拉格啤酒是怎麼開始流行的？

大家喜歡喝啤酒嗎？喜歡喝哪種呢？知道啤酒的來源嗎？

啤酒大致分成兩種，拉格(Larger)和艾爾(Ale)，而拉格啤酒佔所有啤酒銷售量的 90％。

兩者不同的地方不只在發酵過程，他們用的酵母菌株也不一樣。艾爾啤酒用的是大部分人所熟知的啤酒酵母 S. cerevisiae，做酵母菌實驗的人應該都用過這株酵母，但拉格啤酒用的酵母菌株的來源則是個謎。



根據對歷史釀酒記錄和酵母菌的基因史的綜合分析，用於釀造大多數現代拉格啤酒的酵母是於 1602 年至 1615 年間，在最初的慕尼黑皇家啤酒廠(Munich Hofbräuhaus)的地窖中，混合白啤酒和棕色啤酒的酵母漿時產生的。

十七世紀的釀酒師雖然不知道酵母的存在，但他們發現這種新的混合物很受歡迎，它像淺色啤酒一樣發酵強勁，但像深色啤酒一樣能耐受較低的溫度。在小冰河時期，也就是公元 1300 年至 1850 年左右，該地區的溫度急遽下降，而這株酵母菌耐低溫的特性意味著人們可以在北半球的春天早期釀造出乾淨口感的拉格啤酒，

利用基因分析找出拉格啤酒的祖先

關於拉格啤酒酵母菌的起源，主要的線索是來自 2016 年時，研究人員分析了 120 種拉格啤酒和愛爾啤酒酵母菌的基因，想整理出它的族譜，最後發現這株用來釀拉格啤酒的 S. pastorianus 是釀小麥啤酒(wheat ales)的酵母菌 S. cerevisiae 和釀棕色啤酒的酵母菌 S. eubayanus 的混種。2019 年時，VIB–KU Leuven Center for Microbiology 的微生物遺傳學家 Kevin Verstrepen 和他的同事分析後表示，這株混種酵母菌大約起源於 16 世紀中葉，可能來自巴伐利亞，因為它的 DNA 中來自於酵母菌 S. cerevisiae 的片段最接近巴伐利亞的那些菌株。

受到這些結果的啟發，慕尼黑工業大學(Technical University of Munich)釀酒微生物學家馬 Mathias Hutzler、已故生物化學家 Franz Meußdoerffer 和釀酒科學家 Martin Zarnkow 翻遍了酒廠的歷史記錄和德語古籍，甚至還在巴伐利亞各地的酒廠地窖中搜尋古老的酵母樣品，想找出兩種酵母菌混合的可能地點。

最後，他們拼湊出了這株混種酵母的歷史。

拉格啤酒的起源

大概 13,000 千年以前，Levant (現今敘利亞雅那區)就有釀酒的紀錄，這應該是啤酒的起源。

中世紀(Middle Ages, 476 A.D - 1400~1450)

雖然那時候沒有現代科學，但已經知道發酵需要用酵母菌。這時也已知酵母會沈澱在發酵桶底部，但在某些特殊情況下，上層發酵的 S. cerevisiae 也會沈澱。

上層發酵是歐洲最初用來釀啤酒的方法，包括波希米亞地區(布拉格)，而下層發酵則是在十四世紀的時候才開始普遍，主要在 Franconia (巴伐利亞北部) 和 Upper Palatinate (巴伐利亞東部)，這些地區是上下層酵母菌混在一起用，因此溫度成為關鍵，釀造者可以取上層或下層的酵母菌作為下次釀酒的種子。

上層發酵(bottom-fermented)是指在發酵過程中，酵母菌會浮到麥汁表面，使啤酒上層有一層蓬松的泡沫；而下層發酵(bottom-fermented)是指發酵得比較平靜，並沉積在容器的底部。

十二、十三世紀（西元 1100 - 1200）

十二、十三世紀左右，專業釀酒技術開始出現於中北歐，大家對酵母菌和啤酒發酵才產生興趣。這時候啤酒主要是用大麥和啤酒花釀造的，之後的釀酒技術產生了一種新的啤酒，需要較長的發酵和較低的溫度，產生的新啤酒種類為拉格啤酒(mixed yeast cultures, pre-S. pastorianus modern lager yeast time)。而這個最原始的拉格啤酒不久便取代了舊啤酒，因為它較穩定，所以適合運送。新啤酒分成兩種：Märzen 是在春夏之前的三月釀造，overseas 則是穩定和適合外銷的啤酒。

