Ketamine 抗憂鬱的可能機制

抗憂鬱藥(antidepressant)一直以來有個缺點，就是藥效作用很慢，至少要一個禮拜以上才會產生效果，而且有約 30% 的患者對常用的抗憂鬱藥，也就是 SSRIs (selective serotonin reuptake inhibitors) 沒反應，因此近期對於 SSRIs 到底有沒有用起了很多問號和不少爭議。

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相較於 SSRIs，ketamine (K他命)的作用很快，因此近年來有不少研究是關於怎麼用 ketamine 來治療重度憂鬱症(major depression disorder, MDD)。

Ketamine 在 1960 年代便已出現，最初是當鎮定劑使用，現在則是用來麻醉動物。由於 SSRIs 作用很慢而且需要持續施藥，病人需要幾週至上月才會對 SSRIs 產生反應，但重度憂鬱症的人可能等不到藥物反應就自殺了。相對的，Ketamine 的作用則很快，只要幾個小時就能改善心情，而且一劑藥就可以維持一週，不過它的副作用就是會上癮和產生 dissociative effect (感覺和周遭環境和自身脫離)，所以目前很多用 ketamine 做研究，希望能找出它的作用機制，然後研發出和它作用相同但沒有副作用的藥物，只是到目前都還無法確定 ketamine 是如何作用的。

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目前認為 ketamine 的機制是抑制神經傳導物質接受器 NMDAR (antagonist)，之前有篇研究引起很大的關注，那篇研究發現 ketamine 的抗憂鬱效果不在於它本身，而是它的其中一個代謝物 -- (2S,6S;2R,6R)-HNK，而這個代謝物是作用在另一個神經傳導接受器 AMPAR 上面[註]，最重要的是它沒有上癮的副作用。之前有研究顯示，在老鼠實驗中，(2R,6R)-HNK 的抗憂鬱作用需要激活 mTORC1 kinase，而 mTORC1 signalling pathway 控制著許多神經細胞內的活動，例如脂肪生成、葡萄糖代謝、mRNA 轉譯和蛋白質生成。

註：NMDAR 和 AMPAR 皆是神經元細胞(neurons)上的受體，和海馬迴的記憶功能有關。


Figure / mTORC1 signalling pathway. (A) When mTORC1 is inactive, 4E-BP binds to eIF4E and subsequently inhibits mRNA translation. (B) When mTORC1 is active, it phosphorylates 4E-BP. Phosphorylated 4E-BP dissociates from eIF4E and allows formation of eIF4F complex, which subsequently recruits ribosomes for mRNA translation and protein synthesis.

這期的 Nature 有篇研究是關於 ketamine 作用的機制，加拿大的研究團隊發現 eIFs (eukaryotic initiation factors) 中的 4E-BPs (4E-binding proteins) 在其中扮演了重要的角色，主要是影響 mTORC1 控制的蛋白質生成。哺乳類動物有三個 4E-BPs 基因，在老鼠腦部，4E-BP1 和 4E-BP2 表現在其 PFC (prefrontal cortex) 和海馬迴(hippocampus, HPC)，海馬迴的神經元細胞只表現 4E-BP2，而在 PFC，4E-BP1 和 4E-BP2 接表現在 excitatory (CAMK2α+) 和 inhibitory (GAD67+, GABAergic) neurons。

當老鼠神經元細胞裡的 4E-BPs 基因被拿掉後，ketamine 無法在腦部細胞發揮抗憂鬱效用，因為 ketamine 的抗憂鬱作用在 excitatory neurons 裡是透過 4E-BP2，在 inhibitory neurons 裡是透過 4E-BP1 和 4E-BP2。憂鬱症的老鼠實驗是把老鼠放進沒有落腳處的水裡逼迫牠們游泳(forced swim test, FST)，然後觀察他們的求生意志，有憂鬱症狀況的老鼠會較快放棄游泳求生，呈現不動的狀態(immobility)。

Forced Swim Test (FST): "The forced swim test is a rodent behavioral test used for evaluation of antidepressant drugs, antidepressant efficacy of new compounds, and experimental manipulations that are aimed at rendering or preventing depressive-like states. Mice are placed in an inescapable transparent tank that is filled with water and their escape related mobility behavior is measured." (A Can et al, J Vis Exp 2012)


Figure / Mouse forced swim test (Danish 3R-Center)

正常的老鼠，在打了 ketamine 後放進水裡一個小時後，不動的比例是 67.9%。他們也試了 (2R,6R)-HNK，效果和 ketamine 差不多，不動的比例是 61.1%。另外，ketamine 的效力可以維持多天，老鼠在打了高劑量的 ketamine 六天後，在游泳實驗裡，仍可以降低 80.6% 的不動比例。失去 4E-BP1 或 4E-BP2 基因的老鼠，在游泳實驗裡，即便打了高劑量的 ketamine 或 (2R,6R)-HNK，不動的比例也沒有降低，跟只打生理食鹽水的比例一樣，而其海馬迴裡可被 ketamine 激發的 excitatory neuromission 也被抑制。

他們也做 cell-specific deletion，也就是只有特定的神經細胞裡的 4E-BPs 基因被刪除，他們試驗了兩種細胞：excitatory neurons 和 inhibitory neurons。當 excitatory neurons 的 4E-BPs 基因被刪除後，ketamine 和其代謝物 (2R,6R)-HNK 便失去了抗憂鬱的效用，顯示在 ketamine 的作用中4E-BPs 是必要的。有趣的是當 inhibitory neurons 裡的 4E-BP2 基因被刪除的話，也會降低游泳實驗時老鼠不動的比例。他們也發現，當老鼠的 inhibitory neurons 缺少 4E-BP2 的時候，他們的 GABAergic synaptic transmission 增加了。而事實上 GABAergic neurons 也被認為和憂鬱症有關，神經傳導物質 GABA (gamma aminobutyric scid)有鎮定的效用。

【 題外話 】之前 UBC 的實驗室就有位博士生是研究用 ketamine 治療 MDD，用的老鼠株是 Wister Kyoto (WKY)，每次他把 Kyoto 唸成 ki-o-to 的時候都很想糾正他是 kyo-to，不是 ki-o-to。XD



Articles:

TN / How Does Ketamine Combat Depression?


Paper:

A Aguilar-Valles et al, Antidepressant actions of ketamine engage cell-specific translation via eIF4E. Nature (2020)

萬用流感疫苗的第一期臨床試驗

目前大家大概都知道的，流感疫苗每年都要施打，因為流感病毒突變的很快，每年都需要預測明年可能的突變，然後製作疫苗，但因為是預測，所以疫苗的效力不穩定，預測準的話就效力比較高，不準就效力較低。

流感病毒的表面有兩個醣蛋白(glycoprotein)：hemagglutinins (HA) 和 neuraminidase (NA)。流感病毒株的 H, N -- 例如西班牙流感 H1N1，便是指這兩個蛋白。流感病毒依其 H, N 分成三種：Influenza A, B, C。其中 Influenza A 又分為兩組：group 1 包括有 H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11-13, H16，group 2 裡有 H3, H4, H7, H10, H14 和 H15。HA 蛋白是流感進入細胞的媒介，和細胞表面的 sialic acid 結合後得以進入細胞，因此目前的疫苗主要是針對 HA 做預測，目的是希望人體能夠產生對抗 HA 的抗體。


Figure / Influenza virus infection (US CDC)

HA 蛋白分為兩個部分，上面的 head domain 是基因突變較頻繁的部分，頂端是 receptor binding site，也就是 antigenic site，和細胞表面 sialic acid 結合的部位，是目前疫苗針對的標靶，但因為變化頻繁，針對 HA head 的疫苗便有 specificity，疫苗需要混合很多不同病毒株涵蓋率才會高。HA 下面的部分是 stalk domain，相較起來突變較不頻繁。也就是說，如果疫苗是針對下面的 stalk domain 的話，就可以一次針對多個病毒株，也許就不用每年都更新疫苗了。

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Figure / Influenza HA structure (KVR et al, JCI 2018)

不過，如果要針對 stalk domain 製作疫苗，有幾點需要考慮：

1. 因為它不是 antigenic site，不確定針對此部位的抗體是否能抑制流感病毒進入細胞？
2. 大多數人體內因為長期接受流感病毒或疫苗，體內已有針對 HA head domain 的免疫反應，所以就算打了針對 stalk domain 的疫苗，體內針對 head domain 的免疫反應會迅速作用，可能會因此讓針對 stalk domain 的疫苗無法發揮作用。
3. 那如果疫苗只有 stalk domain 而不包含 head domain 的話呢？目前為此，一些研究團隊實驗的結果是 head domain 本身很不穩定。

Mount Sinai 醫學院的 Krammer 和其同事想到的辦法是做成 HA chimeras (cHAs)，就是把 H1 strain 的 stalk domain 和禽流感 H5 及 H8 的 head domain 連在一起，變成一個人體沒接觸過、新的抗原，這樣就不會引起原本針對 HA head domain 的免疫反應，使人體可以產生對抗 stalk domain 的免疫反應。

他們之前的老鼠實驗顯示，當多次把不同的 cHAs (不同的 head，但都是 H1 的 stalk)打入老鼠體內，可以老鼠產生抗 stalk 的抗體。之後他們用 H1N1 去感染被施打 cHA 疫苗的老鼠，這些老鼠的存活率和體重都比控制組(只打 BSA)的老鼠好。cHA 疫苗用的是 H1 stalk，可以保護老鼠於 H1N1 在預期之內，重要的是產生的 anti-stalk 抗體是否能夠對抗其他流感病毒株的感染。於是，他們用 H5N1 和 H6N1 去感染之打了 cHA 疫苗的老鼠，同樣顯示老鼠體內的 anti-stalk 抗體具有 cross-reactivity，對老鼠有保護作用。不過，當他們用 group 2 的 H3N2 去試驗，卻沒有明顯的保護作用，顯示帶有 H1 stalk 的 cHA 產生的抗體侷限在同樣是 group 1 的流感病毒株。

chimeric HA (cHA) 疫苗的臨床試驗目前還在第一期臨床安全測試，試驗分為兩組，接受疫苗的為 66 位十八到 39 歲的健康個體，其中有十五人接受的是 placebo。在比較兩組在施打疫苗後的抗體後。結果顯示接受 HA chimeras 的那組產生了大量的 anti-stalk 抗體。他們用 ELISA 測試產生的抗體 cross-reactivity，結果顯示抗體對 group 1 裡的 H2, H8, H9 和 H18 皆有反應，但是對 group 2 裡的 H3 沒反應，跟之前老鼠實驗的結果一致。之後，研究人員把這些人的血清打到老鼠體內，再給老鼠感染流感病毒，觀察牠們的免疫反應，結果顯示接受施打疫苗後的血清對老鼠有保護作用，但抑制病毒的效果沒預期的好。

總之，這個疫苗在第一階段的臨床安全試驗裡顯示可以使免疫系統產生大量抗體，並且可以辨識主要幾個 group 1 裡的病毒株，不過效果如何還需之後二三期的臨床試驗才知道。


Articles:

US CDC / Understanding Influenza (Flu) Infection: An Influenza Virus Binds to a Respiratory Tract Cell

Science / Innovative universal flu vaccine shows promise in first clinical test (Dec 2020)


Papers:
R Nachbagauer et al, A chimeric hemagglutinin-based universal influenza virus vaccine approach induces broad and long-lasting immunity in a randomized, placebo-controlled phase I trial. Nature Medicine (2020)

KV Reeth, The post-2009 influenza pandemic era: time to revisit antibody immunodominance. JCI (2018)

R Nachbagauer et al, A chimeric haemagglutinin-based influenza split virion vaccine adjuvanted with AS03 induces protective stalk-reactive antibodies in mice. Nature Vaccines (2016)

F Krammer et al, Chimeric Hemagglutinin Influenza Virus Vaccine Constructs Elicit Broadly Protective Stalk-Specific Antibodies. JVI (2013)

用基改益生菌治療 C. difficle 感染

之前有介紹過，量產抗體有幾個選項，可以用動物細胞，可以用大腸桿菌，也可以用酵母，另外還有一種是雞蛋(IgY)。

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這篇研究用的是酵母菌，把基改後可以生產抗體的酵母菌吃下去，讓它在體內製造抗體來對抗 Clostridioides difficile (困難梭狀桿菌)感染。困難梭狀桿菌感染(Clostridioides difficile infection, CDI)通常發生在老年人，尤其是有在服用治療其他感染的抗生素的，抗生素會殺掉很多細菌，包括好的腸道菌，使它們無法對抗 C. difficile，雖然針對 C. difficile 的抗生素大多有效，但有時候會反覆感染，最後造成死亡。

 

Figure / Clostridioides difficile Infection (US CDC)

除了用抗生素治療，另一種就抗體治療，普通的做法是大量生產、純化抗體後，然後靜脈注射至血管內，經由血液進到腸胃道，中和困難梭狀桿菌產生的毒素。這篇研究的團隊，想說與其要經過層層運輸，不如基改益生菌，讓它可以生產抗體，吃下去後直接進入腸胃道，不是更方便？而且如果可以讓益生菌(probiotics)在體內生產抗體，還省掉了純化抗體需要的時間和金錢。

目前用來生產抗體的酵母菌以 Saccharomyces 和 Pichia 為主，Saccharomyces 是 baker's yeast，Pichia 則是 brewer's yeast，比較常用來大量生產蛋白。S. cerevisiae 可能大家比較常用，通常做 yeast 2-hybrid 就是用這株，這篇研究用的是 Saccharomyce boulardii。關於 S. boulardii 的研究不多，不過它和 S. cerevisiae 是同種，照理說基改後應該也可以生產抗體，中和困難梭狀桿菌的毒素 TcdA, TcdB。

這篇研究用來中和 TcdA, TcdB 的是小抗體 VHH，他們把四個可以中和 TcdA, TcdB 的 VHH 接在一起，之間用 GSSS linker 接在一起成為 ABAB，然後測試它們的中和效力，並且和 Merck 的抗體藥 actoxumab & bezlotoxumab 相比，老鼠實驗(腹腔注射)的結果顯示，效果比 Merck 的抗體藥好一千倍，接下來要解決的就是怎麼把 VHH 用非注射的方式送到腸胃道。研究團隊選擇用益生菌，在益生菌中選擇用 S. boulardii，原因有幾個：安全性已知道，也有治療 CDI 的基本效用，並可和抗生素一起使用。雖然沒有用 S. boulardii 表現抗體的研究，但同種的 S. cerevisiae 已被廣泛用來表現抗體。他們先試著在 S. cerevisiae 裡表現 ABAB，看用哪個 secretion signal 表現最好，然後在放到 S. boulardii，經過一些 optimization 之後，表現量可以增加四倍，然後測試 S. boulardii 生產的 ABAB 是否仍具有中和效用，細胞實驗的結果顯示是可以的，再來就是測試安全性了。

