新冠病毒感染者體內 T 細胞的免疫反應

人類體內對抗病菌的免疫機制除了透過抗體外，還有各種免疫細胞，雖然目前關於新冠病毒的研究大多著重在抗體，但免疫 T cells 也扮演著清除病毒的重要角色。康復者到底會不會免於二次感染呢？這可能和感染後產生多少抗體、抗體維持多久，和免疫細胞反應的強度有關，感染後要能產生有效的免疫反應，才表示疫苗的研發是有意義的。最近有篇研究是關於 T cells，發現有些未受 SARS-CoV-2 感染者的體內有對抗此病毒的 T cells，很可能是因為之前感染過其他冠狀病毒產生的。

關於免疫系統裡 T cells 和 B cells 的功能，我很喜歡下面這張圖，覺得畫得很清楚。B cells 是製造抗體的，T cells 是殺死受感染的細胞，但他們兩個都要先從 APC (antigen presenting cells) 那裡取得病毒的資料，才能製造出可以辨識病毒的抗體，或是受到感染的細胞。（就像你想讓狗去找嫌疑犯，要先讓牠聞一下嫌疑犯身上的味道，然後再讓牠去搜尋一樣。）


Figure / Development of immunity (Nature News 2020; doi: 10.1038/d41586-020-01221-y)

La Jolla Institute 的研究團隊想知道病毒的哪個部分可以引發強烈的 T 細胞反應，因為這個病毒蛋白的片段可能可以用來做疫苗。他們先預測了一些可能會引起強烈 T 細胞反應的病毒蛋白片段(peptides)，其中一組是 spike protein 的片段，另一組是除了 spike proteins 之外所有 SARS-CoV-2 蛋白的片段，每個約十個氨基酸長，然後把這些片段測試在 20 位新冠病毒康復患者的血清上。這二十位康復患者都算是輕症的，有症狀但是不需要住院，血清是在症狀出現後 20 - 35 天後，完全沒症狀後採集的，有先用 ELISA 檢測過，確定他們的血清內有抗 Spike protein RBD 的抗體。他們發現所有的康復患者都有可以辨識新冠病毒 Spike protein 的 helper (CD4+) T cells，helper T cells 反應的程度和 anti-Spike IgG 量正向相關，七成的患者有針對新冠病毒的 killer (CD8+) T cells，而且 T cells 的反應非常強烈。目前很多人對患者是否對新冠病毒有免疫力有疑慮，認為病毒不見得會引起免疫反應，加上有報導說有患者再次感染，不過這個研究顯示，大多數的患者的免疫系統是對新冠病毒有反應的。

註：helper T cells 負責幫助 B cells 產生抗體，和抗體 IgG 和 IgA 量有關；killer T cells (又稱 cytotoxic T cells, CTLs) 負責清除病毒。

除此之外，這些血清內也有可以辨識新冠病毒其他蛋白的 T cells，包括 M protein 和 N protein。所有患者的血清都有針對非 Spike protein 的 helper T cells，比例上大概是 50% 的 T cells 是針對 Spike protein，50% 是針對 Spike protein 以外的病毒蛋白。

由以上結果看，我們也許不用對疫苗研發太過悲觀，新冠病毒是可以引起免疫反應的，接下來要知道的是這個免疫反應是否能使人體對病毒產生保護作用，如果可以的話，研發出成功的疫苗是有希望的。

不過，這篇研究裡的患者是有症狀的，那無症狀患者是否也有可以辨識新冠病毒的 T cells，並能產生強烈的免疫反應呢？這篇研究裡沒有檢測無症狀患者的 T cells responses，但是檢測了未受感染者的 T cell responses。