十三到十七世紀（西元 1200 - 1600）

十三世紀到十七世紀時，由於氣候較冷，較適合釀下層發酵啤酒。

十四世紀的時候，大麥取代燕麥為釀啤酒的原料。

十五、十六世紀的時候，由於各種原因，中歐開始大喝啤酒，也因此在地的啤酒廠開始興盛起來，每個啤酒廠根據配方(大麥、小麥和燕麥的比例)、技術和酵母菌的不同都有自己獨特的風味。

1516 年的時候，由於巴伐利亞啤酒純淨法(Beer Purity Law of 1516)規定在寒冷的春季時，釀酒廠只能用大麥(barley)和啤酒花(hops)去釀下層發酵啤酒，這樣在食物短缺時還有小麥可以用來做麵包，因此下層發酵成為巴伐利亞主要的釀造法。當時只有只有兩個下巴伐利亞的貴族家族保留釀造白啤酒(Weißbier)的權利，而這間啤酒屋是 17 世紀初唯一被允許釀造大量上層發酵的白愛爾啤酒的釀酒廠。

十七世紀以後（西元 1600~）

1602 年的時候，巴伐利亞公爵 Maximilian 從波希米亞貴族家庭那裡奪取了小麥白啤酒的釀造權，然後把這株酵母和帶到了慕尼黑皇家啤酒廠(Munich Hofbräuhaus)，並找了來自 Einbeck 的白啤酒釀酒大師 Elias Pichler，在這裡 S. pastorianus 和 S. eubayanus 這兩株酵母菌結合了，這時候 S. eubayanus 已被用於下層發酵啤酒。1602 年到 1607 年，來自巴伐利亞的 Schwarzach 市和 Lower Saxony 的 Einbeck 市的釀酒師都跑到慕尼黑慕尼黑皇家啤酒屋，這家釀酒廠本來白啤酒和棕色啤酒都釀，五年後白啤酒的釀造轉移到 Platzl 的新的釀酒廠 Weißes Hofbräuhaus，後來 1808 年的時候，原本的皇家啤酒廠被併到 Weißes Hofbräuhaus。

1883 年的時候，Carlsberg Research Laboratory 的真菌學家 Emil Christian Hansen 純化出這種混合酵母，並以法國化學家 Louis Pasteur 的名字命名為 Saccharomyces pastorianus。Hansen 純化的菌株帶起了啤酒革命，因為釀酒師可以因此固定釀出同樣高品質的拉格啤酒。在此之前，野生的酵母菌株有時會污染麥汁，導致啤酒病(beer sickness)和胃腸不適。純化過後的 S. pastorianus 迅速取代了之前的酵母菌株，目前大部分的拉格啤酒都是用此菌株釀造。


Apple Podcast: 拉格啤酒的由來


Articles:

Science | Modern lager arose when a beer and an ale met in a Munich brewhouse (April 2023)


Publications:

M Hutzler, JP Morrissey, A Laus, F Meussdoerffer & M Zarnkow. A new hypothesis for the origin of the lager yeast Saccharomyces pastorianus. FEMS Yeast Research (2023) DOI: 10.1093/femsyr/foad023

用酵母菌釀造大麻

繼三年前有人發表了如何用酵母菌釀造嗎啡後，這個月 UC Bekeley 的研究團隊發表了他們用酵母菌釀造大麻的成果在 Nature。記得那時候才還在臉書上開玩笑說，應該要研究如何用酵母菌釀造大麻的，想來會很有錢途，沒想到真有人做惹。

舊文：用酵母菌釀造嗎啡

看了整篇研究後，覺得基改酵母讓它生產大麻比生產嗎啡簡單啊，主要是 CBD (cannabidiol) 和 THC (Δ9-tetrahydrocannabinol) 的產生過程還滿直接的，不像嗎啡中的中介物 S-reticuline 很難產出，另外就是這篇研究是用 Cas9 來改造酵母菌基因，應該也比原本的用 shuttle vector 去改要容易點。


Figure / Pathway of CBD and THC biosynthesis (modified from X Luo et al, Nature 2019)