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他們讓接受抗生素的老鼠每天吃一劑的 S. boulardii (10^9 CFU)，看看是否有副作用，結果顯示老鼠除了變胖之外，沒有明顯的副作用。除此之外，老鼠的糞便中還可測到持續表現 ABAB 的益生菌，重要的是從腸胃道取出的 gut fluid 仍保有抑制 TcdB-induced toxicity 的效用，沒有被餵食基改益生菌的老鼠糞便則沒有抑制 toxicity 的效用。

通常在治療細菌感染或是術前準備時，會給病患吃抗生素，但服用抗生素會增加 CDI 的感染風險，那表現 ABAB 的益生菌可以解決這個困擾嗎？在預防性治療實驗中，他們讓接受抗生素的老鼠先吃七天表現 ABAB 的基改益生菌，或是沒表現 ABAB 的益生菌，然後再讓他們感染 C. difficle，結果發現沒吃益生菌或是吃沒表現 ABAB 益生菌的老鼠出現CDI 感染症狀，糞便裡有 C. difficle 和其毒素，而吃表現 ABAB 益生菌的老鼠則症狀輕微或是無症狀，糞便裡的 C. difficle 也相對少。用在急性感染治療上的效果如何呢？老鼠在感染後八到十二個小時內出現症狀，有的在 48 小時內死亡，存活率大概五成，而被餵食表現 ABAB 基改益生菌的老鼠存活率有八成，而且復原力也較高。

在臨床上，病患在停止抗生素治療後，有時會出現反覆感染的狀況。在預防反覆感染的實驗中，老鼠在接受感染的一天後開始每天吃基改益生菌，連吃十三天。沒接受表現 ABAB 益生菌或沒表現 ABAB 益生菌的老鼠在停止 vancomycin 後出現再度感染的情況，像是腹瀉、體重減輕或死亡，而服用表現 ABAB 益生菌的老鼠再度感染的狀況顯著降低，只有輕微腹瀉，也沒有體重降低的狀況。

好好奇糞便裡的基改益生菌是否仍有抑制 toxicity 的效用。哦，對了，反基改人士會不會說他們寧願吃抗生素，也不要吃基改益生菌呢？XD



Articles:

US CDC: Nearly half a million Americans suffered from Clostridium difficile infections in a single year

Science / Antibody-producing yeast vanquishes deadly gut infection in mice (Oct 2020)


Paper:

K Chen et al, A probiotic yeast-based immunotherapy against Clostridioides difficile infection. Science Translational Medicine (2020)

未感染新冠病毒的人也有抗體

之前已有好幾篇研究顯示，未感染者體內有抗新冠病毒的免疫 T cells，有可能是因為和其他的冠狀病毒有 cross-reactivity。這篇研究用 flow cytometry 分析了未感染者和患者抗冠狀病毒 Spike protein 的三種抗體 IgA, IgM 和 IgG，想知道新冠病毒和感冒冠狀病毒之間 cross-reactivity 程度有多少。

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冠狀病毒的 Spike protein 分成 S1 和 S2 兩個 domains，S2 在冠狀病毒間的相似度比較高，叫有可能是 cross-reactivity 的來源。他們的 competitive binding assays 結果顯示，未感染者和患者的血清抗體間的 cross-reactivity 主要在於 S2。跟未感染者的抗體相較，患者血清內的抗體免感度(sensitivity)和專一性(specificity)比較高。

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這種 cross-reactivity 有多普及呢？他們分析了疫情前 2011 年到 2019 年時收集的血清，和新冠病毒患者的血清做比較。結果顯示冠狀病毒間的 cross-reactivity 在年輕族群中比較普遍，2011 年到 2018 年間，十六歲以下的健康個體約有 50% 的血清內有可辨識新冠病毒 Spike 的 IgG，17 - 25 歲之間只有 2%；2019 年採集的中年族群的血清，約有 8% 有低量的、可辨識新冠病毒 Spike 的 IgG。例外，新冠病毒患者血清內同時有可辨識 Spike 的 IgG, IgM 和 IgA，而未感染者的則主要為 IgG，沒有 IgM 和 IgA，重要的是未感染者血清內的抗體具有中和新冠病毒的效力。



Paper:

KW Ng et al, Preexisting and de novo humoral immunity to SARS-CoV-2 in humans. Science (2020)

抗新冠病毒的合成小抗體 sybodies

之前美國德州大學的研究團隊首先發表 Spike protein cyro-EM structure 後不久，又發表了一篇從駱馬身上釣出抗新冠病毒的小抗體 nanobodies。

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nanobodis 是什麼呢？駱馬和鯊魚體內除了有普通的 IgG 之外，還有一種只有 heavy chain 的小抗體 HCAbs，其辨識抗原的 Fv (variable region)為 VHH，又稱為 nanobodies，近幾年因為體積小，相較傳統 IgG 易純化，開始受到注目。

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駱馬和鯊魚體內產生的小抗體是天然的，需要先把抗原打進駱馬體內，等牠們產生抗體後，從牠們的免疫細胞內抽出抗體的基因序列製造成 libraries，再用噬菌體展示(phage display)的技術釣出抗抗原的小抗體，這個普遍抓抗體的方法雖然不難，但費時費力，而且你需要先找到駱馬用 XD。

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2018 年的時候，瑞士蘇黎世大學的研究團隊研發了三個針對細胞膜蛋白(membrane proteins)不同面的人造合成小抗體 libraries，這三個 libraries 的不同主要在於 CDR3 的長度，不同的長度會和蛋白表變不同的地方結合[註1]，而從這些 libraries 釣出來的合成小抗體(synthetic nanobodies) 稱為 sybodies。

註1：他們把這三個 libraries 稱為 concave, loop, convex。Concave 的 CDR3 比較短，只有六個氨基酸長，主要透過它們 concave surface 和抗原結合。 Loop 的 CDR3 則是中長度(12 a.a.)，是一個 loop 的形狀，可以進到接受器(receptor)的 cavity 而結合。Convex 的 CDR3 最長(16 a.a.)，會形成一個 hydrophobic core 和抗原結合。


Figure / Selection of sybodies against membrane proteins within three weeks (Zimmermann et al, eLife 2018)

EMBL Hamburg 的研究團隊這個月在 Nature Comm 發表了他們的研究，他們從三個 sybody libraries 裡共釣出 85 個合成小抗體，純化了其中 62 個後，檢測了它們的 binding affinity，其中有六個和 Spike RBD 結合力很強，Kd 範圍約為 10 nM - 60 nM，其中以 Sb23 這株小抗體最強。

小抗體的結合力強，那是否有抑制病毒的作用呢？他們掃了 36 個小抗體，測試它們的中合力(neutralizaiton activity)，發現其中十一個小抗體的 IC50 < 20 ug/ml，六個的 IC50 < 5 ug/ml，Sb23 的 IC50 則只有 0.6 ug/ml (48 pM)，當它和 Fc 接在一起後，IC50 可達到 0.007 ug/ml (0.56 pM)，未來有望用於治療。

IC50 用 ug/ml 來表示真是不習慣啊，於是我把它換算成 pM 惹。

Sb23 (MW = 12.5 kDa)
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFPVESENMHWYRQAPGKEREWVAAIYSTGGWTLYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAVQVGYWYEGQGTQVTVS



Articles:

EMBL Press release / cientists identify synthetic mini-antibody to combat COVID-19

TN / Synthetic Mini-Antibody Binds to and Neutralizes SARS-CoV-2 (Nov 2020)

Addgene blog / No Llamas Required - Synthetic Nanobodies Against Membrane Proteins (June 2020)



Papers:

 TF Custodio et al, Selection, biophysical and structural analysis of synthetic nanobodies that effectively neutralize SARS-CoV-2. Nature Comm (2020)

I Zimmermann et al, Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife (2018)

減重手術讓你變成瘦子的腸道菌

大家看新冠病毒看膩了嗎？之前看到關於用腸道菌變瘦的文章，突然想起念研究所時看到的一篇研究，當時看的時候覺得好新奇，還跟我爸媽聊了這個研究，一直想分享，結果一直忘，現在想起來分享一下好了。

瘦子和胖子的腸道菌落有什麼不同嗎？醫療性的減肥方法之一是做胃繞道手術(roux-en-Y gastric bypass, RYGB)，通常用來治療嚴重的肥胖症，手術後可以減掉 65% ~ 75% 的體重，而且是長期的，為什麼呢？是因為手術改變了生理上的代謝，改變了賀爾蒙的表現，還有什麼其他可能的原因呢？其中一個被想到的是腸道菌，手術是否會改變腸道菌的生態？2013 年發表在 Science Translational Medicine 的這篇是老鼠實驗，他們幫老鼠做了胃繞道手術後，研究牠的腸道菌變化。

這篇研究裡面用的老鼠株是被餵了高脂食物後就會肥胖的易胖鼠，被分成三組做實驗。

1. RYGB + HFD (high-fat diet)
胃繞道手術兩週後吃高脂食物，但是術後三週內，老鼠體重下降 29%，而且體重維持到實驗結束還是這麼低。他們發現手術後老鼠雖的肥肉雖然減少了，但是瘦肉還存在，重要的是牠們的脂肪肝程度和肝臟的三酸甘油酯(triglyceride)都比第二組的 SHAM 老鼠還要低。

2. SHAM + HFD
假裝有動手術但只是開個刀，手術兩到三個禮拜後就恢復原本的體重了，之後再吃了兩個禮拜的高脂食物後就胖惹 27%。

3. WMS = SHAM + restricted food
假裝有動手術但只是開個刀，但是一直被控制飲食，希望維持跟 RYGB 老鼠一樣的體重，發現要少吃 25% 熱量的食物才能維持跟 RYGB 老鼠一樣苗條的身材。這組的脂肪肝和三酸甘油酯都和 RYGB 老鼠一樣低，但這是因為牠們節制飲食才達到的成果，RYGB 老鼠則是一樣大吃大喝還是一樣瘦。



為什麼 RYGB 老鼠大吃大喝還能維持苗條的身材？他們發現雖然 RYGB 老鼠大吃大喝，但大部分的熱量都被大出來了，所以真的吃進去了熱量是其他兩組的一半而已。另外，RYGB 老鼠的血糖也正常，跟有控制飲食的 WMS 老鼠一樣。

胃繞道手術對腸道菌生態有影響嗎？他們分析了手術前的糞便和手術後三個月內每週的糞便，看看腸道菌生態有什麼改變，結果發現手術後一週就出現了變化，這個變化持續了幾週，然後在五個禮拜後趨於穩定，SHAM 和 WMS 這兩組老鼠的腸道菌則是沒什麼變化。RYGB 老鼠手術後體內的 Bacteroidetes, Proteobacteria (Escherichia) 和 Verrucomicrobia (Akkermansia) 迅速增加，且這種增加是長期性的，Firmicutes 裡面以 Clostridiales 為主。SHAM 的腸道菌落則沒有什麼變化，Firmicute 裡面是以 Lactobacillales 和 Erysipelotrichales 為主。

RYGB 的好處跟腸道菌生態有關嗎？他們把把 RYGB, SHAM 和 WMS 老鼠的腸道菌移植到瘦的無菌鼠(germ-free)體內，看看有什麼變化。結果發現無菌鼠在移植了 RYGB 的腸道菌兩週後，體重降低了 5%，沒移植腸道菌或移植了 SHAM 腸道菌的老鼠則體重沒有變化，不過移植了 SHAM 或 WMS 腸道菌的老鼠需要節食，體重才能維持跟沒移植的老鼠一樣。另外，雖然移植了 SHAM 腸道菌的老鼠在體重上沒太大變化，但體脂肪比沒做腸道菌移植的老鼠多了很多。

做過胃繞道手術老鼠的腸道菌在減重上有某種程度的貢獻，那在人類身上呢？2015 年發表在 Cell Metabolism 的研究分析了手術九年後的腸道菌變化。這篇研究的對象除了做胃繞道手術的之外，還有做垂直胃束帶隔間手術的(vertical banded gastroplasty, VBG)，他們分析了 RYGB, VBG 和嚴重肥胖但沒做手術(OBS, obesity)的 BMI、腸道菌落，還有把腸道菌移植到無菌鼠體內後的影響。

分析發現 RYGB 手術後的腸道菌落和 VBG 和 OBS 差很多，但是 VBG 和 OBS 之間卻無太大差別。和老鼠一樣，RYGB 術後的腸道菌落中，gammaproteobacteria 比 OBS 要高，但是 Clostridium 比較低。當把腸道菌移植到無菌數體內後，接受 RYGB 人類腸道菌的老鼠的體脂在移植兩週後比接受 OBS 的少 43%，接受 VBG 腸道菌移植的則少 26%，這期間這三組老鼠的體重和飲食都一樣，不過接受 RYGB 老鼠的瘦肉平均增加率比其他兩組都高，RQ (respiration quotient, aka respiratory ration) 也比較低，顯示牠們的代謝是以消耗脂肪為主。

RQ = CO2 released / O2 absorbed

以上看來，腸繞道手術後形成的腸道菌落會改變代謝機制，增加熱量的消耗，進而造成脂肪降低。不過，移植腸道菌造成的減重是否是長期的，從這兩篇研究中看不出來，之前有研究顯示用移植腸道菌使其被移植者的腸道菌落改變是短暫的，想用腸道菌減肥可能需要長期的移植。另外，這兩篇都是用老鼠，在人類身上是否有相同效果並不知道。

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「腸道菌並不是你吃進去後就會順利在你體內住下來了，很多情況是過幾天後它們就消失了，所以需要每天吃。」



Papers:

AP Liou et al, Conserved Shifts in the Gut Microbiota Due to Gastric Bypass Reduce Host Weight and Adiposity. Science Translational Medicine (2013)

V Tremaroli et al, Roux-en-Y Gastric Bypass and Vertical Banded Gastroplasty Induce Long-Term Changes on the Human Gut Microbiome Contributing to Fat Mass Regulation. Cell Metabolism (2015)

抗新冠病毒的 T cells 和抗感冒冠狀病毒的有 cross-reactivity

另外兩篇關於 T cells 對新冠病毒反應的研究，一篇是分析健康個體和新冠患者的 T cells，一篇是分析未感染者體內對新冠病毒有反應的 T cells，看看他們和普通感冒的冠狀病毒是否有 cross-reactivity。

刊在 Science 的那篇之前已經有一篇發表在 Cell，同樣是分析健康個體和 COVID-19 康復患者的血清，然後發現所有康復患者都有可辨識新冠病毒 Spike protein 的 CD4+ (helper) T cells，T cells 的反應程度和 IgG 量成正向相關，然後七成的康復患者有可對抗新冠病毒的 CD8+ (killer) T cells，而且反應強烈。康復患者除了帶有可辨識 Spike protein 的免疫細胞外，他們也帶有可辨識其他病毒蛋白的 T cells，像是 M protein 和 N protein。

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在之前的研究裡，他們同樣也分析了疫情前採集到的血清，同樣帶有可辨識新冠病毒的 T cells。

