肥胖會降低免疫細胞殺死癌細胞的能力

最近這篇研究，讓人稍微了解了一下肥胖和癌症的關係。這篇研究顯示肥胖會使脂肪會堆積在自然殺手細胞(natural killer cells, NK cells)，影響它們的代謝、基因表現和功能，使它們無法正常運作。

自然殺手細胞是一種免疫細胞，除了消滅外來的敵人外，它的其中一個攻擊目標是腫瘤細胞，因此可以限制癌細胞的擴散。自然殺手細胞殺死目標物的方法是分泌一種 lytic granules，這種 granules 裡面有醣蛋白 perforin 和酵素 granzymes (顆粒酶)，但是這個對抗機制需要消耗大量的能量，因此它們需要可以生產 ATP 的 glycolysis。

這篇研究發現肥胖會啟動 PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor; PPAR)，使脂肪堆積在 NK cells，導致它的代謝機制無法運轉，因此無法生產 ATP 去對抗癌細胞。

PPAR 是位於細胞核內的賀爾蒙接受器(nuclear receptor)，同時也是轉錄因子(transcription factor)，調控各種相關基因的表現，包括有脂肪的運送和代謝、肝醣生產等等，因此大量表現在肝臟和心臟等脂肪代謝率高的器官和脂肪組織裡。PPAR 像是一個脂肪探測器，它的配位基(ligand)包括自由脂肪酸(fatty acid)和其衍生物(derivatives)，free fatty acid (FFA) 會啟動 PPAR 和它的 signaling pathway，於是細胞接收到訊息後會開始處理細胞內的脂肪。


Figure: KEGG, Kanehisa Laboratories

在這篇研究裡，老鼠們被餵食高脂肪的食物(high-fat diet, HFD)，然後作者們檢視 NK cells 裡有哪些基因的表現量出現改變。沒想到在八週的高脂肪飲食過後，約有三千個基因的表現量和被餵食正常飲食(standard-fat diet, SFD)的老鼠不一樣，有些控制脂肪代謝的基因表現量升高了，主要多是和 PPAR 相關的，而和 cytotoxicity 還有 mTOR 相關的基因表現則下降了，例如受 mTOR 調節的 granzymes。這些變動顯示肥胖會使 NK cells 轉換它的運作，把它禦敵的功能轉換成以代謝脂肪為主。

接著他們比較了肥胖老鼠和瘦老鼠體內 NK cells 的循環狀態，發現肥胖老鼠體內的 NK cells 循環比較慢，而且它們殺死的腫瘤細胞比較少。除此之外，他們也發現肥胖老鼠的 NK cells 裡面有脂肪球堆積，而細胞內用來殺死目標細胞的 perforin granules 卻減少了。他們也用人類的 NK cells 做測試，在培養液中加入 FFA，NK cells 會從培養液中吸收 FFA 進細胞內，他們發現細胞內越多脂肪球堆積的，perforin granules 就越少，有的甚至沒有，而脂肪堆積也讓 NK cells 喪失殺死癌細胞的能力。另外，因為 granzyme 的表現量是受 mTOR 調控的，mTOR pathway 被啟動後會使 NK cells 開始運作 glycolysis 生產能量，所以他們也檢視惹 mTOR pathway 和 NK cells 間的關係。他們發現當 mTOR pathway 被抑制時，NK cells 的殺敵能力大為下降，而在肥胖的情況下，mTOR 是失能的。他們在培養液裡加了脂肪酸後，NK cells 無法啟動 glycolysis 和 OXPHOS，也因此製造出的 ATP 也少很多。在老鼠試驗中，肥胖老鼠的 NK cells 的代謝率和 glycolysis 效率都比正常飲食的老鼠低很多。



以上結果皆顯示，當周遭環境有很多自由脂肪酸的時候（也就是肥胖），NK cells 會把它的禦敵機能(cytotoxicity, mTOR pathway)和生產能量(glycolysis, OXPHOS)的機制轉換到代謝脂肪(lipid metabolism, PPAR pathway)，因而導致它的免疫殺敵的功能下降，殺死癌細胞的效能也降低了。