上面是大麻的 THC 和 CBD 生產的主要路徑，這兩個物質大家應該滿熟悉的吧？THC 是讓人嗨的，CBD 則是有鎮靜止痛的效果。大麻裡面除了這兩個物質外，還有 CBN (cannabinol), CBG (cannabigerol) 和 CBC (cannabichromene)。

上面幾個途徑的各個反應如下：（後面 highlight 的部分是所需酵素）

1. Sugar (galactose) acetyl-CoA --> malonyl-CoA
2. Sugar (galactose) --> acetyl-CoA --> hexanoyl-CoA (hexanoly-CoA pathway)
3. Hexanoic acid --> hexanoyl-CoA [CsAAE1]
4. Hexanoyl-CoA + 3x malonyl-CoA --> olivetolic acid (OA) [CsTKS, CsOAC]
5. OA --> cannabigerolic acid (CBGA) [CsPT4]
6. CBGA --> THCA (Δ9-tetrahydrocannabinolic acid), CBDA (cannabidiolic acid) [THCAS, CBDAS]

Pathway #2 他們稱為 hexanoyl-CoA pathway，從 acetyl-CoA 轉化成 hexanoyl-CoA 的過程需要的酵素為：RebktB, CnpaaH1, Cacrt, Tdter

可以看出 CBGA 在裡面扮演重要的 intermediate，它除了是 THC 和 CBD 的 precursor 之外，也是 CBG 和 CBC 的，加入 CBCAS 之後就可以轉化成 CBCA，而以上這幾個酸性物質加熱後就會變成中性有活性的 CBG, THC, CBD 和 CBC。

CBGA --> CBG
THCA --> THC
CBDA --> CBD
CBCA --> CBC

以上這些物質，在大麻裡面是以酸性的形式存在，直到人們點煙或加熱的時候，才會轉化成 THC 或 CBD，這個過程也就是 decarboxylation。CBG 不具有讓人嗨的效果，近來被認為可以抗發炎，但是它在大麻裡面的量比較少，因為大多很快就被轉化成 THCA 和 CBDA。另外，THC 曝露在 UV light 和氧氣之下會慢慢變成 CBN，它跟 THC 同樣會讓人嗨，但是效果比較弱。

另外，雖然整個製造過程看起來滿簡單的，但是研究了一下發現，破酵母細胞萃取 THC 或 CBD 的這個步驟的成本滿高的，因為酵母菌的細胞壁(cell wall)很難破，這篇研究裡用的是 zymolase，而且用量是 2U/OD。這篇研究裡 THC 的產量是 8 mg/L，但是根據我的經驗酵母菌在搖了兩天後的 OD600 就可以超過 10，一公升的話 OD 就是 10,000，也就是說要用 20,000U 的酵素。這個酵素我查到的價錢是 2000U 要價加幣 $150，也就是說每 8 mg 就要花掉至少 CAD$1500，嘖嘖嘖~ 當然也有較便宜的破細胞方法，像是用 glass beads 或是 french press 這些用 mechanical force 的去破細胞。所以啊，成本還是要算仔細呢。XD



News articles:

UC Berkeley / Yeast produce low-cost, high-quality cannabinoids (2019)

Nature / Scientists brew cannabis using hacked beer yeast (2019)

Harvard Health Publishing / Cannabidiol (CBD) — what we know and what we don’t (2018)


Publications:

X Luo et al, Complete biosynthesis of cannabinoids and their unnatural analogues in yeast. Nature (2019)

S Deiana, Chapter 99 - Potential Medical Uses of Cannabigerol: A Brief Overview. Handbook of Cannabis and Related Pathologies (2017)

用酵母釀造嗎啡

今天在《Science》和《Nature》上各有一篇文章評論用基因改造的方式讓酵母菌能夠生產嗎啡 [1, 2]，會有這兩篇評論是因為今年初有兩篇分別發表在 PLOS ONE 和 Nature Chemical Biology 的論文說這個構想已更進一步克服過去技術上的困難，使其有實現的可能 [3, 4]。海洛因(heroin)、嗎啡(morphine)和其他鴉片類(opiates)藥物的原料都是罌粟花(opium poppy, 學名 Papaver somniferum)，全世界大概有一千六百萬人非法用此類藥物，而單是在美國，2010-2012 年間就有一萬六千人死於用藥過量 [1]，因此 MIT 的生技政策專家 Kenneth Oye 擔心基改過的酵母會被毒販濫用，而在 Nature 上發表了一篇文章，提出幾個管制的方法 [2]。