「他們檢測了於 2015-2018 年採樣到、沒有感染過新冠病毒的血液檢體，結果發現其中有 40% - 60% 含有可以辨識新冠病毒的 helper T cells，不過和康復患者不同的是他們的 T cells 反應雖然也是以 Spike 為主，但幾乎沒有對 N protein 或 M protein 有反應的 T cells，次主要的是 NSPs (non-structural proteins)。而之所以會有這些 T cells，可能是因為這些人之前感染過其他種類的冠狀病毒，cross-reactivity 使他們體內也有能辨識新冠病毒的 T cells。研究者們認為這是之前感染其他四種引起感冒症狀的冠狀病毒時產生的，因為這些血液檢體裡都有針對至少其中三種常見冠狀病毒的 T cells，血清檢測也顯示全部都有 HCoV-OC43 和 HCoV-NL43 Spike protein 的 IgG 抗體，表示大多數人都感染過常見的四種感冒冠狀病毒，而且至少感染過超過三種，而這也可能是為什麼大部分的人感染到新冠病毒後都只是輕症或無症狀。」

註：常見的四種感冒冠狀病毒為 NL63, 229E, OC43 和 HKU1。

這和後來瑞典，以及 Duke-NUS 的研究結果相似，未感染者的體內有可辨識 Spike 和 NSPs 的 T cells，但是極少有可辨識 N protein 的。那這些對新冠病毒有反應的 T cells 是哪裡來的呢？是因為感染過感冒冠狀病毒而得來的嗎？如果是的話，表示抗普通冠狀病毒的 T cells 和抗新冠病毒的 T cells 是有 cross-reactivity 的。他們後來發表在 Science 的這篇研究，就是分析未感染者體內的 T cells 可辨識的新冠病毒蛋白有哪些，另一篇德國研究團隊發表在 Nuture 也做了類似的分析。（德國的這篇之前已先發表在 medRxiv）

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他們用 2018 年採樣到的血清去掃新冠病毒的蛋白片段，看對哪些片段有反應，大部分對病毒蛋白有反應的為 CD4+ T cells，少數為 CD8 T cells，和之前的研究結果一致。用來測試 T cells 反應的病毒片段分為兩組，一組是 Spike 的片段，一組是非 Spike 的片段，能被 T cells 辨識的片段大約是個一半。T cells 有反應的 Spike 那一半只有 11% 的目標是 RBD，而非 Spike 的那一半則大多是 NSPs，並且沒有對 M proteins 有反應的。相較之下，COVID-19 患者的 CD4+ T cells 則是對 M proteins 有強烈反應。

ok, 那這些疫情開始前一年的血清到底是為什麼有抗新冠病毒蛋白的 T cells？到底是不是因為和其他普通的感冒冠狀病毒有 cross-reactivity？他們發現這些血清裡的 T cells 都對常見的感冒冠狀病毒有反應，包括了 NL63, OC42 和 HKU1。另外，有 57% 的 cross-reactivity 在於那些蛋白片段有 >67% 的相似度。

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下面這個 podcast 是對這篇研究的討論：Immune 34 - Coronavirus cross-reacting T cells



如果對免疫細胞實驗不了解的，podcast 裡解釋滿清楚的，下面幾點是我筆記到的：

1. 未見識過新冠病毒的 naive T cells 被新冠病毒的蛋白片段刺激後(1st boost)，會轉變成 memory T cells，memory T cells 如果再度接受刺激(2nd boost)，則會快速繁殖(proliferation)，因此如果未感染者血清內的免疫細胞接受新冠病毒的蛋白片段刺激後便快速繁殖，表示他們體內已有可辨識新冠病毒的 T cells。

2. MHCI 和 MHCII 辨識的 peptide 長度不一樣，MHCI 主要表現在 CD8+ T cells，能夠抓到 peptide 長度是 8-10 個氨基酸；MHCII 表現在 CD4+ T cells，辨識的則是 13-18 個氨基酸長，因為他們用的 peptide 長度是 14-15 個氨基酸長，所以抓到的主要是 CD4+ T cells，這並不表示未感染者體內沒有 anti-Spike CD8+ T cells，而是這個實驗設計本身就是以釣出 CD4+ T cells 為主。

3. 因為人體內的 CD4+ T cells 有兩種：未見識過新冠病毒的 naive T cells 和見識過新冠病毒的 memory T cells，如果這些 2018 年採集的、未感染過新冠病毒的血清內有可辨識新冠病毒的 T cells 是因為和其他冠狀病毒的 cross-reactivity 而產生的，則需要確定它們是 memory T cells，怎麼確定？Naive T cells 和 memory T cells 表面的 markers 不一樣，所以可以用來辨識是哪種。

德國的那個則是比較了 COVID-19 患者的血清和健康個體的 T cells 對新冠病毒的反應，83% 的患者對 Spike 有反應，35% 的健康個體對 Spike 有反應（健康個體的 PCR 和血清檢驗為陰性）。雖然 COVID-19 患者和健康個體的 T cells 都可以辨識 Spike，但是有些差別。COVID-19 的 T cells 對 Spike S1 和 S2 domain 的反應程度差不多，但健康患者對 C-terminal 的 S2 反應比較強烈，而這個部分和其他常見的感冒冠狀病毒相似度很高，於是他們測了健康個體血清裡的抗體，發現所有健康個體都帶有常見的冠狀病毒，而且是四個全帶。這也可能是為什麼小朋友不易感染新冠病毒，因為學校不時有感冒冠狀病毒傳來傳去，大部分的小朋友應該都有抗冠狀病毒的免疫細胞惹。XD

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「當時參與研究的志願者中，只有 11% 體內沒有抗體，顯示在當時的年代(1961-1977)，這株冠狀病毒非常普及。當一年後再讓這些志願者感染這株病毒，看看抗體是否還有保護作用，發現抗體對同株的病毒有保護作用，但對相近病毒(也就是同樣是 alphacoronavirus，但是不同病毒株)只有部分的保護作用。後來有篇研究(Callow et al, 1990)顯示，如果體內抗體量不夠的話，229E 的康復患者可被二次感染。參與此研究的志願者在感染病毒一週後，IgG 開始上升，然後在十四天時達到高峰，一年後再測的時候抗體量仍然比感染前高，當再一次接受感染挑戰的時候，雖然約有一半的人被二次感染，但都沒有症狀。另外，第一次感染的時候，在前五到六天都測得到病毒，而二次感染時，只有前兩天測得到病毒，顯示病毒被清掉的很快。」



所以，到目前大概知道了什麼？

1. 未感染的健康個體雖然沒有抗新冠病毒的抗體，但是有可辨識新冠病毒的 T cells。COVID-19 患者的 T cells 幾乎對所有新冠病毒的蛋白都有反應，包括 Spike, M & N proteins，以及 NSPs，但未感染者則是以 Spike 和 NSPs 為主，對 N 沒什麼反應。

2. 有的原因很可能是因為感染過常見的感冒冠狀病毒，體內已有抗冠狀病毒的 T cells，由於有 cross-reactivity，因此這些 T cells 也可以辨識新冠病毒。

3. Cross-reactivity 的部分目前知道的可能有 Spike S2 和一些 NSPs，homology 可能要高於 67%，cross-reactivity 才會比較高。


未感染者體內雖然有可辨識新冠病毒的 CD4+ T cells，但並不表示它們有保護作用，因為他們是 helper T cells，並沒有消滅病毒或感染細胞的實質功能，所以我還滿想知道未感染者體內是否有 CD8+ T cells。



原論文：

J Mateus et al, Selective and cross-reactive SARS-CoV-2 T cell epitopes in unexposed humans. Science (2020)

J Braun et al, SARS-CoV-2-reactive T cells in healthy donors and patients with COVID-19. Nature (2020)

不需用細胞和病毒的中和抗體檢測

快速抗體檢測，這是之前新加坡大學和 Duke University 合作的那個，他們測的是體內的中和抗體(neutralizing antibodies)，就是可以和病毒結合，使它不能感染細胞，有抑制病毒作用的抗體。

要測體內是否有中和抗體，需要做抗體中和檢測(virus neutralization test, VNT)，簡單來說就是把抗體和病毒先混在一起 incubate，一個小時後再把抗體和病毒的混合物來拿來感染細胞，看看感染率有多少。中和抗體越多，可以抑制的病毒也就愈多，感染的細胞也就越少。通常這種檢測用的是原本的、活的病毒，所以要測新冠病毒的中和抗體的話，用的就是新冠病毒，不過如果要用新冠病毒，就需要 BSL3 的實驗室。在這篇論文裡，他們用的方法是 surrogate VNT (sVNT)，不需要用活的病毒，也不需要細胞，所以在 BSL2 實驗室就可以做，而且論文說他們在新加坡(n=175)和中國(n=50)的患者群身上測試結果，99.93% specificity (準確度) & 95-100% sensitivity (敏感度)。



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不用病毒，也不用細胞，要怎麼測試呢？因為我們已經知道新冠病毒感染是透過它的 spike protein RBD (receptor-binding domain) 和人類細胞表面的接受器 ACE2 結合而進入細胞的，所以他們認為只要在 ELISA plate 上測試就可以了，看了論文裡的圖示，其實就是普通的 ELISA，把 ACE2 coat 在 ELISA 上面，當作是細胞表面，然後把患者血清和 RBD 混合，RBD 已經是 HRP-conjugate，之後再把混合後的 Ab/RBD-HRP 加到 ACE2-coated ELISA plate，最後測訊號看看有多少 RBD 和 ACE2 結合，訊號越低的就表示血清裡中和抗體的含量越高。

他們還和兔子、老鼠、駱馬和人類的其他十五個 mAb 做比較，看看他們的 sVNP 是否能分別出普通抗體和有中和作用的抗體，結果顯示那些 mAb 在他們的 sVNP 檢測裡只有微弱的中和病毒的效用，有的甚至沒有，表示 sVNP 測到的是中和抗體的含量，而不是所有抗新冠病毒的抗體 [註]。

註：並不是所有抗新冠病毒的抗體都是中和抗體，有抑制病毒的效用，之前有研究顯示只有 anti-Spike S1 和 anti-Spike RBD 的抗體有抑制病毒的效用。

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除此之外，論文裡說他們的 sVNT 測的是所有中和病毒的 isotypes，也就是包括 IgG 和 IgM，不像其他大多數的抗體檢測，只有測 IgG 或 IgM。他們用了不同濃度的 IgM 和 IgG 抗體去測，都可以測到中和抗體，即便 IgG 和 IgM 量都很低，也可以測出中和抗體 70-90% 的抑制功效，表示他們的 sVNT 的敏感度很高。另外，他們也試了不同動物的中和抗體和普通抗體，也就是把 RBD 或整顆病毒打入動物體內，被打入 RBD 的動物體內產生的抗體便都會是有抑制效用的中和抗體，打入整顆病毒的可能只有部分是中和抗體，結果顯示皆可測到中和抗體，不過被打入 RBD 的動物血清抑制病毒的效力比較高。

最後，就是測試準確度了，看看 sVNT 是否可分別出 SARS, 新冠病毒和其他的冠狀病毒。實驗結果顯示感冒冠狀病毒(229E, NL63 or OC43)患者的血清裡並沒有測到可抑制新冠病毒的抗體，而 SARS 康復患者的血清內則有一點點，顯示有一點 cross-reactivity。不過當把 SARS sVNT 和 SARS-CoV-2 sVNT 放在一起比較的話，是可以看出分別的，SARS 康復患者的血清對 SARS RBD 的抑制效果比 SARS-CoV-2 要好。

雖然他們在 sVNT 裡 SARS 患者的血清和新冠病毒是有 cross-reactivity，但其他研究團隊用病毒和細胞系統的中和檢測(conventional VNT, cVNT)中是沒有的，所以這表示 sVNT 的敏感度比較高嗎？我覺得有意思的是 SARS 康復患者的血清裡仍測得到中和抗體，大家都知道 SARS 已經過去十七年了，這表示感染過 SARS 後，體內的抗體能維持十七年，而不是之前認為的只有三年嗎？他們有跟 2003 年時，感染不到一年後採的血清相比，十七年後血清內的中和抗體量是比感染不到一年時低，但也沒有說低很多。

他們也和普通的 cVNT 做比較，看結果是否一樣，sVNT 的結果是否可以轉譯成 cVNT，看起來結果是一樣的，表示 sVNT 應該可以取代 cVNT。剛需要花上兩三天的 cVNT 相比，sVNT 花的時間是要短得多，一天內可以搞定，不過論文中說只要一、兩個小時也 .... incubation 就兩個小時惹，再加處理血清和做 ELISA 本身的時間，總共也要花個三、四個小時吧，雖然他們用 RBD-HRP 就可以少一個小時的 incubation time, but still.... 不過它的好處是普通實驗室就可以做惹。



原論文：

CW Tan et al, A SARS-CoV-2 surrogate virus neutralization test based on antibody-mediated blockage of ACE2–spike protein–protein interaction. Nature Biotech (2020)

未感染過新冠病毒或 SARS 的人也有對抗新冠病毒的 T cells

體內對抗病毒或細菌的免疫系統除了抗體外，還有免疫細胞們。之前說過，免疫系統有兩種，一種是第一線的先天免疫系統(innate immunity)，另一種是感染後學習得來的 adaptive immunity。簡單來說，第一線的先天免疫系統裡，負責打仗的是白血球，包括巨噬細胞(macrophage)和自然殺手細胞(natural killer cells, NK cells)等等。負責第二線 adaptive immunity 則是消滅被感染細胞的 T cells 和生產抗體的 B cells。通常感染後的 B cells 反應程度和 T cells 反應程度是相關的，有一個就有另一個，之前較多研究是著重在感染新冠病毒後，體內是否產生可以對抗的中和抗體(neutralizing antibodies)，不過最近有幾篇研究是關於 T cells 免疫反應的，有趣的發現是有的人體內測不到抗新冠病毒的抗體，但卻有抗新冠病毒的 T cells，尤其是 CD4+ (helper) T cells。

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人類冠狀病毒有七個，除了這次的 SARS-CoV-2 和之前的 SARS, MERS，另外就是造成感冒的 OC43, HKU1, 229E 和 NL63，這些全部都會引起 T cells 反應和產生抗體，不過抗體消退的比 T cells 反應快，SARS 患者的抗體大概可維持兩、三年，不過他們的 memory T cells 在感染後至今已有十七年了仍存在於體內。之前有研究顯示抗冠狀病毒的抗體有 cross-reactivity，除了抗 spike RBD (receptor-binding domain) 的抗體比較有 specificity，由於其他蛋白在冠狀病毒中還滿 conserved，抗這些蛋白的抗體很多都有 cross-reactivity，也就是說抗其他冠狀病毒的抗體也可以辨識新冠病毒的抗體。抗體是這樣，T cells 也是這樣嗎？

前幾天發表在 Nature 的一篇研究分析了三組人的 T cells，包括有 SARS 康復患者、新冠病毒的康復患者，以及沒有感染過 SARS 和 SARS-CoV-2 或接觸過患者的個體，想知道他們體內是否有對抗新冠病毒的 T cells ，還有對病毒的哪些部分有反應，例如結構蛋白(structural protein) nucleocapsid (NP) 和非結構蛋白(non-structural proteins) NSP7 等等 [註]。