他們檢測了於 2015-2018 年採樣到、沒有感染過新冠病毒的血液檢體，結果發現其中有 40% - 60% 含有可以辨識新冠病毒的 helper T cells，不過和康復患者不同的是他們的 T cells 反應雖然也是以 Spike 為主，但幾乎沒有對 N protein 或 M protein 有反應的 T cells，次主要的是 NSPs (non-structural proteins)。而之所以會有這些 T cells，可能是因為這些人之前感染過其他種類的冠狀病毒，cross-reactivity 使他們體內也有能辨識新冠病毒的 T cells。研究者們認為這是之前感染其他四種引起感冒症狀的冠狀病毒時產生的，因為這些血液檢體裡都有針對至少其中三種常見冠狀病毒的 T cells，血清檢測也顯示全部都有 HCoV-OC43 和 HCoV-NL43 Spike protein 的 IgG 抗體，表示大多數人都感染過常見的四種感冒冠狀病毒，而且至少感染過超過三種，而這也可能是為什麼大部分的人感染到新冠病毒後都只是輕症或無症狀。

註：四種常見的冠狀病毒為 HCoV-OC43, HCoV-HKU1, HCoV-NL63 和 HCoV-229E ，前兩者為 betacoronaviruses，後兩者為 alphacoronaviruses。

相關文章：感染過冠狀病毒是否就免疫了呢？

另外，上個月有篇發表在 medRxiv 也有類似的結果，他們除了從新冠病毒康復病患的體內發現有能夠辨認 Spike protein 的 helper T cells，也從沒感染過的個體裡發現可以辨識 SARS-CoV-2 的 helper T cells。



Articles:

Science / T cells found in COVID-19 patients ‘bode well’ for long-term immunity (May 2020)

TN / Analysis of SARS-CoV-2 Immune Response Bodes Well for Vaccine Development (May 2020)


Papers:

A Grifoni et al, Targets of T cell responses to SARS-CoV-2 coronavirus in humans with COVID-19 disease and unexposed individuals. Cell (2020)

J Braun et al, Presence of SARS-CoV-2 reactive T cells in COVID-19 patients and healthy donors. medRxiv (2020)

感染過冠狀病毒是否就免疫了呢？

目前市面上有很多血清檢測的 kits，而我們最想用血清檢測回答的問題有：

1. 康復患者血清內的抗體量是多少？
2. 多少才有保護作用，使人不被二次感染？（這也算是疫苗效用的一個指標，如果抗體無法避免二次感染，那疫苗 .....？）
3. 無症狀患者、輕症患者和重症患者體內的抗體量是都一樣的嗎？是否所有感染者都能產生大量的抗體，使其不被二次感染？還是重症患者的抗體比較多？
4. 體內抗體能維持多久，有效避免二次感染的抗體量會維持多久？

上個月刊在 medRxiv 的這篇研[1]究分析了目前關於冠狀病毒的相關研究，想要試著回答上面的問題，但因為新冠病毒是這幾個月的事，所以 SARS, MERS 和其他造成感冒的冠狀病毒的研究比較多。

註：常見的、會引起感冒症狀的人類冠狀病毒有 229E (alphacoronavirus), NL63 (alphacoronavirus), OC43 (betacoronavirus), HKU1 (betacoronavirus)。

1. 造成感冒的冠狀病毒，例如 229E，康復患者體內的抗體大概可以維持一年使人不被二次感染，或是再次感染的症狀也是很輕微。

2. SARS 康復患者體內的抗體在感染後第四個月達到高峰，而且則能維持到三年左右，使其不被二次感染。（不過研究裡檢測的最後時間點是感染後第三年，所以只知道至少三年，之後就不知道了。）

3. MERS 輕症換者可在症狀發生後的半年和一年的時間點測到 IgG，重症患者的時間點也差不多。

4. 其中一篇研究[2]裡是測試冠狀病毒 229E 的康復患者是否會二次感染。當時參與研究的志願者中，只有 11% 體內沒有抗體，顯示在當時的年代(1961-1977)，這株冠狀病毒非常普及。當一年後再讓這些志願者感染這株病毒，看看抗體是否還有保護作用，發現抗體對同株的病毒有保護作用，但對相近病毒(也就是同樣是 alphacoronavirus，但是不同病毒株)只有部分的保護作用。後來有篇研究[3]顯示，如果體內抗體量不夠的話，229E 的康復患者可被二次感染。參與此研究的志願者在感染病毒一週後，IgG 開始上升，然後在十四天時達到高峰，一年後再測的時候抗體量仍然比感染前高，當再一次接受感染挑戰的時候，雖然約有一半的人被二次感染，但都沒有症狀。另外，第一次感染的時候，在前五到六天都測得到病毒，而二次感染時，只有前兩天測得到病毒，顯示病毒被清掉的很快。（不知道這是不是這次有很多無症狀患者的原因，如果血清檢測可以順便檢驗其他的 betacoronaviruses 的話可能可以知道。）