Photo: 溫哥華市區的社區巷道中，人行道旁種的一排罌粟花。

鴉片是屬於化合物 benzylisoquinoline alkaloids (BIAs) 的一種，此類化合物已知的有 2500 種，其中包括嗎啡和 thebaine（為止痛藥 oxycodone 和 hydrocodone 的前導物）之外，還有解痙攣(antispasmodic)、抗生素和抗癌藥物等等。BIAs 的結構複雜很難合成，而且成本也很高，因此醫藥學家一直以來想找出能夠便宜又簡單的製造方法，或是製造出不會上癮和其他副作用的藥物種類，但這並不是件容易的事，因為植物本身生長週期就慢，不過「把 BIA 製成路徑轉進微生物中的話，就能大大減少研發藥物的成本，因為我們可以操作酵母菌的基因，然後快速得到試驗結果。」發表在 Nature Chemical Biology 的作者，目前也是加州柏克萊大學的博士生 William DeLoache 說道 [1, 4]。

這個技術其實之前已經成功用來製造抗瘧疾藥物(antimalarial) artemisinin，但用在製造管制麻醉藥上則是第一回，用酵母菌生產嗎啡的研究從 2009 年時就已經開始，研究主持人為加拿大 Concordia University 的微生物學家 Vincent Martin，也是發表在 PLOS ONE 那邊論文的通訊作者 [1, 3]。跟抗瘧疾藥 artemisinin 製成需要五個反應的過程比起來，嗎啡複雜得多，要到十五個化學反應，研究學者們通常分成兩個部分，第一個部分是把胺基酸 tyrosine 轉換成 S-reticuline（下圖 a），從這裡開始則是第二部分的關鍵分歧點，S-reticuline 可以轉換成嗎啡或 codeine，或是轉換成抗生素或抗癌藥物（下圖 b），如果要轉換成嗎啡，S-reticuline 則需先轉換成 R-reticuline，之後再轉換成 thebaine，最後變成嗎啡 [1, 3]。


圖：在罌粟花中(a)和基改酵母菌中(b) reticuline 產生過程發生的化學反應。(Fossati et al, PLOS ONE 2015)

去年，美國加州史丹福大學的研究主持人 Christina Smolke 發表說他們給酵母菌需要的酵素，使其能完成第二部分的最後步驟：把 thebaine 轉換成嗎啡。而上個月，Martin 則在 PLOS ONE 上發表說他們已改造好酵母菌的基因，使其能完成所有第二部分的反應，把 R-reticuline 轉換成嗎啡。不過至此，第一部分的困難還未克服，把葡萄糖轉(glucose)換成 tyrosine 很簡單，因為天然酵母菌本身就會做此轉換，但是把 tyrsoine 轉換成 S-reticuline 並不容易。2011 年的時候，有日本團隊表示他們能夠在大腸桿菌 E. coli 中完成第一部分，但在酵母菌中轉換的效果不是很好，最大的瓶頸是把 tyrosine 轉換成 L-Dopa [1]。不過呢，柏克萊大學的生物工程學家 John Dueber 和 DeLoache 在做另一個研究計畫時，意外發現有個叫 DOPA dioxygenase 的酵素能把 L-Dopa 轉呈黃色的色素，會讓酵母菌變成黃黃的，於是他們就想到用 DOPA dioxygenase 來找能夠把 tyrosine 轉換成 L-Dopa 的酵素 [1, 4]。接著，他們便和 Martin 的團隊合作，發現甜菜(sugar beets)的一個叫 tyrosine hydroxylase 的酵素能在酵母菌裡把 tyrosine 轉換成 L-Dopa，他們也做了不同的突變種，然後用 DOPA dioxygenase 來測試看哪個突變種的效果最好，能夠產生最多的 L-Dopa [1]。


圖：基因改造過，擁有 DOPA dioxygenase 基因的酵母，產生 L-DOPA 後會把酵母菌染成黃色。(DeLaoche et al, Nature Chemical Biology 2015)