註：病毒蛋白分為兩種：structural proteins 和 non-structural (NS) proteins。Structural proteins 就是組成病毒的蛋白，例如 capsid proteins 或是 envelope proteins。NS proteins 大多是酶類蛋白，功能為調控病毒蛋白的表現居多，這篇論文裡測的 NSP7 和 NSP13 在冠狀病毒的小族群裡變化不多，SARS 和 SARS-CoV-2 的 NSP7 和 NSP13 幾乎一樣，這種通常會有 cross-reactivity。

1. 新冠病毒患者, n = 36

所有康復患者的免疫細胞(PBMC, peripheral blood mononuclear cells)對 NP 有反應，但是只有 33% 的人對 NSP7 和 NSP13 有反應。有的人的 T cells 可以對 NP 的很多片段有反應，有些 NP 片段除了可被新冠病毒患者的 T cells 辨識外，同時也可以被 SARS 康復患者的 T cells 所辨識。對病毒 NP 片段有反應的以 CD4 T cells 為主。

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2. SARS 康復患者, n = 23

SARS 已經過去十七年了，康復患者的免疫系統仍然可以對抗 SARS 嗎？這篇研究顯示，SARS 康復患者體內仍存有可以辨識 SARS NP 的免疫細胞，而且也可以辨識新冠病毒的 NP，不過對其 NSP7 和 NSP13 沒什麼反應。這是否說，新冠病毒感染患者的免疫細胞維持的時間和 SARS 康復患者的免疫細胞一樣，可以維持長達十多年後仍對病毒有反應？

3. 沒有 SARS 或新冠病毒病史和接觸史, n = 37

其中二十幾位的血液是 2019 年七月以前採樣的，十一位是抗體測試對新冠病毒的 NP 反應為陰性。分析結果顯示一半以上未感染者的 T cells 可以辨識新冠病毒的蛋白片段，不過它們辨識的片段大多和康復患者體內的 T cells 辨識的病毒片段不同，主要以 NSP7, NSP13 和 NP 為主。NSP7 和 NSP13 雖然在 SARS 和 SARS-CoV-2 間的相似度高，但是和感冒冠狀病毒 OC43, HKU1, NL63 和 229E 的相似度滿低的，那這些未感染過 SARS-CoV-1/2 個體體內的 T cells 不是因為感染過感冒冠狀病毒後習得來的，那是從哪裡得來的呢？是其他未被發現的冠狀病毒嘛？

這篇研究中也提到，雖然體內有可對抗新冠病毒的 T cells，不代表可以使個體免於感染，不過可以在感染之後就消滅它，至少不會使它演變成重症。



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從這篇研究我們知道了什麼？

1. COVID-19 康復患者體內有可以辨識 SARS-CoV-2 的免疫細胞，而且有 cross-reactivity，也可以辨識 SARS 的病毒蛋白。

2. SARS 康復患者體內的免疫細胞可以維持十七年後仍對 SARS 蛋白有反應，並且也有 cross-reactivity，同樣對新冠病毒有反應。

3. 未感染過 SARS-CoV-1/2 或未接觸過患者的個體體內也有可以辨識新冠病毒蛋白的免疫細胞，不過辨識的蛋白和 SARS-CoV-1/2 的康復患者不同，以 NSP7 和 NSP13 為主，不像 SARS-CoV-1/2 康復患者的免疫細胞，主要辨識的是 NP。

4. 目前還不知道為什麼未感染者的體內會有可以辨識 SARS-CoV-2 蛋白的免疫細胞，只知道不是因為感染過感冒冠狀病毒後產生的。



Articles:
TN / “Common Cold” Coronaviruses Could Help Produce Anti-SARS-CoV-2 Immune Cells (July 2020)


Papers:
DM Altmann & RJ Boyton, SARS-CoV-2 T cell immunity: Specificity, function, durability, and role in protection. Science (2020)

NL Bert et al, SARS-CoV-2-specific T cell immunity in cases of COVID-19 and SARS, and uninfected controls. Nature (2020)

輕症及無症狀患者帶有可對抗新冠病毒的 T cells

免疫系統除了較為人知的白血球，例如巨噬細胞(macrophae)等等，還有抗體外，另外就是 T 細胞和製造抗體的 B 細胞。最近有幾篇研究是關於感染新冠病毒後，體內的 T 細胞反應，發現康復患者體內除了有抗 Spike protein 的抗體外，同時也都有能夠辨識新冠病毒的 CD4+ (helper) T cells，並且有強烈反應。也有研究顯示，未感染過新冠病毒的患者的血液檢體裡，也含有可辨識新冠病毒的 helper T cells。

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至於輕症或無症狀患者呢？輕症或無症狀患者的體內不見得測得到抗體，不過最近瑞典的 Karolinska Institute 的研究團隊發現，輕症及無症狀患者體內有對抗新冠病毒的 T cells，即便他們體內沒有產生足夠、可被檢測到的抗體量。

這篇研究先比較了重症患者、康復後的輕症或無症狀患者，還有健康個體的血液，發現其 CD4+ T cells 裡的 CD38 和 PD-1，以及 CD8+ T cells 裡的 CD38 和 CTLA-4 等等的表現有明顯的區別，重症患者的 CD38 和 PD-1 表現比健康個體要高。普遍來說，患者早期的 CD8+ T cells 會有 CD38 和 PD-1 表現增加的現象，而康復患者則是偏向 CCR7+ 的表現增加。他們利用這些差別，分析了今年五月中院內的五個不同族群、兩百位多位個體的 memory T cells，包括在疫情發生前或發生中的健康個體、輕重症和無症狀的康復患者，和康復患者一起住的家庭成員。

跟之前的研究一樣，疫情爆發前的健康個體血液裡有可辨識新冠病毒 membrane protein 和 spike protein 的 T cells，但是對 nucleocapsid 沒有反應，而康復患者則對這三個病毒蛋白都有反應。令人覺訝異的是輕症和無症狀患者，以及在疫情期間捐血的健康個體的血液裡，皆有對這三個病毒蛋白都有反應的 T cells。另外，CD4+ T cells 的反應比 CD8+ T cells 強烈。最後，他們比較了這五個族群體內抗體和 T cells 的關係，發現有些人的抗體檢驗為陰性，但是卻帶有對抗 nucleocapsid, membrane protein 和 spike protein 的 CD4+ 和 CD8+ T cells。帶有對新冠病毒有強烈 T cell responses 的人口中，除了患者家屬、輕症及無症狀患者外，還有在疫情期間的健康患者，帶有抗病毒 T cells 的人數是帶有抗體人數的兩倍之多，表示即便用血清檢測也低估了感染人數。

有些學者擔心，輕症或無症狀患者體內的免疫反應不足以產生保護效應，因為抗體量不高，不過這個研究顯示，雖然抗體不高，但是對抗病毒的 T cells，表示已有可以對抗病毒的免疫機制。在之前 SARS 疫苗的研發中，發現疫苗雖然沒在老鼠體內產生足夠抗體，但卻可以引起 T cell responses，並且足以使老鼠免於不被 SARS 再次感染而死亡，這個現象同樣也在這個研究裡的輕症和無症狀康復患者中觀察到。也有其他研究觀察到，未感染者帶有可辨識新冠病毒的 T cells，可能是因為和其他冠狀病毒有些許的 cross-reactivity 造成的，如果是這樣的話，是不是血清低估感染人數似乎也不能確定。



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抗新冠病毒的 T cells 和抗感冒冠狀病毒的有 cross-reactivity


Articles:

TN / SARS-CoV-2 Immunity Likely To Be Higher Than Antibody Testing Has Shown (July 2020)

Karolinska Instututet / Immunity to COVID-19 is probably higher than tests have shown (June 2020)


Paper:

T Sekine e tal, Robust T cell immunity in convalescent individuals with asymptomatic or mild COVID-19. bioRxiv (2020)

T Sekine e tal, Robust T cell immunity in convalescent individuals with asymptomatic or mild COVID-19. Cell (2020)

萬用流感疫苗的可能性

相信大家都得過流感，可能覺得流感沒什麼，不過全球每年因流感重症的人口高達三百五十萬人，超過四十萬人死亡。雖說目前有疫苗，但流感病毒是 RNA 病毒，突變率高，所以每年都需要新疫苗，而且因為不知道來年病毒會突變成什麼，只能用預測的，只能做到 best match，無法做到 perfect match。

目前流感疫苗用的大多是去活性的病毒蛋白來引起免疫反應，產生大量對抗病毒的抗體。疫苗主要用的蛋白是 HA (hemagglutinin) 和 NA (neuraminidase)，位於流感病毒的表面，這兩個蛋白的基因常常突變，如果預測的不夠準的話，疫苗的效用可能就大為降低。與其每年都需要預測和更新疫苗，科學家們希望能夠研發一個萬用的 universal vaccines，一支可以對抗所有流感病毒的疫苗，近年來的策略是讓免疫系統產生各種針對流感的抗體，於是標靶蛋白須為所有流感病毒株都有、變化較少的蛋白或其片段，例如 HA 的 stalk region。

註：流感病毒的 HA 分成兩個 domains (下圖)，上面的 head domain 是基因突變較頻繁的部分，頂端是 receptor binding site，下面是 stalk domain，相較起來突變較不頻繁。


Figure / Structure and classification of influenza virus hemagglutinins (E Kirkpatrick et al, Scientific Reports 2018)

人類的免疫系統，除了抗體之外，還有免疫細胞，引發免疫細胞反應，也是另一種方法。這篇研究是是想利用 cGAMP (2’,3’-cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate) 啟動肺部內的免疫細胞 CD8+ resident memory T cells (T RM cells) 對抗流感病毒。Type I interferons (IFN-Is) 是啟動免疫系統對抗病毒感染主要媒介，STING (stimulator of interferon genes)是啟動肺泡表皮細胞和免疫細胞裡 IFN 表現的訊息因子，cGAMP 則是 STING agonist。在這篇研究裡，他們用 PS (pulmonary surfactant) 作為載體把 cGAMP 和去活性的 H1N1 疫苗一起送進肺部的巨噬細胞(macrophages)，再由巨噬細胞把 cGAMP 送進肺泡的表皮細胞 AECs (alveolar epithelial cells)和 APC (antigen-presenting cells)，進而啟動免疫系統。


Figure / Strengthening influenza virus vaccination (Herold & Sander, Science 2020)

他們把 PS-cGAMP 和去活性的流感病毒(PS-GAMP adjuvant H1N1)一起打進老鼠，兩天後便觀察到其效用，除了早期大量增加的 NK cells 和之後強烈的 CD8+ T cells 反應，施打後兩週也觀察到大量的抗體產生，比疫苗本身引起的抗體量多十倍以上，而產生的抗體針對的不只是 H1N1 而已，還包括其他三種 -- H3N2, H5N1, H7N9。最後，PS-GAMP adjuvant H1N1 疫苗在施打兩天就可產生保護作用，引起的免疫反應還可維持至少六個月，施打疫苗一個月後還可測到 CD8+ T RM cells，保護老鼠不再受到 H1N1 和其他流感病毒株的感染。

嗯，如果在人體上也有同樣效用的話，應該也可以應用在新冠病毒的疫苗上。



Papers:

S Herold & L Sander, Toward a universal flu vaccine. Science (2020)

J Wang et al, Pulmonary surfactant-biomimetic nanoparticles potentiate heterosubtypic influenza immunity. Science (2020)

E Kirkpatrick et al, The influenza virus hemagglutinin head evolves faster than the stalk domain. Scientific Reports (2018)

有記憶的先天免疫系統

先天免疫系統是可以學習、訓練的嗎？

關於新冠病毒，目前知道的就是大多數人都是無症狀或是輕症，只有少數人會進展到重症，而且大多數是老年人或慢性病患者，這是否和免疫能力有關？

人體的免疫系統有兩種，一種是 innate immune system，一種是 adaptive immune system。Innate immune defense 是先天的免疫反應，沒有針對特定外來物，通常是免疫系統和某個外來物(細菌或病毒)的第一次見面。Adaptive immune system 則是改進過後的免疫反應，是免疫系統跟外來物第一次見面後學習來的，有記憶性，會針對某個外來物。例如說大家第一次感染到新冠病毒的時候，身體對抗的免疫反應是 innate immue system，在這一戰的時候，主要打仗者是各種白血球們(e.g., monocytes, macrophages, natural killer cells)，他們在打仗的過程中得到新冠病毒的蛋白資料(抗原)，然後用這些資料產生對抗它的免疫細胞 (T cells, B cells)和抗體，進化成 adaptive immune defense，當再次感染的時候，adaptive immune system 就可以立刻叫喚出針對新冠病毒的免疫細胞和抗體，快速消滅病毒。（有興趣的可以看工作細胞第三集）



Innate immunity 和 adaptive immunity 的差別主要在前者沒有記憶性，後者則是依靠前者的經驗學習記憶後得來的 immunity，不過近期有研究認為，innate immunity 也是可以被訓練成有記憶性的，也就是 trained immunity，而這靠的是改變基因表現，也就是 epigenetic reprogramming。Trained immunity 和原本的 adaptive immunity 不同點在於 [3]：

1. 參與 trained immunity 的免疫細胞有 monocytes, macrophages, natural killer cells (NK cells) 等等，adaptive immunity 則是 T cells 和 B cells。

2. adaptive immunity 是有目標性的，靠的是基因重組(gene rearrangement)後產生的、針對不同抗原的抗體，trained immunity 改變的不是基因本身，而是基因的表現(epigenetic)。有意思的是之前有研究顯示 NK cells 和 CD8+ T cells (CTLs) 有相似的基因表現機制，可能是讓 NK cells 有記憶性的的原因 [4]。

3. trained immunity 改變免疫細胞功能是短期的，只有幾個月，adaptive immunity 的改變則是長期的，可達幾年。


Figure / Schematic representation of the concept of "training immunity" (Kar & Joosten, Nature Immunology 2020)

這一篇文章要說的便是 innate immunity 是否可以被訓練，進而展現 adaptive immunity 的部分功能 [5]，也就是說在初次感染時，白血球等等習得了要產生哪些蛋白對抗，當後來再次感染的時候，不需要受到相同的病菌感染，innate immunity 的免疫細胞就會立刻產生某些 cytokines 去對抗，就是所謂的 trained immunity。之前有研究顯示卡介苗(bacillus Calmette-Guérin; BCG vaccine)可以產生 trained immunity，卡介苗是去掉毒性的活細菌疫苗，雖然針對的是造成肺結核(tuberculosis)的細菌(Mycobacterium bovis)，但是它引起的 trained immunity 有降低其他病菌感染的效用，例如流感和皰疹病毒，稱為 off-target effects 或是 non-specific effects (NSEs)。另外，健康人施打卡介苗會增加 pro-inflammatory cytokines，得到呼吸道感染的機率比沒打過卡介苗的低了 73%。

之前有研究觀察到有施打卡介苗的國家，新冠病毒確診病例和重症率比較低 [1]，可能是因為它產生的 trained immunity 的效用，對抗病菌的免疫力增強了，因而降低了新冠病毒的感染率。不過，雖然在台灣施打卡介苗是 mandatory，但是在北美並不是，根據加拿大 Health Canada 網站的資訊 [2]，卡介苗的效用不高，而且會干擾診斷，有施打過卡介苗的在肺結核的皮膚測試(TST; tuberculin skin testing)會顯示為陽性，需要病人告知是否施打過卡介苗，不然不知道陽性反應是因為卡介苗還是因為真的感染，所以並不鼓勵施打卡介苗。

"Clinical trials have demonstrated conflicting results regarding BCG vaccine's efficacy. Meta-analytic reviews have estimated the vaccine efficacy in preventing any TB disease at approximately 51%. The protective effect of BCG vaccine against disseminated TB in the newborn is estimated to be 78%.