5. 有些冠狀病毒抗體有 cross-reactivity，像是 229E 的抗體可以使患者約一年不被同種的冠狀感染，例如同是 alphacoronavirus 的 NL63。


Figure / Quantitative and binary readouts in serology assays. (Krammer & Simon, Science 2020)

雖說目前有很多血清抗體檢測，但是要知道新冠病毒的康復患者是否能夠避免二次感染，需要可以測量體內抗體量的檢測，而這需要做 ELISA，比較耗時也比較耗人力，需要在實驗室執行。LFA 之類的快篩只能知道有或沒有，而且需要夠高的 sensitivity 和 specificity，才不會有太多的 false positive 或 false negative，主要是用來了解病毒感染的盛行率(sero-pervalence)。



Article:

Science / Serology assays to manage COVID-19 (May 2020)


References:

1. AT Huang et al, A systematic review of antibody mediated immunity to coronaviruses: antibody kinetics, correlates of protection, and association of antibody responses with severity of disease. medRxiv (2020)

2. SE Reed, The behaviour of recent isolates of human respiratory coronavirus in vitro and in volunteers: evidence of heterogeneity among 229E-related strains. J Med Virology (1984)

3. KA Callow et al, The time course of the immune response to experimental coronavirus infection of man. Epidemiology & Infection (1990)

從駱馬體內得到的新冠病毒小抗體

哎呀呀，已經有人做了啊。這篇的研究團隊是之前做 Spike protein Cyro-EM 的那個，原來他們也有做駱馬(llama)的小抗體研究啊。

相關文章：關於武漢病毒(SARS-CoV-2) Cryo-EM 那篇論文的閒聊

如果有看過我之前關於小抗體那篇的，就知道駱馬和鯊魚除了有普通的 IgG 之外，還有一種只有 heavy chain 的小抗體 HCAbs (heavy chain antibodies)，如果只取它的 Fv (variable region)，體積會更小，稱為 VHH 或是 nanobodies (Nbs)。這種小抗體要顧慮的地方比傳統 IgG 要少一些，例如不用考慮是否醣化(glycosylation)，加上也較容易生產製造，所以近來也引起關注，可望作為另一種型態的抗體藥。

相關文章：關於抗體和抗體藥的一些小知識

根據文中所述，他們自 2016 年起就用駱馬研發對抗 SARS 和 MARS 的小抗體。駱馬被先後打入 SARS 和 MERS 的 Spike protein 後體內會產上對抗 Spike protein 的抗體，他們在打入抗原的六週後取出駱馬的淋巴球，然後再用噬菌體展示(phage display)從中釣出可以和 Spike protein 結合的小抗體。他們從從駱馬淋巴球裡抓到七個 MERS 的小抗體和五個 SARS 的小抗體，得到了小抗體的基因序列後，便在酵母菌裡大量表現，然在再用 ELISA 確認它是否真的能夠和病毒結合。經過試驗發現其中一個 VHH 可以中和 SARS，為 VHH-72，並且和 MERS 的 S protein 沒有 cross-reactivity。

註 1：抗原(antigen)對免疫系統來講就是外來物，因此可以是病毒或細菌，免疫系統在外來物入侵後即會產生抗體(antibody)對抗外來物。

註 2：一隻駱馬可以被打入五種抗原，之後在用 phage display 把分別的小抗體釣出來，想更瞭解細節的可參考之前的《 Phage display 和小抗體製造 》這篇。

接著，他們想測試這些 VHH 是否可以抑制病毒，於是他們改造了基改過無害的 lentivirus VSV，讓它們在表面表現 S protein，假裝是 SARS，然後看看這些假 SARS 病毒是否能夠進入細胞，結果顯示和假 SARS 或假 MERS 結合力很強的 VHH 可以抑制病毒，結合力若的則沒有抑制的效果，其中以 VHH-72 的效果最好，9 nM 就可以達到抑制的效果。另外，VHH-72 雖然和 SARS S protein RBD 的結合力很強，但是 ELISA 的結果顯示它對 SARS S protein NTD (N-terminal domain) 沒有反應，表示 VHH-72 是透過和 RBD 結合來抑制病毒。

