是以 monomer 或 dimer 的型態存在，並且當這些 misfold monomer 碰在一起時，會變成 aggregates，跟造成阿茲海默症的 β-amyloid aggregates 一樣會堆積在組織細胞或神經細胞中，導致細胞死亡，稱為 amyloidogenesis [4]。hATTR 則是因為 TTR 基因突變而造成的，突變的 TTR 比正常的 TTR 更不穩定，更容易摺疊錯誤和堆積。

ATTR 主要發生在心臟和神經系統，目前用來治療 ATTR 的基因療法有兩個，皆已於 2018 年拿到美國 FDA 許可：Alnylam (Nasdaq: ALNY) 的 Onpattro (patisiran) [5] 和 Ionis Pharmaceuticals, Inc. (NASDAQ: IONS) 的 TEGSEDI (inotersen) [6]。Onpattro 用的是 small interfering RNA (siRNA, aka RNA interference, RNAi)，是第一個得到 FDA 許可的 RNA 療法，是利用 NLP (lipid nanoparticles) 把 siRNA 直接送進肝臟裡，使 TTR 的 mRNA 不能被轉譯成蛋白質，TTR 表現可以降低 80% [5-8]。TEGSEDI 則是 antisense oligonucleotides (ASO)，一樣是針對 TTR mRNA，使正常和突變的 TTR mRNA 被降解，無法轉譯成蛋白，同樣可以降低 TTR 表現 80% [6]。

Intellia Therapeutics 和 Regeneron Pharmaceuticals 合作研發的 NTLA-2001 也是利用 NLP 把 CRISPR-Cas9 送進體內，使 CRISPR-Cas9 進入肝臟細胞後可以造成 indels (insertions or deletions) 阻斷 TTR 基因，降低 TTR 的表現和血液裡的 TTR 含量。Intellia 於於去年十月底宣布他們將在英國和紐西蘭開始第一期臨床試驗，參與人數為 38 人，主要是檢測其安全性和有效性 [7]。

今年六月底，Intellia 在 Peripheral Nerve Society (PNS) Annual Meeting 發表了第一期臨床試驗的期中報告，同時也發表在 NEJM，論文裡的參與人數為六位患者，分為兩組不同劑量：0.1 mg/kg 和 0.3 mg/kg。ATTR 患者以靜脈注射的方式接受了一劑 NTLA-2001，然後在 28 天後測量其血清中 TTR 含量。結果顯示接受低劑量(0.1 mg/kg)的患者，其血清的 TTR 減少了 52%，而高劑量組(0.3 mg/kg)的血清 TRR 則減少了 87% [8-11]，比 Onpattro 和 Tegsedi 的 80% 還要好一些，不過 NTLA-2001 的優勢在於它只需一劑，Onpattro 則需每三週施打一次，Tegsedi 也要每週一次 [6, 8]。副作用方面，只有三個人出現輕微副作用，沒有觀察到嚴重副作用。臨床結果發表當週也是他們的 IPO，以每股 $145 的價格上市 [12]。



CTX001 和 NTLA-2001 不同的地方在於 CTX001 是把目標細胞抽出來基因編輯，NTLA-2001 則是需要把 CRISPR-Cas9 送進體內，因此如何讓它到準確地達目標器官或細胞是需要克服的瓶頸。雖說 Intellia 第一期臨床試驗目前看來頗為成功，但因為目標器官是肝臟，大多經由靜脈施打的 liposomes 都會先被肝臟吸收。Dr. Doudna 日前在 CNBC 訪問時表示，CRISPR 基因治療能有局限，要如何把 CRISPR-Cas9 送進目標器官裡仍是個需要解決的難題 [13]，不過要是能克服這個瓶頸，未來便可應用在更多疾病治療上。


Clinical trial: NCT04601051


[2022-09-29 update]

Intellia 研發的、用來治療遺傳性澱粉樣蛋白疾病(hereditary transthyretin amyloidosis, hATTR)的 CRISPR 基因療法 NTLA-2001 的最新報告顯示，只需一劑就夠了。在靜脈施打一劑 NTLA-2001(0.7-mg/kg) 的 28 天後，TTR 降了 93%。

而他們的另一個藥物 NTLA-2002 正在第 1/2 期臨床試驗中，是用來治療罕見疾病 hereditary angioedema (HAE, 遺傳性血管性水腫)，病徵是血液中的 bradykinin (緩激肽, 血管擴張劑)上升，血管外部的體液堆積擠壓到血管，造成血液流通或淋巴液流通不順暢，導致手腳和臉部等部位水腫。HAE 是一種顯性的遺傳疾病，因此只要父母其中之一有這個突變的基因，小孩就有 50% 的機會得到。HAE 是由於 C1 inhibitor (C1-INH) 不足所引起的，C1 inhibitor 是一種 serine protease inhibitor，由基因 SERPING1 表現，SERPING1 的突變會導致 C1 inhibitor 無法表現或是功能缺失。後來研究發現，除了 SERPING1 外，factor XII (F12), plasminogen (PLG) and angiopoietin 1 (ANGPT 1) 的突變也會造成 HAE，95% 的 HAE 是由 SERPING1 突變造成的。C1 inhibitor 主要是抑制 F12 和 kallikrein，因此 C1-INH 不足或功能不正常會導致 F12 和 kallikrein 無法被調控，進而造成 bradykinin 上升。NTLA-2002 即是針對 kallikrein，最新的臨床節果顯示 75 mg 的劑量可以在施打八週後降低血液中 92% 的 kallikrein。



References:

1. H Frangoul et al, CRISPR-Cas9 Gene Editing for Sickle Cell Disease and β-Thalassemia. NEJM (2020)

2. Vertex / Vertex Pharmaceuticals and CRISPR Therapeutics Amend Collaboration for Development, Manufacturing and Commercialization of CTX001™ in Sickle Cell Disease and Beta Thalassemia (April 2021)