The duration of BCG vaccine protection is not well-established. Although generally thought to have declining protection over time, one follow up study demonstrated a protective effect for as long as 60 years. BCG vaccine will not prevent the development of active TB in individuals who are already infected with M. tuberculosis. TB disease should be considered as a possible diagnosis in any vaccinee who presents with a suggestive history, or signs or symptoms of TB, regardless of immunization history."

回到卡介苗是否真的的降低新冠病毒感染或重症，因為都還只是觀察到的相關性，所以需要臨床上的確認，目前有幾個國家開始臨床試驗，預計要到今年十月才知道結果。除了卡介苗外，麻疹疫苗也被認為可以產生 trained immunity。



References:

1. JSatoNotes / If I were North American/West European/Australian, I would take BCG vaccination now against the novel coronavirus pandemic

2. Gov of Canada / Bacille Calmette-Guérin (BCG) vaccine: Canadian Immunization Guide

3. MG Netea et al, Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science (2016)

4. UK Kar & L Joosten, Training the trainable cells of the immune system and beyond. Nature Immunology (2020)

5. M Netea et al, Trained Immunity: a Tool for Reducing Susceptibility to and the Severity of SARS-CoV-2 Infection. Cell (2020)

新冠肺炎患者體內的抗體有哪些

這篇研究分析了六十幾位 COVID-19 患者體內的抗體，想知道他們在感染後的產生時間和其 neutralizing 的功效。

摘要：

1. 用 ELISA 實驗的結果，發現用 Spike RBD (receptor-binding domain) 來測試患者體內抗體的 specificity 和 sensitivity 比較高。

2. 幾乎沒有患者在症狀出現後八天內有測到中和抗體(neutralizing antibodies)，然後在第 21 天時有 91% 的患者測得到低量的 neutralizing antibodies，只有 73% 的患者體內有保護作用的中和抗體含量高於 1:80。

3. 大約有 32% 在症狀出現 21 天後，體內中和抗體的量依然很低，有的甚至沒有。

4. 大部分的人在出現症狀七天後，體內才測到較高的 IgG 和 IgM 抗體。

5. 症狀出現九天後，體內 IgG 抗體較為普遍，大多數感染過的人都有 IgG 抗體(94%)，七成的患者有 IgM。

6. FDA 建議用血清來治療的 titre 是 1:160，目前只收症狀持續兩個禮拜的康復患者捐獻的血液用於治療。

7. RBD-binding 的抗體量和保護作用(neutralizing)呈現正相關：體內 anti-RBD 的抗體越多，保護作用越大。

8. 患者體內 IgM 的量也和體內的中和抗體(neutralizing antibodies)的量呈現正相關。

註：中和抗體為可結合病毒，進而抑制其感染細胞的抗體。

相關文章：武漢肺炎輕症患者體內的免疫反應



Publication

L Premkumar et al, The receptor binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science Immunology (2020)

新冠病毒的哪個部分最能引起免疫反應呢？

知道這個有什麼用呢？可以用來做疫苗研發，如果我們知道病毒的哪個蛋白或蛋白的哪個片段可以引起有效的免疫反應，那就可以用來作為疫苗，比起打入整顆的病毒，只打入病毒的某個蛋白或某個蛋白片段會相對安全，有人想研發 DNA- 或 RNA-based 疫苗的部分原因也在此，因為它們只會在體內表現病毒的蛋白或蛋白片段，而不是整個病毒。

這個研究主要是用 Spike protein，他們把 Spike protein 依照目前所知的 domains 分成幾個片段試驗。

1. S-ectodomain (S1+S2), aa 16-1213
2. S1, aa 16-685
3. RBD, aa 319-541
4. S2, aa 686-1213

相關文章：近期和新冠病毒抗體相關的研究

他們把這些蛋白片段打入兔子體內，第一次和第一次施打隔了兩個禮拜，然後在打入後第八天取血清分析，看看哪個可以引起強烈的免疫反應。他們用 ELISA 測試血清裡的 IgG 和四種抗原的反應，結果顯示所有的血清都有可和 S-ecto 產生強烈反應的 IgG，而和其他三個抗原的反應則滿 specific，打入 S2 兔子的血清只對 S2 產生反應，對 S1 和 RBD 則沒反應。

因為 ELISA 分析的是 IgG binding，他們另外也用 SPR 分析其他 Ig binding，結果顯示在二次施打後，所有取得的血清裡，anti-Spike 的抗體中有 80% 是 IgG，10-15% 是 IgA，以及少量的 IgM。專一性的話呢， S-ecto 兔子的血清裡，大多數抗體都和 S-ecto 結合，再來是和 S1，最後是 RBD 和 S2，大概是 S-ecto 的三分之一。S1 兔子血清裡和 S-ecto, S1 以及 RBD 結合的抗體都差不多多，沒有和 S2 結合的。RBD 兔子血清裡的抗體一樣是和 S-ecto, S1 以及 RBD 結合的量都差不多，但是量都是 S1 兔子的三倍，而且這些抗體對抗原的 affinity 是其他兔子抗體的五倍。

再來就是看這些抗體的保護力了，他們用 RBD-hACE2 binding competition SPR assay 和 neutralization 測試抗體抑制病毒的功效。因為新冠病毒進入細胞靠的是 RBD 和宿主細胞 hACE2 的結合，competition SPR assay 便是測試抗體阻斷 RBD 和 hACE2 的功效如何，結果顯示 S1 兔子和 RBD 兔子的血清阻斷的效能最好，分別為 84% 和 94%，而 S1+S2 的只有 44%。那這些抗體是否可以阻止細胞被病毒感染呢？實驗結果顯示 RBD 兔子的血清抑制病毒感染的效果最好，再來是 S1 兔子的血清，最後才是 S1+S2 兔子的血清。

結論：用病毒 Spike protein RBD 產生出來的抗體對抗原的 affinity 最高，最能有效阻斷 RBD-hACEII binding，抑制病毒感染細胞的效果也最好。



Publication:

S Ravichandran et al, Antibody signature induced by SARS-CoV-2 spike protein immunogens in rabbits. Science Translational Medicine (2020)

新冠病毒感染者體內 T 細胞的免疫反應

人類體內對抗病菌的免疫機制除了透過抗體外，還有各種免疫細胞，雖然目前關於新冠病毒的研究大多著重在抗體，但免疫 T cells 也扮演著清除病毒的重要角色。康復者到底會不會免於二次感染呢？這可能和感染後產生多少抗體、抗體維持多久，和免疫細胞反應的強度有關，感染後要能產生有效的免疫反應，才表示疫苗的研發是有意義的。最近有篇研究是關於 T cells，發現有些未受 SARS-CoV-2 感染者的體內有對抗此病毒的 T cells，很可能是因為之前感染過其他冠狀病毒產生的。

關於免疫系統裡 T cells 和 B cells 的功能，我很喜歡下面這張圖，覺得畫得很清楚。B cells 是製造抗體的，T cells 是殺死受感染的細胞，但他們兩個都要先從 APC (antigen presenting cells) 那裡取得病毒的資料，才能製造出可以辨識病毒的抗體，或是受到感染的細胞。（就像你想讓狗去找嫌疑犯，要先讓牠聞一下嫌疑犯身上的味道，然後再讓牠去搜尋一樣。）


Figure / Development of immunity (Nature News 2020; doi: 10.1038/d41586-020-01221-y)

La Jolla Institute 的研究團隊想知道病毒的哪個部分可以引發強烈的 T 細胞反應，因為這個病毒蛋白的片段可能可以用來做疫苗。他們先預測了一些可能會引起強烈 T 細胞反應的病毒蛋白片段(peptides)，其中一組是 spike protein 的片段，另一組是除了 spike proteins 之外所有 SARS-CoV-2 蛋白的片段，每個約十個氨基酸長，然後把這些片段測試在 20 位新冠病毒康復患者的血清上。這二十位康復患者都算是輕症的，有症狀但是不需要住院，血清是在症狀出現後 20 - 35 天後，完全沒症狀後採集的，有先用 ELISA 檢測過，確定他們的血清內有抗 Spike protein RBD 的抗體。他們發現所有的康復患者都有可以辨識新冠病毒 Spike protein 的 helper (CD4+) T cells，helper T cells 反應的程度和 anti-Spike IgG 量正向相關，七成的患者有針對新冠病毒的 killer (CD8+) T cells，而且 T cells 的反應非常強烈。目前很多人對患者是否對新冠病毒有免疫力有疑慮，認為病毒不見得會引起免疫反應，加上有報導說有患者再次感染，不過這個研究顯示，大多數的患者的免疫系統是對新冠病毒有反應的。

註：helper T cells 負責幫助 B cells 產生抗體，和抗體 IgG 和 IgA 量有關；killer T cells (又稱 cytotoxic T cells, CTLs) 負責清除病毒。

除此之外，這些血清內也有可以辨識新冠病毒其他蛋白的 T cells，包括 M protein 和 N protein。所有患者的血清都有針對非 Spike protein 的 helper T cells，比例上大概是 50% 的 T cells 是針對 Spike protein，50% 是針對 Spike protein 以外的病毒蛋白。

由以上結果看，我們也許不用對疫苗研發太過悲觀，新冠病毒是可以引起免疫反應的，接下來要知道的是這個免疫反應是否能使人體對病毒產生保護作用，如果可以的話，研發出成功的疫苗是有希望的。

不過，這篇研究裡的患者是有症狀的，那無症狀患者是否也有可以辨識新冠病毒的 T cells，並能產生強烈的免疫反應呢？這篇研究裡沒有檢測無症狀患者的 T cells responses，但是檢測了未受感染者的 T cell responses。

他們檢測了於 2015-2018 年採樣到、沒有感染過新冠病毒的血液檢體，結果發現其中有 40% - 60% 含有可以辨識新冠病毒的 helper T cells，不過和康復患者不同的是他們的 T cells 反應雖然也是以 Spike 為主，但幾乎沒有對 N protein 或 M protein 有反應的 T cells，次主要的是 NSPs (non-structural proteins)。而之所以會有這些 T cells，可能是因為這些人之前感染過其他種類的冠狀病毒，cross-reactivity 使他們體內也有能辨識新冠病毒的 T cells。研究者們認為這是之前感染其他四種引起感冒症狀的冠狀病毒時產生的，因為這些血液檢體裡都有針對至少其中三種常見冠狀病毒的 T cells，血清檢測也顯示全部都有 HCoV-OC43 和 HCoV-NL43 Spike protein 的 IgG 抗體，表示大多數人都感染過常見的四種感冒冠狀病毒，而且至少感染過超過三種，而這也可能是為什麼大部分的人感染到新冠病毒後都只是輕症或無症狀。

註：四種常見的冠狀病毒為 HCoV-OC43, HCoV-HKU1, HCoV-NL63 和 HCoV-229E ，前兩者為 betacoronaviruses，後兩者為 alphacoronaviruses。

相關文章：感染過冠狀病毒是否就免疫了呢？

另外，上個月有篇發表在 medRxiv 也有類似的結果，他們除了從新冠病毒康復病患的體內發現有能夠辨認 Spike protein 的 helper T cells，也從沒感染過的個體裡發現可以辨識 SARS-CoV-2 的 helper T cells。



Articles:

Science / T cells found in COVID-19 patients ‘bode well’ for long-term immunity (May 2020)

TN / Analysis of SARS-CoV-2 Immune Response Bodes Well for Vaccine Development (May 2020)


Papers:

A Grifoni et al, Targets of T cell responses to SARS-CoV-2 coronavirus in humans with COVID-19 disease and unexposed individuals. Cell (2020)

J Braun et al, Presence of SARS-CoV-2 reactive T cells in COVID-19 patients and healthy donors. medRxiv (2020)

感染過冠狀病毒是否就免疫了呢？

目前市面上有很多血清檢測的 kits，而我們最想用血清檢測回答的問題有：

1. 康復患者血清內的抗體量是多少？
2. 多少才有保護作用，使人不被二次感染？（這也算是疫苗效用的一個指標，如果抗體無法避免二次感染，那疫苗 .....？）
3. 無症狀患者、輕症患者和重症患者體內的抗體量是都一樣的嗎？是否所有感染者都能產生大量的抗體，使其不被二次感染？還是重症患者的抗體比較多？
4. 體內抗體能維持多久，有效避免二次感染的抗體量會維持多久？

上個月刊在 medRxiv 的這篇研[1]究分析了目前關於冠狀病毒的相關研究，想要試著回答上面的問題，但因為新冠病毒是這幾個月的事，所以 SARS, MERS 和其他造成感冒的冠狀病毒的研究比較多。

註：常見的、會引起感冒症狀的人類冠狀病毒有 229E (alphacoronavirus), NL63 (alphacoronavirus), OC43 (betacoronavirus), HKU1 (betacoronavirus)。

1. 造成感冒的冠狀病毒，例如 229E，康復患者體內的抗體大概可以維持一年使人不被二次感染，或是再次感染的症狀也是很輕微。

2. SARS 康復患者體內的抗體在感染後第四個月達到高峰，而且則能維持到三年左右，使其不被二次感染。（不過研究裡檢測的最後時間點是感染後第三年，所以只知道至少三年，之後就不知道了。）

3. MERS 輕症換者可在症狀發生後的半年和一年的時間點測到 IgG，重症患者的時間點也差不多。

4. 其中一篇研究[2]裡是測試冠狀病毒 229E 的康復患者是否會二次感染。當時參與研究的志願者中，只有 11% 體內沒有抗體，顯示在當時的年代(1961-1977)，這株冠狀病毒非常普及。當一年後再讓這些志願者感染這株病毒，看看抗體是否還有保護作用，發現抗體對同株的病毒有保護作用，但對相近病毒(也就是同樣是 alphacoronavirus，但是不同病毒株)只有部分的保護作用。後來有篇研究[3]顯示，如果體內抗體量不夠的話，229E 的康復患者可被二次感染。參與此研究的志願者在感染病毒一週後，IgG 開始上升，然後在十四天時達到高峰，一年後再測的時候抗體量仍然比感染前高，當再一次接受感染挑戰的時候，雖然約有一半的人被二次感染，但都沒有症狀。另外，第一次感染的時候，在前五到六天都測得到病毒，而二次感染時，只有前兩天測得到病毒，顯示病毒被清掉的很快。（不知道這是不是這次有很多無症狀患者的原因，如果血清檢測可以順便檢驗其他的 betacoronaviruses 的話可能可以知道。）