既然如此，那啟動 PPAR 會抑制 mTOR 的功能嗎？作者們在培養液裡加惹 FFA 和 PPARα/δ agonists 去啟動 PPAR，結果從瘦子體內取得的 NK cells 開始吸收脂肪，glycolysis 效率降低，而且 perforin 和 granzyme B 的表現量也大為下降；但是當含有 FFA 的培養液裡加入惹 PPARα/δ antagonists 之後，脂肪便不再堆積在 NK cells 的細胞內，而且也沒有 perforin 表現降低的現象。除此之外，他們也找尋到底是在哪個地方降低惹 NK cells 的御敵能力，他們發現當 PPAR 被脂肪酸啟動或是 mTOR 被抑制的時候，NK cells 可以找到癌細胞，但無法釋出 lytic granules 去消滅癌細胞，而且也會抑制 NK cells 的繁殖。

這篇研究的結果看起來是在 NK cells 裡，用來生產能量對抗癌細胞的 glycolysis 和代謝脂肪的 PPAR 只能擇其一，作者最後有提到說有研究顯示用 rapamycin 去抑制 glycolysis，使癌細胞沒有養份增生，但是這篇研究顯示如果抑制 glycolysis 的話也會使 NK cells 無法生產能量殺死癌細胞，因此使用 rapamycin 可能也不是個好方法。


不負責任結論：最好的方法就是不要過胖讓體內有過多的脂肪去抑制 NK cells 的功能。XD



Article:

TN / ‘Fat-clogged’ Immune Cells Fail to Fight Tumors


Papers:

X Michelet et al, Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses. Nature Immunology (2018)

D Fanale et al, The Interplay between Metabolism, PPAR Signaling Pathway, and Cancer. PPAR Research (2017)

M Pawlak et al, Molecular mechanism of PPARα action and its impact on lipid metabolism, inflammation and fibrosis in non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatology (2015)

LR de Armas & ER Podack, Chapter Sixteen - Natural killer cytolytic activity. Basic Science & Clinical App (2010)

實驗法｜研究蛋白質功能

不知道大家在研究某個蛋白質的時候都是從哪方面著手呢？除了它的 subcellular localization 之外，我通常都是從 protein-protein interactions 著手，如果已經知道是和哪個蛋白質 interact，就會看它是用哪個 domain 和其他蛋白質 interact。

最常用(?)的方法大概是把它切成幾個片段，然後用這些片段去做 co-IP，看哪個片段和其他蛋白質 interact。那要如何決定要怎麼切蛋白質呢？通常我是把氨基酸序列丟到 PROSITE 去看它有哪些 functional domain，如果已經有其他人發表關於這個蛋白質的研究的話，可以先看一下其他人怎麼切的，如果還沒有其他人做，那就丟進 PROSITE 去看看。不過呢，PROSITE 能做的就是看它的 secondary structure。

上個禮拜學到另一個方法，就是看蛋白質的 tertiary structure，找出和它類似結構的蛋白質。這個方法可以用在純化某個蛋白質的時候，你找不到關於純化這個蛋白質的論文，丟進 PROSITE 後只顯示出它是屬於某個 superfamily，但是沒有特別的 domain，這時候可以丟進 Phyre2 去找有類似結構的蛋白質，它會找出在 Protein Data Bank (PDB) 裡結構和你要找的蛋白相似的蛋白質，當然不可能是整個蛋白質的結構都和你要的相同，可能只是某個片段，他會告訴你那些片段和你要找的蛋白質的相似度是多少，然後你再自己判斷你要以哪個蛋白質結構為依據來研究你的蛋白質。

不知道這樣解釋夠不夠清楚，目前手邊沒有可以做示範的蛋白質，如果有人有想要研究的蛋白質的話，可以留言一下，我再示範出來。



也歡迎大家分享自己的研究方法唷~ 😄



其他有用的網站：

European Bioinformatics Institute: 我常用的是它的 Clustal Omega
ExPASy Bioinformatics Resources Portal: 我常用的是它的 ProtParam
UniProt: 可以找到蛋白的結構資訊
Protein Secondary Structure: 各種線上資源的連結
NCBI COBALT: multiple alignment for protein sequences
Cold Spring Harbor (CSH) Protocols: 免費的各種 protocols
CSH Recipes: 各種 buffers 的配方
SnapGene Viewer: 用來看 DNA sequences 的軟體，有些 vector map 會有人已經標好各種 primers 或是 tag，不用自己找自己標，很方便。（有付費版本，可以自己剪貼，但我都用免費只有觀看和標示功能的。）這個也可以用來看定序圖哦，也可以手動改 ATCG。