3. JD Gillmore et al, CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis. NEJM (2021)

4. GY Park et al, Diagnostic and Treatment Approaches Involving Transthyretin in Amyloidogenic Diseases. Int J Mol Sci (2019)

5. US FDA / FDA approves first-of-its kind targeted RNA-based therapy to treat a rare disease (Aug 2018)

6. Ionis / Akcea and Ionis Receive FDA Approval of TEGSEDI™ (inotersen) for the Treatment of the Polyneuropathy of Hereditary Transthyretin-Mediated Amyloidosis in Adults

7. Gene Online / Intellia Trials CRISPR Drug as Permanent Cure to Fatal Hereditary Disease (Oct 2020)

8. MedCity News / Intellia’s early CRISPR trial data validate a drug pipeline and the gene-editing field (June 2021)

9. CRISPR News / Clinical Trial Update: Positive Data for First Ever In Vivo CRISPR Medicine (June 2021)

10. Clinical Trials Arena / Intellia and Regeneron report positive data of CRISPR therapy for ATTR (June 2021)

11. Intellia and Regeneron Announce Landmark Clinical Data Showing Deep Reduction in Disease-Causing Protein After Single Infusion of NTLA-2001, an Investigational CRISPR Therapy for Transthyretin (ATTR) Amyloidosis (June 2021)

12. BioSpace / Intellia Tops Busy Period with $600 Million IPO

13. CNBC / How CRISPR gene editing will treat diseases in future: Nobel-winning Intellia co-founder Jennifer Doudna

14. Intellia / Intellia Therapeutics Announces Positive Interim Clinical Data for its Second Systemically Delivered Investigational CRISPR Candidate, NTLA-2002 for the Treatment of Hereditary Angioedema (HAE) (Sept 2022)

15. FIERCE Biotech / Intellia's gene editing therapies both post early successes as evidence grows for CRISPR potential

16. Biopharma Dive / Intellia offers first look at CRISPR drug for rare swelling disorder

mRNA 疫苗的崛起

關於 mRNA 用在疫苗和治療上的研究，並非前年疫情後才開始的。

1. 第一次成功使用 mRNA 在動物裡表現是在 1990 年時，分別用 DNA 和 RNA expression vectors 在老鼠體內表現蛋白，表現效果和 in vitro 在培養細胞裡的表現差不多。

JA Wolff et al, Science (1990); PMID: 1690918 DOI: 10.1126/science.1690918

2. 但是相較於 DNA 或蛋白治療，初期投入在 mRNA 治療上的研究甚少，主要原因有三：不穩定性(instability)，容易降解、易引起免疫反應(high innate immunogenicity)，因為細胞表面和細胞內有很多 mRNA sensor，和不易於送入體內和表達(in efficient in vivo delivery)。

3. 然而，隨著這幾十年科技的進步，用 mRNA 治療不再遙不可及，用在疫苗上的好處有：
a) 安全性 - 非感染因子，也不會插入染色體造成突變，可以被細胞代謝，也因此可以反覆施打。
b) 透過改造 nucleotides，可以增加它的穩定性和表現效果，也可以調整引起的免疫反應。
c) 可以改造 carrier molecules，使它更容易被送入細胞。
d) 可以快速大量生產

4. mRNA 結構本身的改善可以從 5' Cap, UTR, CDS (coding sequence), 3' PolyA tail 和 purity 上下手，例如純淨度高可降低 innate immune responses 和增高蛋白表現，5' 和 3' UTR 也會影響蛋白表現。另外，調整 GC content 和 nucleotide modification 都可以改善蛋白表現和免疫反應。

5. 運送的種類有 liposome, polymer, polysaccharide particle, lipid nanoparticle (LNP), lipid/cholesterol nanoparticle, lipid/cholesterol/PEG nanoparticle 等等。

6. mRNA 在傳染性疾病和癌症治療上的 IP (intellectual property) 競爭在過去五年相當激烈，其中包括了 nucleotide modification 和 delivery methods。專利申請上有 70% 來自業界，除了目前廣為人知的 Moderna 和 BioNtech 外，還有 GSK, Bayer 和久光製藥(Hisamitsu Pharmaceutical)，其中 Moderna, CureVac, BioNtech 和 GSK 四家公司就佔了快一半的 mRNA 專利。

7. 在疫情前，已在研發中的 mRNA 疫苗包括肺癌、胰臟癌、流感、狂犬病、伊波拉和 HIV 等等。

8. mRNA 上的投資，在 2015 年到 2020 年間成長了 94.2%。三家代表公司為 Moderna, BioNtech, CureVac，自 2015 年來吸引了 USD $2.8B 的投資，Moderna 在 2018 年時的 IPO 約為 $7.6B。自 2017 年開始，RNA 相關的投資也大量增加，例如投在 Arrakis, Expansion, Shyhawk 和 Ribometrix 的就有 USD $262M。

9. FDA 許可的 RNA therapy 目前有治療 DMD 的 Eteplirsen (2016), 治療 SMA 的 Nusinersen (2016) 和治療 FCS 的 Volanesoren (2019) 等等。



References:

N Pardi et al, mRNA vaccines — a new era in vaccinology. Nature Reviews Drug Discovery (2018)

F Wang, RNA therapeutics on the rise. Nature Reviews Drug Discovery (2020)

C Martin & D Lowery, mRNA vaccines: intellectual property landscape. Nature Reviews Drug Discovery (2020)

NAC Jackson et al, The promise of mRNA vaccines: a biotech and industrial perspective. Nature Vaccines (2020)