這個研究裡我比較訝異的是他們也分析了小抗體和病毒結合的 crystal structure，發現 VHH 抑制病毒的機制應該是把 Spike 的 RBD 固定在某個 conformation，使它不能動。VHH-72 是透過其 CDR2 和 CDR3 和病毒結合，但結合點和 ACE2 似乎不同，和 ACE2 競爭的不是 CDR2 或 CDR3，而是比較遠的 FR (framework region)。


Figure / The Crystal Structure of SARS VHH-72 Bound to the SARS-CoV-1 RBD (Wrapp et al, Cell 2020)

因為新冠病毒的 Spike protein 和 SARS 的很像，所以他們想知道 VHH-72 是否也可以抑制 SARS-CoV-2 的感染。他們發現 VHH-72 也會和新冠病毒的 S protein RBD 結合，但是 binding affinity 比較低。他們的 crystal structure 分析結果顯示 VHH-72 是和 SARS S RBD 的 R426 接合，而這個氨基酸在 SARS-CoV-2 則是 N439，這可能是造成 binding affinity 的原因。為了增強 binding affinity，他們試了兩種方法：一是用 (GGGS)3 linker 把兩個 VHH-72 尾接頭的連在一起(VHH-72-VHH-72)，一是在它後面接一個 IgG Fc (VHH-72-Fc)。ELISA 測試的結果顯示，這兩種都會會 SARS S 和 SARS-CoV-2 S 結合，並且細胞實驗顯示 VHH-72-Fc 可以抑制假 SARS 和假 SARS-CoV-2。

有意思的是 VHH-72 在病毒 S protein 的結合點似乎和之前發表過的抗體不同，倒是和 CR3022 類似，不過 CR3022 並無法抑制 SARS-CoV-2。

相關文章：近期和新冠病毒抗體相關的研究

哦，另外還有一個重要的點，就是這個小抗體可以在動物細胞裡大量表現，別以為這沒什麼，你如果遇過那種在三種細菌株裡都表現不出來，要不就表現出來但是不 soluble 的 VHH 就知道苦了。（現在每天都在和 phage display 還有 VHH 奮戰的苦主 QQ）

其實這篇研究的另一半是 MERS 和它的 VHH，有興趣的人可以看看。



Article:

UT NEWS / Antibodies from Llamas Could Help in Fight Against COVID-19 (Apr 2020)

TN / Llama Antibodies Could Help Fight Against COVID-19 (May 2020)


Paper:

Wrapp et al, Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-Domain Camelid Antibodies. Cell (2020)

舊藥新用(repurposing)：SARS-CoV-2

所謂的舊藥新用就是用已經通過 FDA 或是已經在市面上的藥去治療原本目標疾病以外的其他疾病，repurposing 的好處是因為已經通過臨床或是已經通過 FDA，所以省掉第一期臨床安全性試驗的金錢和時間，舊藥新用的例子包括原本用來治療攝護腺腫大(benign prostatic hyperplasia)的藥 Finasteride 被新用來治療禿頭。

Drug bank: Finasteride

相關文章：舊藥新用(repurposed drug) GCSF -- 治療中風

另外一個例子就是 Gilead 原本用來治療愛滋的 Remdesivir，其機制是抑制 RNA 病毒的 RdRP (RNA-dependent RNA polymerase)。之前在日本被用來治療慢性胰臟炎以及皮膚癌的 camostat mesylate (Foipan) 最近也被用來試驗在 COVID-19，因為它是 serine protease inhibitor，可以抑制幫助 SARS-CoV-2 進入細胞的 TMPRSS2。