5. 有些冠狀病毒抗體有 cross-reactivity，像是 229E 的抗體可以使患者約一年不被同種的冠狀感染，例如同是 alphacoronavirus 的 NL63。


Figure / Quantitative and binary readouts in serology assays. (Krammer & Simon, Science 2020)

雖說目前有很多血清抗體檢測，但是要知道新冠病毒的康復患者是否能夠避免二次感染，需要可以測量體內抗體量的檢測，而這需要做 ELISA，比較耗時也比較耗人力，需要在實驗室執行。LFA 之類的快篩只能知道有或沒有，而且需要夠高的 sensitivity 和 specificity，才不會有太多的 false positive 或 false negative，主要是用來了解病毒感染的盛行率(sero-pervalence)。



Article:

Science / Serology assays to manage COVID-19 (May 2020)


References:

1. AT Huang et al, A systematic review of antibody mediated immunity to coronaviruses: antibody kinetics, correlates of protection, and association of antibody responses with severity of disease. medRxiv (2020)

2. SE Reed, The behaviour of recent isolates of human respiratory coronavirus in vitro and in volunteers: evidence of heterogeneity among 229E-related strains. J Med Virology (1984)

3. KA Callow et al, The time course of the immune response to experimental coronavirus infection of man. Epidemiology & Infection (1990)

從駱馬體內得到的新冠病毒小抗體

哎呀呀，已經有人做了啊。這篇的研究團隊是之前做 Spike protein Cyro-EM 的那個，原來他們也有做駱馬(llama)的小抗體研究啊。

相關文章：關於武漢病毒(SARS-CoV-2) Cryo-EM 那篇論文的閒聊

如果有看過我之前關於小抗體那篇的，就知道駱馬和鯊魚除了有普通的 IgG 之外，還有一種只有 heavy chain 的小抗體 HCAbs (heavy chain antibodies)，如果只取它的 Fv (variable region)，體積會更小，稱為 VHH 或是 nanobodies (Nbs)。這種小抗體要顧慮的地方比傳統 IgG 要少一些，例如不用考慮是否醣化(glycosylation)，加上也較容易生產製造，所以近來也引起關注，可望作為另一種型態的抗體藥。

相關文章：關於抗體和抗體藥的一些小知識

根據文中所述，他們自 2016 年起就用駱馬研發對抗 SARS 和 MARS 的小抗體。駱馬被先後打入 SARS 和 MERS 的 Spike protein 後體內會產上對抗 Spike protein 的抗體，他們在打入抗原的六週後取出駱馬的淋巴球，然後再用噬菌體展示(phage display)從中釣出可以和 Spike protein 結合的小抗體。他們從從駱馬淋巴球裡抓到七個 MERS 的小抗體和五個 SARS 的小抗體，得到了小抗體的基因序列後，便在酵母菌裡大量表現，然在再用 ELISA 確認它是否真的能夠和病毒結合。經過試驗發現其中一個 VHH 可以中和 SARS，為 VHH-72，並且和 MERS 的 S protein 沒有 cross-reactivity。

註 1：抗原(antigen)對免疫系統來講就是外來物，因此可以是病毒或細菌，免疫系統在外來物入侵後即會產生抗體(antibody)對抗外來物。

註 2：一隻駱馬可以被打入五種抗原，之後在用 phage display 把分別的小抗體釣出來，想更瞭解細節的可參考之前的《 Phage display 和小抗體製造 》這篇。

接著，他們想測試這些 VHH 是否可以抑制病毒，於是他們改造了基改過無害的 lentivirus VSV，讓它們在表面表現 S protein，假裝是 SARS，然後看看這些假 SARS 病毒是否能夠進入細胞，結果顯示和假 SARS 或假 MERS 結合力很強的 VHH 可以抑制病毒，結合力若的則沒有抑制的效果，其中以 VHH-72 的效果最好，9 nM 就可以達到抑制的效果。另外，VHH-72 雖然和 SARS S protein RBD 的結合力很強，但是 ELISA 的結果顯示它對 SARS S protein NTD (N-terminal domain) 沒有反應，表示 VHH-72 是透過和 RBD 結合來抑制病毒。

這個研究裡我比較訝異的是他們也分析了小抗體和病毒結合的 crystal structure，發現 VHH 抑制病毒的機制應該是把 Spike 的 RBD 固定在某個 conformation，使它不能動。VHH-72 是透過其 CDR2 和 CDR3 和病毒結合，但結合點和 ACE2 似乎不同，和 ACE2 競爭的不是 CDR2 或 CDR3，而是比較遠的 FR (framework region)。


Figure / The Crystal Structure of SARS VHH-72 Bound to the SARS-CoV-1 RBD (Wrapp et al, Cell 2020)

因為新冠病毒的 Spike protein 和 SARS 的很像，所以他們想知道 VHH-72 是否也可以抑制 SARS-CoV-2 的感染。他們發現 VHH-72 也會和新冠病毒的 S protein RBD 結合，但是 binding affinity 比較低。他們的 crystal structure 分析結果顯示 VHH-72 是和 SARS S RBD 的 R426 接合，而這個氨基酸在 SARS-CoV-2 則是 N439，這可能是造成 binding affinity 的原因。為了增強 binding affinity，他們試了兩種方法：一是用 (GGGS)3 linker 把兩個 VHH-72 尾接頭的連在一起(VHH-72-VHH-72)，一是在它後面接一個 IgG Fc (VHH-72-Fc)。ELISA 測試的結果顯示，這兩種都會會 SARS S 和 SARS-CoV-2 S 結合，並且細胞實驗顯示 VHH-72-Fc 可以抑制假 SARS 和假 SARS-CoV-2。

有意思的是 VHH-72 在病毒 S protein 的結合點似乎和之前發表過的抗體不同，倒是和 CR3022 類似，不過 CR3022 並無法抑制 SARS-CoV-2。

相關文章：近期和新冠病毒抗體相關的研究

哦，另外還有一個重要的點，就是這個小抗體可以在動物細胞裡大量表現，別以為這沒什麼，你如果遇過那種在三種細菌株裡都表現不出來，要不就表現出來但是不 soluble 的 VHH 就知道苦了。（現在每天都在和 phage display 還有 VHH 奮戰的苦主 QQ）

其實這篇研究的另一半是 MERS 和它的 VHH，有興趣的人可以看看。



Article:

UT NEWS / Antibodies from Llamas Could Help in Fight Against COVID-19 (Apr 2020)

TN / Llama Antibodies Could Help Fight Against COVID-19 (May 2020)


Paper:

Wrapp et al, Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-Domain Camelid Antibodies. Cell (2020)

舊藥新用(repurposing)：SARS-CoV-2

所謂的舊藥新用就是用已經通過 FDA 或是已經在市面上的藥去治療原本目標疾病以外的其他疾病，repurposing 的好處是因為已經通過臨床或是已經通過 FDA，所以省掉第一期臨床安全性試驗的金錢和時間，舊藥新用的例子包括原本用來治療攝護腺腫大(benign prostatic hyperplasia)的藥 Finasteride 被新用來治療禿頭。

Drug bank: Finasteride

相關文章：舊藥新用(repurposed drug) GCSF -- 治療中風

另外一個例子就是 Gilead 原本用來治療愛滋的 Remdesivir，其機制是抑制 RNA 病毒的 RdRP (RNA-dependent RNA polymerase)。之前在日本被用來治療慢性胰臟炎以及皮膚癌的 camostat mesylate (Foipan) 最近也被用來試驗在 COVID-19，因為它是 serine protease inhibitor，可以抑制幫助 SARS-CoV-2 進入細胞的 TMPRSS2。

NCATS: camostat mesilate

DrugBank: camostat mesilate

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這篇研究也是想從舊藥裡面找出可以治療 COVID-19 的藥物，他們在人類細胞裡面分別表現了 SARS-CoV-2 其中的 26 個蛋白，想找出和它們結合的人類蛋白，然後再從裡面找出是否已有針對這些蛋白的藥物。他們釣出來和新冠病毒蛋白有 interaction 的人類蛋白其實滿多樣的，他們稱之為 interactome，其中包括了參與 DNA replication, vesicle trafficking, innate immune pathways 和 ubiquitin ligase complex 等等的蛋白。經過分析，他們發現有 69 個藥物是針對這些蛋白，其中有 29 個已通過 FDA，12 個在臨床試驗中，28 個將進入臨床試驗，而這些藥物中，有些是有抗病毒功能的(anti-viral activity)。這些藥物大致分為兩種，一種是抑制蛋白生產的，包括 zotatfin 和 ternatin-4；另一種是 Sigma1/2 receptors 的 ligands，包括 PB28, haloperidol 和 hydroxychloroquine (奎寧)。目前在紐約其巴黎各有一個機構在測試他們找出來的其中 47 個 compounds 的效用，結果發現 PB28, zotatifin 和奎寧可以在病毒進入細胞後，降低病毒蛋白的表現，有趣的是 PB28 和 zotatifin 都比奎寧有效。

註：zotatifin 是 eIF4A inhibitor，而 eIF4A 主要功能在 mRNA translation。ternatin-4 則是 eEF1A inhibitor，也是作用在 mRNA translation。

抑制病毒的 translation 似乎有效，但要注意的是這篇研究目前還都是在細胞實驗，紐約的試驗機構是 Mt Sinai Hospital，但這篇裡面沒提到臨床試驗結果。



Publication:

DE Gordon et al, A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature (2020)

血清檢測｜受新冠病毒感染人口到底有多少？

最近這篇研究滿多人在傳的(not peer-reviewd)，就是美國加州在四月初檢測了約 3300 位透過臉書廣告徵來的 Santa Clara 的居民，發現每 66 位就有一位曾感染過 SARS-CoV-2，由此數據估算出兩百萬居民中大概有 48000 - 82000 位居民感染過病毒，比官方檢測出的一千位多了約 50 倍以上。（如果取中間值算，假設是 65,000 位居民已感染過，那就是大約 3.25% 的盛行率。）除此之外，德國在月初發表的血清檢測也顯示相似的結果，七人中有一人感染過新冠病毒，和 qPCR 交叉檢測的結果，估約整個城市的感染率為 15%，不過德國的病毒專家說，這麼高可能是因為二月的時候，城中有一個慶祝活動。

註：盛行率為 prevalence，為感染人口除以總人口數，分母不是檢驗人口。

雖說這個血清檢測的結果顯示很多人已感染過，相對來講也就是把致死率(infection fatality rate, IFR)的分母變大了，以 Santa Clara 的例子來說，這表示 48000 - 82000 中的死亡人數為約一百人，等於是 0.1% - 0.2%。不過，血清檢測要注意的是偽陽性(false positive)和偽陰性(false negative)的問題，如果不夠 specific，很可能很多是 false positive，也就是說其實感染人數並沒那麼多；如果不夠 sensitive，則有可能出現很多 false negative。

參與 Santa Clara 這個研究的學者說，他們同時也測試了這個 kit (Premier Biotech, Minnespolis, MN) 的 sensitivity 和 specificity，他們先檢測了已知的 85 個確診案例和 371 個陰性案例，結果顯示有兩個 false positives。他們另外也用在地居民做測試，檢測了已在 Stanford Hospital 用 qPCR 驗過的 37 陽性案例和 30 位陰性案例，交叉比對的果顯示只有 68% 的陽性案例被測到，所有陰性則為 true negative。兩者合併的估算下，這個 kit 的 sensitivity 大約是 80.3%，specificity 約為 99.5%。用調整過的 sensitivity 和 specificity 去估算的結果顯示 Santa Clara 的盛行率(seroprevalence)大約介於 2.49% - 4.16%，也就是說整個城市約有 48,000 - 81,000 已受過感染，是官方確診數的五十倍左右。



News:

Nature / Antibody tests suggest that coronavirus infections vastly exceed official counts (April 2020)


Paper:

E Bendavid et al, COVID-19 Antibody Seroprevalence in Santa Clara County, California. medRxiv (2020)

近期和新冠病毒抗體相關的研究

可能現在大家都知道 SARS 和 SARS-CoV-2 都是利用自身的 spike protein (S protein) 和人類細胞表面的 ACE2 結合而進入細胞的，因此阻斷 S protein 和 ACE2 的結合變成目前藥物研發的主要標靶，最近好幾篇研究都是關於用抗體去達到這個目的。

SARS-CoV-2 S protein 位於病毒的表面，是個醣化蛋白(glycoprotein)，會三個組成一體(trimer)。S protein 本身又大致分成三個 domains: N-terminal S1, S2 & C-terminal TM (transmembrane) domain，S1 和 S2 之間有個 furin cleavage site，S1 裡包含了 RBD (receptor-binding domain)，負責和 ACE2 結合，結合了之後 S1/S2 會被切開露出 S2，CoVs 的 S2 會進一步在 S2' site 再切割一次，這個切割會露出 S2 的 fusion peptide，可以讓病毒和細胞膜結合，使其進入細胞內。


Figure / Structure of 2019-nCoV S in the prefusion conformation (Wrapp et al, Science 2020)

Walls et al 發表在 Cell 的研究顯示 SARS-CoV-2 和 ACE 結合的 affinity 和 SARS 的差不多，他們也發現和 SARS不同的是 SARS-CoV-2 有個 furin cleavage site，SARS 的是一個 arginine (R)，SARS-CoV-2 則是 RRAR。SARS S protein 的 S1/S2 cleavage site 可以被細胞內蛋白酶 CatB/L (cathepsins B/L, cysteine protease) 和 TMPRESS2 (serine protease) 切割， 因此 Hoffmann et al 他們也測試了這兩個蛋白酶，看看他們是否也能切割 SARS-CoV-2 的 S protein，結果顯示除了 furin protease，SARS-CoV-2 也用 TMPRSS2，CatB/L 則是可有可無。另外，臨床使用的 serine protease inhibitor camostate mysylate，同時也是 TMPRSS2 inhibitor，也顯示可以抑制 SARS-CoV-2 進入細胞。如果和 CatB/L inhibitor E-64d 一起使用，則可以完全阻止病毒感染，在沒有 TMPRSS2 的情況下，SARS-CoV-2 也可以用 CatB/L。

Hoffmann et al 除了發現 SARS 和 SARS-CoV-2 都是透過 ACE2 進入細胞，而且帶有 ACE2 抗體的血清可以阻止這兩個病毒進入細胞外，也發現從 SARS 康復患者體內取出 anti-SARS 的抗體是 anti-S antibodies。他們取了三位 SARS 康復患者的血清測試，發現可以降低 SARS-CoV-2 感染，雖然效用比 SARS 較低。不過，他們把 SARS S1 打入兔子體內後產生的抗體可以有效抑制 SARS 和 SARS-CoV-2 感染細胞。另外，Walls et al 他們的結構研究顯示 SARS 和 SARS-CoV-2 的 S proteins 非常相似，SARS 的抗體很可能會和 SARS-CoV-2 有 cross-reactivity 而可以也抑制 SARS-CoV-2，於是他們把 SARS- S 打入老鼠體內，然後測試其產生的抗體是否能抑制 SARS-CoV-2，結果發現可以。由以上看來，對抗 SARS 的抗體或是疫苗可能對現在的 SARS-CoV-2 也多少有某種程度的效用。

