是否可在哺乳動群中產生 gene-drive？

利用 CRISPR 造成 gene-drive 消滅散播病菌的蚊蟲，可行嗎？如果大家還有印象的話，之前有人提出利用 gene-drive 去消滅散播瘧疾的蚊蟲，但這個做法有爭議，因為這牽扯到整個物種的基因改變，是否會對生態造成影響還不知道。

三年前，UCSD 的 Gantz 和 Bier 先是研發了一個叫做 mutagenic chain reaction (MCR) 的技術，利用細胞本身的 HDR (homology-directed repair) 功能，可以有效的把生物基因體裡的一對基因都突變(homozygous mutations)，使在兩個染色體上的此基因失能。這個技術主要是在一對基因的其中一個中插入了一個 Cas9-gRNA cassette 使其失能外，之後利用細胞本身的 HDR 把另一個基因也切斷並插入 Cas9-gRNA cassette，造成 homozygous mutation，使那一對基因整個失能(loss-of-function)。那要怎麼知道這個方法是否能夠有效的產生 homozygous mutation？假設果蠅本身的某對隱性基因中有一個帶有突變，也就是所謂的 heterozygous mutation，那這個突變並不會表現在外觀上(phenotype)，但透過這個技術，可以有效地使果蠅轉換成一對基因的兩個都帶有突變，使這個突變表現在外觀上。並且，當這個帶有 Cas9-gRNA 的果蠅和野生果蠅交配後，產生的後代也會有 50% 的機會帶有 Cas9-gRNA cassette，使其出現 loss-of-function 的突變，隨之產生 gene-drive 的情況。

照理來說，這個技術應該可以應用在任何生物身上，不只有果蠅。於是，UCSD 的另一個團隊想在老鼠中嘗試 gene-drive，這樣就可以大量生產研究用的基改老鼠。他們讓母鼠帶有 Cas9，讓公鼠帶有 gRNA (guide RNA)，交配後的後代小鼠就會帶有 Cas9 和 gRNA，並且會在不同的染色體上，因為從爸爸來的那個會帶有 gRNA，從媽媽來的則帶有 Cas9。不過這個實驗沒果蠅那麼成功，主要是在公鼠的部分，可能是因為精子會在進行 meiosis (減數分裂) 前現進行普通的 mitosis，而這時期 Cas9 造成的切口會用 NHEJ (non-homologous end joining) 來修復，而不是 HDR。另外就是 Cas8 和 gRNA 是在不同的染色體上，所以如果和野生鼠交配，就會缺少其中一個元素而無法進行突變。


Figure / S Khan et al, J Biomedical Science 2018 (doi: 10.1186/s12929-018-0425-5)


Articles:

Science / ‘Gene drive’ passes first test in mammals, speeding up inheritance in mice (July 2019)


Papers:

VM Gantz & E Bier, The mutagenic chain reaction: A method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science (2015)

HA Grunwald et al, Super-Mendelian inheritance mediated by CRISPR/Cas9 in the female mouse germline. bioRxiv (2019)

果蠅的萬聖節基因

雖然萬聖節已經過去快兩個月了，不過我這兩天才把這篇拿來看一下，看了才知道有 Halloween genes，他們是果蠅的一組控制胚胎生長的基因，包括有：

Gene	Gene Name	Function
spo	pook, Cyp307a1	converts 7-dehydrocholesterol (7dC) to Δ4-diketol
spok	spookier, Cyp207a2	works with gene product of spo
phm	phantom, Cyp306a1, exo	microsomal 25-hydroxylase, converts 2,22,25dE-ketodiol to 2,22dE-ketotriol (2,22dE)
dib	disembodied, Cyp302a1	converts 2,22,dE-ketotriol to 2-deoxyecdysone (2dE)
sad	shadow, Cyp315a1	converts 2-deoxyecdysone to ecdysone (E)
shd	shade, Cyp314a1	converts ecdysone to 20-hydroxyecdysone (20E)

酵素參與順序和功能如下圖。


(Figure: JT Warren et al, PNAS 2002)

這些基因屬於 cytochrome P450 superfamily (CYPs)，參與用膽固醇(cholesterol)製造蛻皮激素(ecdysteroid)的過程，這個過程最後的產品是 20E，是主要的 molting hormone。如果這些基因有突變，會造成生長過程中 exoskeleton 出現問題，胚胎會在 exoskeleton 成長完之前就死掉了，除此之外，在顯微鏡下，突變的幼蟲外皮因為沒有分化完成，外觀符合人們對萬聖節的想像而因此得名，發現這些基因的幾位也因此得了 1995 年的諾貝爾獎。

"no differentiation of cuticle and head skeleton” (disembodied), “only head skeleton visible” (haunted), and “mouth parts and denticles poorly differentiated” (mummy)



Article:

J Cohen, A gory tale behind the origin of ‘Halloween genes’. Science Magazine (2016)


Papers:

C Nüsslein-Volhard & E Wieschaus, Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila. Nature (1980)

JT Warren et al, Molecular and biochemical characterization of two P450 enzymes in the ecdysteroidogenic pathway of Drosophilamelanogaster. PNAS (2002)

LI Gilbert, Halloween genes encode P450 enzymes that mediate steroid hormone biosynthesis in Drosophila melanogaster. Molecular & Cellular Endocrinology (2004)


Other references:

FlyBase: HALLOWEEN GENES