到此為止，待解的化學反應只剩第一部分和第二部分的銜接點，把 S-reticuline 轉換成 L-reticuline 的步驟（下圖），不過這個似乎也成功在即，加拿大卡加利大學 Univ of Calgary 的博士生 Beaudoin 在他的畢業論文摘要中表示，他們發現了一種植物酵素能在酵母菌中把 S-reticuline 轉換成 L-reticuline，如果真的可行的話，研究學者們就能把所有需要的酵素轉進酵母菌當中，測試它是否能完成所有的化學反應，也就是把最初的葡萄糖轉換成最終產物 -- 嗎啡。研究者之一的 Dueber 說，他認為這在未來的兩到三年中可以完成。[1, 5]


圖：基改酵母菌中從葡萄糖(glucose)轉換成嗎啡的過程。(Nature Comment 2015)

基改過的酵母菌可以被人輕易拿來使用，因為酵母菌很好養也容易操作，如果酵母菌能生產十克(10g)的嗎啡，則使用者只要喝 1-2ml 發酵出來的液體便會達到處方籤的標準劑量。要想取代現有的生產系統，用酵母菌生產嗎啡的技術需能夠有效降低成本，目前大量配種繁殖的罌粟花品種，使嗎啡價格在 2001-2007 年之間的降低了 20%，為一公斤美金 $300-500 。目前嗎啡的非法販售管道有二，一是醫師處方的止痛劑（像是 oxycodone 或 hydrocodone）被盜，或是由病人合法取得，但非法賣出；二則是在某些國家，例如阿富汗、緬甸、寮國和墨西哥等國非法種植和製成海洛因，然後由犯罪集團賣出。酵母產出的技術可能因為酵母菌容易隱藏、生長和運送，而使得在北美和歐洲這些需求量高的國家，嗎啡被濫用的情況增高 [2]。因此，在這項研究成果有望之際，Dueber 和 Martin 在一年前便找上 Oye 尋求他的意見，如何使這個研究結果在幫助醫療之餘，不至於被非法濫用。Oye 在《Nature》上給了幾點建議，第一是給基改酵母加入 marker，讓它在實驗室之外的設備難以被培養，例如需要某個特定的養分（nutrient selection marker），或是加入特別的 marker 用以追蹤。二是管制來要基因序列的人，雖然說這種非法販毒集團應該不會這麼搞剛還要序列自己基改。再來是管制培養基改酵母菌的場所，最後則是立法管理 [2]。

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本魯覺得這真是個聰明的技術，因為光是那十五個化學反應就讓人覺得製造嗎啡是個麻煩的過程，如果全部交給酵母菌來做，我們只要負責讓它長的話，那真的超輕鬆容易的阿，因為酵母菌不難養，而且培養的成本也不高，此法值得拿來用在製造其他難合成又高成本的藥物上阿。

這個研究的最後階段如果成功的話，對於大量生產來用在醫療上應該是大有助益，不過因為它的方便性，要是不小心流出實驗室外，被濫用的可能性也非常高，這也是目前所憂慮的地方。是說反過來想，要是基改酵母真的流出去，培養和製造門檻又低，其實需要的人可以自己養酵母就好了，根本不需要跟販毒集團買阿，這樣販毒集團還有搞頭嗎？因為人人都可自己養酵母，而且只要拿到一點點就可以養出一堆酵母，根本沒賺頭阿，是吧？

PS. 話說可以合法販賣藥用大麻後，溫哥華的大麻店真是如雨後春筍般冒出來阿，方圓五公里內可以有五、六家，溫哥華人有這麼需要大麻嗎？然後，看到這則新聞後，覺得本魯應該要來研究用酵母菌製造大麻，不但可以省水省電省土地，還可以賺 $$，有人要投資嗎？科科~~ XD


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References

1. RF Service. Researchers closer to engineering yeast that make morphine, spurring worries. Science News Insider (2015)

2. KA Oye, JCH Lawson & T Bubela. Drugs: Regulate 'home-brew' opiates. Nature Comment (2015)

3. E Fossati et al. Synthesis of Morphinan Alkaloids in Saccharomyces cerevisiae. PLOS ONE (2015)

4. WC DeLoache et al. An enzyme-coupled biosensor enables (S)-reticuline production in yeast from glucose. Nature Chemical Biology (2015)

5. GAW Beaudoin. Characterization of Oxidative Enzymes Involved in the Biosynthesis of Benzylisoquinoline Alkaloids in Opium Poppy (Papaver somniferum). PhD Thesis, University of Calgary (2015), unpublished.