不過，有趣的是之前 Cryo-EM 的那篇試了三個 SARS 的 anti-S RBD 的抗體(S230, m396, 80R)，想說竟然結構那麼像，不知道有沒有 cross-reactivity，沒想到那三個抗體都無法辨識 SARS-CoV-2。這個結果和 Walls et al 還有 Hoffmann et al 的不同的原因可能是因為這兩篇的研究產生的 polyclonal antibodies 可能抓到的是 S protein 的 S2 domain，而這篇用的是 anti-RBD (S1) antibodies。

相關文章：關於武漢病毒(SARS-CoV-2) Cryo-EM 那篇論文的閒聊

這個月，Scripps Research 的團隊在 Science 發表了 SARS 抗體和 SARS-CoV-2 結合的研究，他們發現 SARS 和新冠病毒和抗體的結合點幾乎一樣，也許是為什麼 SARS 抗體和 SARS-CoV-2 會有 cross-reactivity 的原因。他們研究的一個 SARS 的抗體 CR3022 是荷蘭的一家藥廠 Crucell Holland B.V. 於 2016 年從 SARS 康復患者體內釣出的，年初的時候有研究發現 CR3022 和新冠病毒有 cross-reactivity，於是 Scripps Dr. Wilson 的研究團段想知道這個抗體是怎麼和 SARS-CoV-2 結合的，結果發現這個抗體和 SARS 及 SARS-CoV-2 S protein RBD 結合的點非常相似。有趣的是病毒和 CR3022 的這個結合點和它和 ACE2 的結合點有些距離，因此不存在競爭的關係。另外，這個結合點在平常的狀態並不在病毒的表面，而是當 RBD 處於某種狀態下才會出現在表面的地方。在細胞實驗中，CR3022 雖然可中和 SARS，但卻無法中和 SARS-CoV-2。因為有太多迷點，所以目前還不了解和 CR3022 的這個結合點在病毒感染的真正功能是什麼，不過至少知道這個抗體是用不同的機制來抑制病毒感染。



Articles:

TN / Clues to SARS-CoV-2 Vulnerability Emerge (April 2020)


Publications:

AC Walls et al, Structure, Function, and Antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein. Cell (2020)

M Hoffmann et al, SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell (2020)

M Yuan et al, A highly conserved cryptic epitope in the receptor-binding domains of SARS-CoV-2 and SARS-CoV. Science (2020)

D Wrapp et al, Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science (2020)

BC CDC / UBC COVID-19 virtual symposium

上禮拜四的 BC CDC / UBC COVID-19 symposium，因為當天大爆滿，有的 speakers 甚至無法進到 Zoom，於是 UBC MedIT 就即時用了一個 live steam link，並且說這週會放到網上，剛剛收到 email 說已經放在 YouTube，有興趣的可以去看了。

Virtual BC COVID-19 Symposium



Introduction and Overview
Bonnie Henry, Provincial Health Officer
David Patrick, BCCDC; UBC
Robert McMaster, UBC

Diagnostics, Genomics and Transmission Dynamics
Natalie Prystajecky
Mel Krajden, BCCDC
Steve Jones, GSC
Peter Unrau, SFU

Clinical Trials and Patient Management
Josef Penninger, UBC
Srin Murthy, UBC
Jim Russell, UBC
Richard Lester, UBC

Epidemiology & Public Health Response
Danuta Skowronski, BCCDC
Manish Sadarangani, BCCH
Caroline Colijn SFU & Michael Otterstatter

Social Dynamics, Communications and Trust
Cynthia Jardine, University of The Fraser Valley
Yue Qian, UBC
Kelley Lee & Julia Smith, SFU
Emily Rempel, CDC

Development of Therapeutics and Vaccines
Bo Barnhart, AbCellera, Inc
Artem Cherkasov, UBC
Eric Jan, UBC
Francois Jean, UBC
Horacio Bach, UBC
Sriram Subramaniam, UBC
Wilf Jefferies, UBC
Leonard Foster, UBC
James Taylor, Precision NanoSystems
Lindsay Eltis, UBC

Final Discussions and Summary

下面是上禮拜聽的時候截圖的筆記



BC testing capacity. Genome BC is involved, too.



BC's sequencing equipment



BC COVID-19 WGS (whole Genome Sequencing) - mostly from Washington state and Europe



WHO's SOLIDARITY projects: clinical trials of the 4 focused treatments

Canada also participates: Canadian Arm of SOLIDARITY (CATCO)

Science / WHO launches global megatrial of the four most promising coronavirus treatments (March 2020)



ARBs (angiotensin II type 1 receptor blockers)

clinical trial: Coronavirus ACEi/ARB Investigation (CORONACION)



Causes of ACI and how SARS-CoV-2 is related to it.





UBC's APN01 works against ACE2

可參考：UBC 研發的藥物將進入臨床試驗 -- soluble hrsACE2



BC 和全加拿大的新冠病毒患者的年齡分佈



tracking COVID-19 by sero-prevalence survey

之前看到 UCSF 在做血清檢測，想說 BC 應該也要做一下，原來真的有計畫要做。

Science / Unprecedented nationwide blood studies seek to track U.S. coronavirus spread (April 2020)



患者體內免疫反應的研究，確診患者如果還在症狀出現後的十四天內，想為疫苗研發貢獻一份心力的，可和研究團隊聯絡，e-mail 如上。

相關文章：武漢肺炎輕症患者體內的免疫反應



BC 目前和計畫中的相關研究





Transmission & control modelling for decision making and public health response



BC 目前是最右邊那個



AbCellera antibody discovery - they use single cell sequencing



他們有和美國 NIH 和 Eli Lilly 合作。

AbCellera news press: AbCellera and Lilly to Co-develop Antibody Therapies for the Treatment of COVID-19

UBC 研發的藥物將進入臨床試驗 -- soluble hrsACE2

前兩天 Cell 刊登了之前 UBC 研發用來治療 COVID-19 的藥物 [1]，這個研究有多個團隊參與，包括了溫哥華的生技公司 STEMCELL Techonologies。他們研發的藥物 APN01 (human recombinant soluble angiotensin-converting enzyme 2; hrsACE2) 很快便會進入臨床試驗，由歐洲的生技公司 Apeiron Biologics 進行。


這個研究團段已經研究 SARS 很久了，在之前的研究中，知道了：

1. SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都是透過 spike protein 的 RBD (receptor-binding domain) 和人類的 ACE2 結合而進入細胞 [2]。
2. SARS-CoV-2 和 ACE2 的 affinity 比 SARS 強
3. 老鼠實驗中，大量表現 ACE2 的基轉老鼠在感染 SARS 後的病況比較嚴重 [2]。
4. ACE2 除了表現在肺部的表皮細胞，也表現在心臟、腎臟、血管和腸胃細胞，這可能是為什麼有些病患有腸胃道等等的症狀 [1]。
5. 之前的細胞實驗顯示 protease inhibitor camostat mesylate 可以抑制 SARS-CoV-2 的繁殖
6. hrsACE2 已在 2017 年時進入第一、二期的臨床試驗，原本是要用來治療 ARDS (acute respiratory distress syndrome, 急性呼吸窘迫症候群) [3]。


Figure / Possible intervention of SARS-CoV-2 replication (Science 2020, doi:10.1126/science.abb8497)

說是藥物，其實 hrsACE2 就是合成的人類 ACE2，他們的想法是既然 SARS-CoV-2 是透過 ACE2 進入細胞的，那他們就把大量的合成 ACE2 打入體內，使他們和病毒結合，當病毒表面的 RBD 都被合成的 ACE2 塞滿之後，就沒辦法再和細胞表面的 ACE2 結合了，進而達到抑制病毒感染的效果，跟抗體藥類似的概念。

在他們的細胞實驗中，hrsACE2 可以有效的中合病毒，使其無法接觸 ACE2 和進入細胞，但是老鼠的 mrsACE2 便沒有抑制的效果。然後他們試驗在基改的小血管和腎臟，受到 SARS-CoV-2 感染的基改器官在感染的三到六天後都可以檢測到病毒，而加惹 hrsACE2 後則明顯地降低了病毒感染；同樣的，老鼠的 mrsACE2 則沒有抑制 SARS-CoV-2 感染的效果。

要注意的是：
1. hrsACE2 跟其他的抗體一樣，無法完全抑制病毒感染，抑制效果和劑量相關，但也不排除有除了 ACE2 之外的 co-receptor 的可能。
2. hrsACE2 主要是抑制病毒進入細胞，如果病毒已進入細胞，hrsACE2 就沒有太大作用。
3. 這個實驗著重在血管和腎臟細胞，但 SARS-CoV-2 感染的主要器官是肺部。



Articles:

UBC News / Trial drug can significantly block early stages of COVID-19 in engineered human tissues

Science / WHO launches global megatrial of the four most promising coronavirus treatments (March 2020)


Publication:

1. V Monteil et al, Inhibition of SARS-CoV-2 infections in engineered human tissues using clinical-grade soluble human ACE2. Cell (2020)

2. K Kuba et al, A crucial role of angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) in SARS coronavirus-induced lung injury. Nature Medicine (2005)

3. Y Imai et al, Angiotensin-converting enzyme 2 protects from severe acute lung failure. Nature (2005)

武漢肺炎輕症患者體內的免疫反應

在上週發表的 Nature Medicine 裡有一篇是關於輕症患者體內的免疫反應，我相信台灣應該也有康復者的資料，只是不知道有沒有觀察其免疫反應。

這篇是個案，雖說每個人體質不太一樣，但應該也差不了多少，有些復原後的情形也和之前一些康復患者的報告結果一致。

這位個案是從武漢到澳洲墨爾本的 47 歲女士，抵達澳洲的一週後出現 lethargy, sore throat, dry cough, pleuritic chest pain, mild dyspnea, subjective fevers 這些這症狀，出現症狀四天後去墨爾本的急診。他沒去過那個海鮮市場，也沒接觸過已知患者。患者會加入研究是透過 Sentinel Travelers Research Preparedness Platform for Emerging Infectious Diseases novel coronavirus substudy (SETREP-ID-coV)。

患者健康狀況：沒抽煙、沒有服用藥物，身體算健康。

進醫院時的臨床診斷：
- 體溫為 38.5C
- 脈搏每分鐘 120 下
- 血壓 140/80 mm Hg
- 胸部聽診有 bi-basal rhonchi
- 沒有呼吸道併發症
- 沒有急性呼吸道衰竭症狀
- 出現症狀後第四天，RT-qPCR 有測到病毒，直到第六天都測到病毒，但第七天開始顯示為陰性，血液內 C-reactive protein 增加，免疫細胞數量正常。


Figure / 病患復原情況和病毒檢測結果，可以看到雖然咳嗽持續到第 11 天，但第七天開始檢測結果就都是陰性了，病毒量已經降低到測不到。(Thevarajan et al, Nature Medicine 2020)

治療方式：打點滴補充水份，沒給氧氣，沒給抗生素、類固醇或抗病毒藥物。

恢復狀況：症狀開始後第五天的胸部 X 光顯示有 bi-basal infiltrates (肺浸潤)，但是第十天時已經沒有肺浸潤的情況，於是第十一天便讓他回家自主管理，第十三天已完全康復，但還是在家待到第二十天，直到第二十天還是無恙。

體內免疫反應進程：

1. 出現症狀後第 7 到 20 天血液內和新冠病毒(SARS-CoV-2)有反應的 IgG 和 IgM 抗體大量增加。

2. ASCs (antibody-secreting cells)和 CD4+ T cells 於血液中病毒清乾淨後的第七天開始出現。ASCs在第八天達到高峰，CD4+ T cells 則在第八、九天持續增加。這兩個細胞在患者中的高峰期皆比健康個體高很多，而且直到第 20 天康復後都還存在患者體內。CD8+ T cells 也是從第一天開始快速增加直到第九天，但是在第 20 天開始下降。在得流感或施打流感疫苗後，這些免疫細胞也會大量增加。

3. Cytokines & chemokines：H7N9 重症患者體內會大量增加的 IL-6, IL-8, IL-10, MIP-1β 和 IFN-γ 在有症狀的第七到九之間都沒有顯著增加。


在看到輕症患者康復後肺部也會受損的臉書文後，看了這篇後感到心安一些。



原論文：I Thevarajan et al, Breadth of concomitant immune responses prior to patient recovery: a case report of non-severe COVID-19. Nature Medicine (2020)

新冠病毒(SARS-CoV-2)檢測 -- qPCR 和抗體檢測（續）

有看中研院那篇的就知道，目前檢測新冠病毒的方法有三：

1. qPCR：檢測體內是否有病毒 RNA，知道 primers 就可以用來檢測，不需要另外研發，相對準確，敏感度高(sensitivity)，但需四到六小時，包含運送檢體時間等等的 turnaround time 至少要一天。不過目前 UCSF, Mammoth 和加州 Public Health 部門合作研發的 SARS-CoV-2 DETECTR 利用 CRISPR 技術似乎可以快速檢測，加上 RNA extraction 的時間只要 45 分鐘。

2. 用抗體檢測體內抗原(也就是病毒)：跟 qPCR 比起來準確度較低(需要注意有沒有 cross-reactivity)，也需要時間研發，但是檢驗方法簡單，速度也快，turnaround time 約二十分鐘到一小時。（下圖的第三種 sandwich assay）

3. 用抗原(也就是病毒蛋白)檢測體內是否有抗體：研發時間沒上面那個長，比較簡單，檢驗方法也同樣簡單和快速，但需要等到症狀出現後，病患體內產生抗體才測得到，通常是用來追蹤是否曾經感染過。（下圖的第一種 direct assay 或第二種 indirect assay）

相關文章：新冠病毒(SARS-CoV-2)的檢測 -- qPCR 和抗體


Figure / Diagram of common ELISA formats (direct vs. sandwich assays)(Thermo Fisher)

註：抗體檢測的原理跟 ELISA 相同，可以固定抗原(antigen)去測體內抗體(antibody)，如上圖的第一種和第二種，這種只要有抗原就可以測，或是固定抗體去測體內是否有抗原，如上圖中的第三種，這種比較需要花時間先去研發出好的抗體。

相關文章：簡單檢測新冠病毒抗體

Nature 的這篇介紹了幾個正在研發的抗體檢測，第一個介紹的就是中研院楊老師的那個 LFIA！和大多數用 S (spike) protein 做抗原的抗體檢測不同的是中研院用的是 N (nucleocapsid) protein，其中一株抗體和 SARS 還有其他種冠狀病毒的 spike protein 沒有 cross-reactivity。不過看了這篇才知道，中研院的抗體是用 AI 去模擬 Ag-Ab interactions 後製造出來人造抗體 libraries，然後再用 phage display 去抓出抗體，而不是用動物去製造抗體，或是從康復患者體內釣出來，因此省掉了兩個月的時間。（也就是說中研院有抗體的基因序列，可以大量生產，也許可以測試是否能用於治療，不過我覺得 anti-spike 的抗體應該會比較有效果。）