NCATS: camostat mesilate

DrugBank: camostat mesilate

相關文章：近期和新冠病毒抗體相關的研究

這篇研究也是想從舊藥裡面找出可以治療 COVID-19 的藥物，他們在人類細胞裡面分別表現了 SARS-CoV-2 其中的 26 個蛋白，想找出和它們結合的人類蛋白，然後再從裡面找出是否已有針對這些蛋白的藥物。他們釣出來和新冠病毒蛋白有 interaction 的人類蛋白其實滿多樣的，他們稱之為 interactome，其中包括了參與 DNA replication, vesicle trafficking, innate immune pathways 和 ubiquitin ligase complex 等等的蛋白。經過分析，他們發現有 69 個藥物是針對這些蛋白，其中有 29 個已通過 FDA，12 個在臨床試驗中，28 個將進入臨床試驗，而這些藥物中，有些是有抗病毒功能的(anti-viral activity)。這些藥物大致分為兩種，一種是抑制蛋白生產的，包括 zotatfin 和 ternatin-4；另一種是 Sigma1/2 receptors 的 ligands，包括 PB28, haloperidol 和 hydroxychloroquine (奎寧)。目前在紐約其巴黎各有一個機構在測試他們找出來的其中 47 個 compounds 的效用，結果發現 PB28, zotatifin 和奎寧可以在病毒進入細胞後，降低病毒蛋白的表現，有趣的是 PB28 和 zotatifin 都比奎寧有效。

註：zotatifin 是 eIF4A inhibitor，而 eIF4A 主要功能在 mRNA translation。ternatin-4 則是 eEF1A inhibitor，也是作用在 mRNA translation。

抑制病毒的 translation 似乎有效，但要注意的是這篇研究目前還都是在細胞實驗，紐約的試驗機構是 Mt Sinai Hospital，但這篇裡面沒提到臨床試驗結果。



Publication:

DE Gordon et al, A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature (2020)

血清檢測｜受新冠病毒感染人口到底有多少？

最近這篇研究滿多人在傳的(not peer-reviewd)，就是美國加州在四月初檢測了約 3300 位透過臉書廣告徵來的 Santa Clara 的居民，發現每 66 位就有一位曾感染過 SARS-CoV-2，由此數據估算出兩百萬居民中大概有 48000 - 82000 位居民感染過病毒，比官方檢測出的一千位多了約 50 倍以上。（如果取中間值算，假設是 65,000 位居民已感染過，那就是大約 3.25% 的盛行率。）除此之外，德國在月初發表的血清檢測也顯示相似的結果，七人中有一人感染過新冠病毒，和 qPCR 交叉檢測的結果，估約整個城市的感染率為 15%，不過德國的病毒專家說，這麼高可能是因為二月的時候，城中有一個慶祝活動。

註：盛行率為 prevalence，為感染人口除以總人口數，分母不是檢驗人口。

雖說這個血清檢測的結果顯示很多人已感染過，相對來講也就是把致死率(infection fatality rate, IFR)的分母變大了，以 Santa Clara 的例子來說，這表示 48000 - 82000 中的死亡人數為約一百人，等於是 0.1% - 0.2%。不過，血清檢測要注意的是偽陽性(false positive)和偽陰性(false negative)的問題，如果不夠 specific，很可能很多是 false positive，也就是說其實感染人數並沒那麼多；如果不夠 sensitive，則有可能出現很多 false negative。

參與 Santa Clara 這個研究的學者說，他們同時也測試了這個 kit (Premier Biotech, Minnespolis, MN) 的 sensitivity 和 specificity，他們先檢測了已知的 85 個確診案例和 371 個陰性案例，結果顯示有兩個 false positives。他們另外也用在地居民做測試，檢測了已在 Stanford Hospital 用 qPCR 驗過的 37 陽性案例和 30 位陰性案例，交叉比對的果顯示只有 68% 的陽性案例被測到，所有陰性則為 true negative。兩者合併的估算下，這個 kit 的 sensitivity 大約是 80.3%，specificity 約為 99.5%。用調整過的 sensitivity 和 specificity 去估算的結果顯示 Santa Clara 的盛行率(seroprevalence)大約介於 2.49% - 4.16%，也就是說整個城市約有 48,000 - 81,000 已受過感染，是官方確診數的五十倍左右。



News:

Nature / Antibody tests suggest that coronavirus infections vastly exceed official counts (April 2020)


Paper:

E Bendavid et al, COVID-19 Antibody Seroprevalence in Santa Clara County, California. medRxiv (2020)