相關文章：Phage display 和小抗體製造


Figure / Schematic representation of a LFIA device (Banerjee et al, Analyst 2018; doi: 10.1039/C8AN00307F)

抗體檢測大多用 LFIA (lateral flow immunoassay) 式的快篩，原理跟 ELISA 相同，只是長得像驗孕棒 XD。如上圖的 LFIA 所示，用的是 sandwich assay，也就是把抗體固定在檢測棒上面，然後先讓(可能含有病毒)的血液和帶有染劑的抗體混合，然後讓混合後的血液和抗體流過檢測棒，如果有血液含有抗原(也就是抗原)的話，就會被固定在檢測棒的抗體抓住。另一條 control line 是抓多餘的帶有染劑的抗體，也就是確認有足夠的抗體，並且有作用。因此如果血液中有病毒的話，就會有兩條線，沒有的話就會只出現 control line 那條線。

第二個介紹的是加拿大的公司 Sona Nanotech (Halifax-based)，他們是和 GE 合作研發的 LFIA，抗原用的是 spike protein 的 S1 domain，目前預估是六到八週內可以有供研究使用的產量。

如最之前說的，檢測體內是否有對抗病毒的抗體相對簡單，只要純化出抗原就可以下去測了，德國柏林的 Pharmact 已經有二十分鐘的抗體快篩檢測，用的抗原是 N protein 和 spike protein 的 S1 和 S2 domain，可以用來檢測患者體內是否有這兩個病毒蛋白的抗體，這個快篩可以檢測到 IgM 和 IgG，IgM 是人體受感染後最先產生的抗體，之後再產生 IgG。他們和 qPCR 結果做比較，結果顯示準確度很高 -- 100% true negative 和 0% false positive，不過缺點是敏感度低，因為一開始的 IgM 反應並不高，感染後的 4 - 10 天內測到的敏感度只有 70%，但是第 11 天到第 24 天可以測到 92.5%，IgG 在這幾天測到的比例也高達 98.6%，因此整體 false negative 比例約為 13%。

關於患者體內的免疫反應可參考：武漢肺炎輕症患者體內的免疫反應


其他相關文章：關於武漢病毒(SARS-CoV-2) Cryo-EM 那篇論文的閒聊



Article:

Nature / Fast, portable tests come online to curb coronavirus pandemic (March 2020)


Papers:

JP Broughton et al, Rapid Detection of 2019 Novel Coronavirus SARS-CoV-2 Using a CRISPR-based DETECTR Lateral Flow Assay. MedRxiv (2020)

R Banerjee & A Jaiswal, Recent advances in nanoparticle-based lateral flow immunoassay as a point-of-care diagnostic tool for infectious agents and diseases. Analyst (2018)

簡單檢測新冠病毒抗體

這篇研究提供了簡易的檢測方法，而且有詳細的 protocol，不過還沒有經過 peer-review (這篇之後在五月時刊在 Nature Medicine)，研究團隊是在紐約的 Icahn School of Medicine at Mount Sinai。總之非常簡單，有在純化蛋白和做 ELISA 的實驗室都可以做到，不需要 P3 實驗室，就差能不能自己抽血而已。（好想試 XD）

主要是純化抗原，然後用 ELISA 檢測人體內是否有新冠病毒的抗體，之前澳洲得那篇研究顯示在症狀開始後第七天，患者血液裡可以測到 IgM，這篇則是在症狀開始的第三天就可以檢測到抗體。（如果不懂抗體檢測的，可以去看中研院的那篇解釋。XD）

相關文章：武漢肺炎輕症患者體內的免疫反應

抗原：
1. Spike-thrombin-foldon-6xHis
2. SS-RBD-6xHis

- SARS-CoV-2 Spike protein (full-length): M1-P1213; GenBank MN908947.3
- RBD (receptor-binding domain): R319-F541
- SS: signal peptide (M1-S14)
- thrombin: thrombin cleavage site
- foldon: T4 foldon (trimer)

Expressing vectors:
1. mammalian: pCAGGS; Epi293F cells
2. baculovirus: pFastBacDual

Purification:
1. Ni-NTA (room temp)
2. Buffer exchange to PBS

Human serum samples:
1. 大概五十個血清庫裡的檢體，年齡範圍在 20 到 65 歲以上，應該都是健康個體，是用來檢測 ELISA 的背景訊號的，確認檢測的 specificity。
2. 三位康復患者的血清
3. 十二位新冠病毒急性患者的血清

患者血清檢體：
1. 新冠病毒患者症狀開始後第二、四、六和二十天
2. 新冠病毒患者康復後(同個體)：症狀開始後第三十天
3. 冠狀病毒 NL63 和 229E 的患者：NL63 也是用 ACE2
4. 其他傳染病患者康復後：包括登革熱患者

註：會引起疾病的人類冠狀病毒至少有七種，其中有四種是全球季節性的，未引起輕微的呼吸道疾病，包括有 HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 和 HCoV-229E，其中 NL63 和 229E 為 alphacoronavirus，另外兩個則是 betacoronavirus。會引起重症的 SARS 和 MERS，以及目前的 SARS-CoV-2 也是 betacoronavirus。

ELISA:
1. Coating: 2 ug/ml (in PBS), 50 ul/well, O/N at 4C
2. Blocking: 3% milk (PBS-T), 1h at room temp
3. Serum: diluted in 1% milk/PBS-T, 2 hrs at room temp
4. 2'Ab: goat-anti-human IgG HRP (1:3000, in PBS-T), 1 h at room temp


Figure / Reactivity of control and SARS-CoV-2 convalescent sera to different spike antigens (Amanat et al, medRxiv 2020)


結果：

1. 在 mammalian cells 裡的表現竟然比較好，mRBD (mammalian RBD) 可以達到 25-50 mg/L，mSpike (mammalian Spike) 也有 5 mg/L，RBD 的表現在 insect cells (iRBD) 則只有 1.5 mg/L，iSpike (insect Spike) 也只有 0.5 mg/L。

2. 在 insect cells 裡表現的 RBD 大小比在動物細胞裡較小，可能是因為在動物細胞裡表現的有被醣化，所以在蛋白膠上顯現的 band 會比較高。

3. 症狀出現後第三天就可以測到抗體

4. 所有新冠患者的血清都和 Spike 還有 RBD 有強烈反應，對 Spike 的反應比 RBD 強，其他傳染病患者的血清則沒反應。

5. 用 mRBD 和 mSpike 測出來的康復患者血清和健康個體血清的差距比較大，相較於 iRBD 和 iSpike，差距比較顯著。

6. 冠狀病毒 299E 和 NL63 患者的血清也對新冠病毒的 Spike 和 RBD 沒反應，表示沒有 cross-reactivity。

7. ELISA 的結果也可以分辨出其他傳染病患者和康復後的新冠患者。

8. 抗體 CR3022 對 mSpike 和 mRBD 有強烈反應。（關於 CR3022 可參考這篇：近期和新冠病毒抗體相關的研究）

9. 那五十幾個血清庫裡的血清對 mRBD 和 mSpike 沒反應，但是大多數卻對 229E 和 NL63 的 Spike protein 有強烈反應。

10. 有反應的抗體種類為 IgG3, IgM 和 IgA

11. 基於安全考量，他們也是惹 heat inactive serum，效果和沒有 heat-inactivated treated serum 差不多，一樣可以測到抗體，表示不需要 P3 實驗室就可以做。

12. 有不少新冠病毒康復患者的血清可以中和病毒，實驗結果顯示可以抑制病毒感染，這和 US CDC Okba et al 發表的結果是一致的。



Article:

Science / New blood tests for antibodies could show true scale of coronavirus pandemic (March 2020)


Papers:

F Amanat et al, A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine (2020)

F Amanat et al, A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in human. medRxiv (2020)

Okba et al, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2−Specific Antibody Responses in Coronavirus Disease 2019 Patients. US CDC Emerging Infectious Diseases (2020)

新冠病毒(SARS-CoV-2)的檢測 -- qPCR 和抗體

目前的檢測都是以用 qPCR 檢測病患體內是否有武漢病毒的 RNA，這個方法的問題是耗時耗力，尤其是 RNA extraction 相對來講比 DNA 困難不少，是個瓶頸。另外，復原的患者裡沒有病毒後就測不到 RNA，只能針對目前正被感染的患者，而非康復後的患者，如果患者康復了，那感染的源頭或是中介者就斷了。

目前用 qPCR 檢測的目標基因是 N gene, E gene 和 RdRp gene，它們轉譯後的蛋白為 nucleoprotein (N protein), envelope protein (E protein) 和 RdRp (RNA-dependent RNA polymerase)。

關於這個病毒的 background info 請參考這篇：關於武漢病毒(SARS-CoV-2) Cryo-EM 那篇論文的閒聊


Figure / SARS genome (ViralZone 2020)

之前 BC CDC (BC 省疾管局)內部的 seminar 裡有提到他們檢測的流程為先用 qPCR 檢測是否有 RdRP 和 E gene (~24hrs)，再檢測是否有 N gene (2hrs)，然後送定序 RdRP (8-16 hrs)，都顯示 positive 後最後送 National Microbiology Lab (NML) 確認(24-48hrs)。後來我在 CDC 工作的朋友說，現在已經不用送 NML，BC CDC 檢測為陽性就直接公佈了，所以 24 小時內就可以知道結果。(註：NML 為加拿大唯一的 P4 Lab，位於 Winnipeg, Manitoba。)


Figure / The 2019-nCoV Novel Coronavirus – what we know and what we’re finding out (BC CDC)

除了檢測病患的病毒 RNA，另一個方法就是測體內的抗體，感染病患在免疫系統正常的情況下，身體會製造對抗病毒的抗體，因此即使患者復原了，也可以透過檢測體內的抗體得知其是否曾經感染過病毒，例如浙江台商，另外用抗體檢測也比較省時省力。

新加坡大學 NUS 和美國 Duke University 合作抗體檢測，並在這週二發表了他們的成果。新加坡在一月時發生了兩起教會的群聚感染，一月 29 號的時候有位年輕男士感到身體不適，但找不到感源。另一個教會則是在一月 19 號的時候有位來自武漢的訪者，後來往回追接觸史的時候發現，年輕男士在一月 25 號的農曆年慶祝活動裡，同時參加活動的一對夫妻曾經接觸過那位武漢訪者。那對夫妻在一月 25 的時候出現症狀而去醫院，但因為症狀輕微並沒被診斷為武漢肺炎。發現了年輕男士和這對夫妻的連結後，這對夫妻在二月 18 號送去 CDC 檢測，不過那時那對夫妻已經康復了，檢測人員認為可能測不到病毒的 RNA，於是除了用 qPCR 檢測外，同時也做了抗體測試。沒想到，先生的 RNA 檢測為陽性，於是隔天被送醫隔離，而太太的檢測則是陰性，不過數日後的抗體檢測結果顯示夫妻兩人皆為陽性，表示兩人體內皆有武漢病毒的抗體，太太也曾經感染過病毒。

他們從康復患者的血液檢體裡發現到辨識病毒 S 蛋白(spike protein)的抗體，而這些抗體在實驗室中顯示可以阻止病毒殺死細胞。同時，他們合成的病毒蛋白也可以被患者血裡的抗體偵測到。不過，用抗體檢測需要注意它的 specificity，因為武漢病毒和 SARS 的蛋白很像，可能會出現 cross-reactivity 的問題(也就是抗體同時可以檢測到 SARS 和武漢病毒的蛋白)，所以必須要確定檢測的抗體只會辨識武漢病毒的蛋白，而新加坡和杜克大學研發的抗體測試可以分辨兩個病毒的蛋白，也就是只會對武漢病毒的蛋白有反應。

看到這裡可能會覺得很熟悉，沒錯，中研院之前也公佈過他們可以在浙江台商的血裡測到武漢病毒的蛋白，不過他們測的是 N 蛋白(nucleoprotein)。


【 名字改來改去，武漢病毒到底叫什麼？】

病毒和其引起的疾病命名方式分為三個等級：(ICTV - Naming the 2019 Coronavirus)

1. 疾病名(disease name)：由 WHO 病名，例如這次的武漢肺炎被 WHO 命名為 COVID-19 (Coronavirus Disease 2019)

2. 病毒名(virus)：由病毒學家命名，例如這次的武漢病毒是由 ICTV 裡的冠狀病毒學家命名為 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)。

3. 病毒分類(species)：由 ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses) 將病毒分類，跟動物的界門綱目科屬種一樣，病毒也由大至小分成 family (名字尾巴是 -dae), subfamily (名字尾巴是 -nae), genus (名字尾巴是 -virus) 和 species (可能前面加個宿主名，例如 canine, porcine 等等的，或是後面加個 type 1, type 2 之類的)，另如這次的冠狀病毒就是 Coronaviridae (family) - Orthocoronavirinae (subfamily) -Betacoronavirus (genus) - Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus (species)。

ICTV 發表的命名武漢病毒的 papers：

AE Gorbalenya et al, Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: The species and its viruses – a statement of the Coronavirus Study Group. bioRxiv (2020)

Coronaviridae Study Group of the ICTV, The species Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2. Nature Microbiology (2020)


Article:

Science / Singapore claims first use of antibody test to track coronavirus infections (Feb 2020)

舊藥新用(repurposed drug) GCSF -- 治療中風

原本用來治療 neutropenia (白血球低落症) 的藥物 GCSF (granulocyte colony-stimulating factor) 最近被發現可以用來治療缺血性中風(ischemic stroke)。GCSF 是一種造血生長激素(hematopoietic growth factor)，負責調節 neutrophils (其中一種白血球)的生產，使它們能順利功從骨髓釋出進到血液裡，目前用於治療化療後造成的白血球下降，還有用在需要做骨髓移植的病患，幫助血球增生。

缺氧性中風是因為血管阻塞使得血液無法把氧氣和葡萄糖送到腦部，造成腦細胞死亡(infraction)，由於之前有研究顯示 GCSF 另有抗細胞凋亡(apoptosis)和促進血管增生(angiogenic)的功能，所以這篇研究的作者認為 GCSF 可能也可以用在治療因為缺血造成的中風。

關於缺血性中風可參考這篇：關於中風的小常識

他們利用血管阻塞手術(carotid artery occlusion, BCAO)製造出中風的狀況，然後在手術半個小時後幫老鼠皮下注射 GCSF，之後每天都給 GCSF，連給四到七天，然後在第四天和第七天的時候檢測老鼠大腦裡的幾個 apoptotic 和 neuroprotective biomarkers，結果發現有注射 GCSF 的老鼠其 ER stress biomarkers (e.g., ATF6, IRE1, PERK, GRP78) 和 apoptotic biomarkers (e.g., Bcl2, Bak) 的表現量下降，而且缺血所造成的 infraction 跟沒注射的相比少很多（沒注射 GCSF 的大腦幾乎整個都是白色的 infraction），行動也和控制組沒有顯著差異。



Article:

NNR / Repurposed Drug Proves Neuroprotective in Stroke Model (Jan 2020)


原論文：J Modi et al, Mode of action of granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) as a novel therapy for stroke in a mouse model. J Biomedical Science (2020)