非洲豬瘟 African Swine Fever

這邊整理一下在加拿大官網上關於非洲豬瘟的幾個重點。


ASF (African swine fever) - fact sheet

• ASF 是由病毒 ASFV (African Swine Fever virus) 引起的，感染的豬隻會發燒、內出血，高傳染率，會快速在豬隻間透過直接和間接的方式傳開，並且死亡率極高。
• ASFV 為雙股 DNA 病毒(dsDNA)，比口蹄疫還難纏，耐高低溫和耐高酸鹼。
• 間接傳染包括經由牧場器具、運輸工具、衣服鞋子和飼料，另外接觸到受感染豬隻的糞便和皮膚，還有食用受感染豬隻製成的食物、飼料也會被傳染。
• 以下情況下仍具有感染性：11 天內的糞便、十五週內的冷凍和冷藏豬肉，三到半年內非高溫煮過的火腿。
• 受感染的豬隻初期並沒有症狀並沒有症狀，因此會成為病毒帶原者到處傳染給其他豬隻。
• ASF 的症狀和平常的豬瘟(classical swine fever)相像，症狀有：高燒、沒食慾、身體虛弱、無法站立、皮膚紅腫、內出血、嘔吐和腹瀉、落胎，和突然死亡。
• 病毒的致死率和病毒株(strains)有關，有的病毒株的致死率是 100%。
• 目前沒有 ASF 的疫苗，並且無法治療。

• 目前沒有證據會傳染給人類，但是會經由人類的衣物傳染給動物，因此如果在疫區接觸過動物，回國後十四天內要避免接觸到動物。


疫區 中國：

• 已多處爆發 ASF 感染和擴散
• 爆發的原因有缺乏衛生安檢措施、野生豬隻密度高、牧場違法販售感染豬隻、用受感染的豬肉餵食豬隻。


擴散途徑：

• ASF 持續出現在非洲幾個國家，持續出現在非洲幾個國家，然自 2007 年開始擴散到中亞，2018 年傳到中國和歐洲幾個國家。
• 高危險傳染媒介為來往歐洲的旅客，病毒可能會經由附著在他們的衣物鞋子上進入加拿大。
• 另一個高危險傳染媒介是除了來往中國的旅客外，還有中國來的飼料和偷帶中國豬肉製品進入加拿大的人。
• 目前加拿大病未發現有 ASF 感染。


加拿大的防疫方法：

• 加拿大食品檢驗局(CFIA)和海關 CBSA 合作，任何從「未確認沒有 ASF 的國家」進來的動物和肉類都需受到嚴格管制。
• 任何從疫區來的豬肉都禁止，目前完全禁制任何從中國來的豬隻、豬肉和豬肉製品。（中國水餃除外，因為已煮熟且 CFIA 已確認安全，並且水餃內的豬肉不是從中國來的。）
• 所有進入加拿大的旅客或居民皆須向海關告知他們在其他國家待的時間和是否去過畜牧場，有的話需告知細節。
• 也必須向海關告知待在加拿大的期間內是否會去造訪畜牧場。
• 如果在進入加拿大境內前有去過他國的畜牧場，在進入加拿大後的五天內不可去任何畜牧場或相關設施。
• 進入加拿大後的五天後，如果衣物、鞋子和儀器設備皆經過消毒兩次後，才可進入加拿大的畜牧場。


CFIA 給加拿大居民和訪客的幾點建議：

• declare at the border if you have been on a farm or are going to a farm (從疫區 — 例如 #中國 — 回來時，如果有去過牧場，需告知海關。)
• declare at the border if you are bringing animal and/or food products (要跟海關申報是否有帶動物或食品)
• avoid contact with animals for at least 14 days after returning to Canada if you have recently travelled to a country where serious diseases exist (including contact with wildlife, farm animals and zoo animals) (如果在疫區有接觸到動物，回國後十四天內要避免接觸動物。)


加拿大的牧場和豬肉製品生產商能做什麼？

• 禁止從他國帶肉類進入加拿大，此為違法行為，熟食和罐頭食品除外。
• 徹底清潔衣物和鞋子
• 不要喂給豬吃人類的廚餘
• 確認牧場工作人員或訪客並未接觸過疫區的動物






Resources:

CFIA / African swine fever - fact sheet

CFIA / Preventing African swine fever from entering Canada

CPC / African swine fever virus and symptoms

CPC / African swine fever in other countries

CPC / Preventing ASF from infecting Canadian pigs

實驗法｜純化蛋白

這篇只是把之前在臉書上寫的整理一下，關於純化帶有 6xHis tag 的蛋白質。

關於真正的純化蛋白，我是今年才學到的，之前做的都只過一個 gravity column，例如 Glutathione column，這篇介紹的是用 Ni-NTA column 來純化 6xHis tag protein，但原理是一樣的。

通常純化蛋白時都會在蛋白的前面加一個 tag，不管是 6xHis, GST 還是 MBP，在 tag 和蛋白中間會有一個 TEV cleavage site (ENLYFQ\S) 是給 TEV protease 切的，它會切在 Q 和 S 中間。

(TEV: Tobacco Etch Virus)

舉例來說，蛋白質可以是這樣：MBP-HHHHHH-ENLYFQ\S-Protein



這邊要注意的是如果要過 His column (也就是 nickel column)，你的蛋白需要帶 6xHis tag。先讓蛋白過 Ni-NTA 把不要的蛋白洗掉，只剩下你的 MBP-6xHis-Protein 會留在 column，然後再用 imidazole 把你的蛋白 elute 出來。



之後加入 TEV protease 把前面的 MBP-6xHis 切掉，然後再過一次 His column 把 MBP-6xHis 挑出來，MBP-6xHis 會留在 column 裡面，而你的蛋白會在出現在 flow-through。

通常蛋白在過了兩次 Ni-NTA 後會乾淨不少，之後想再更乾淨的話可以過 ion exchange column (IEX)，依照蛋白的 pI 質可以過 cation exchange 或是過 anion exchange，通常過到這邊以後已經滿乾淨惹，想再更更更純、更乾淨的話，可以過 size exclusion column (SEC)。

註：之前我都以為 TEV protease 需要用買的，後來到現在的公司後才知道 TEV protease 是可以自己做的呢。把 TEV protease 在 E. coli 裡大量表現後再自己純化，通常只要過一個 His column 後就可以用惹。

上網孤狗也可以找到很多 TEV purification 的 protocol，可以參考 Berkeley University QB3 的步驟，他們是先過一個 Ni-NTA，去鹽後再過 cation exchange column。去鹽的部分可以用 desalting column，也可以用 dialysis，不過我上次純化的時候，在過夜去鹽 dialysis 之後出現 precipitation 的現象，不過我那時也忘了在 dialysis buffer 裡加 BME，不知道跟這有沒有關係。

利用 peptide 檢測早期阿茲海默症

這是一年前的研究了 XD，我在刷臉書的時候看到有興趣但當下沒時間細讀的會先存起來，然後等有時間再打開來看，寫寫分享，然後不知不覺就積了很多沒看的，剛剛翻到這篇才發現竟然已經默默過了一年惹。（淚）

對阿茲海默症有點小了解的大概都知道治療此病的瓶頸主要有兩個，一是無法及早發現，通常發現時，也就是出現輕微失智症狀時(mild cognition impairment, MCI)，已經太晚了，二是藥物無法通過 BBB (blood-brain barrier)，因此目前除了藥物研發的研究，有的是針對如何在症狀未出現時便可即早發現。

動物腦部有一個蛋白是 CTGF (connective tissue growth factor)，主要功能是免疫反應和組織修復，AD 基轉老鼠腦部的 CTGF 會在 Aβ 堆積前出現上升的現象。這篇刊在 Nature Communications 的研究利用 phage display 釣到了一個目標蛋白是 CTGF，長度為九個氨基酸的環形胜肽(cyclic peptide) ，稱為 DAG。

怎麼用 phage display 釣的呢？他們是用 CX7C library，CX7C 是九個氨基酸長的 peptide，第一個和最後一個(也就是第九個)氨基酸是 cysteine，中間七個氨基酸是隨機的，用的是 degenerate codons NNK [註1]。兩端的 Cys 會形成 disulfide bond，使這小段的 peptide 變成一個環狀，用來標靶癌細胞的 iRGD 就是一個例子 [註2]。（iGRD sequence: CRGDKGPDC)

註 1：K = G or T and S = C or G。
CX7C library 製作細節可參考這篇：Tero AH Järvinen 的這篇：Design of Target-Seeking Antifibrotic Compounds

註 2： 之前有不少研究是用 phage display 釣出各個器官的 homing peptides，就是說這些 peptides 只會出現在某些器官，也就是這些器官有其他器官沒有的標靶蛋白或標靶物，可以用來當作器官的 biomarkers。用來穿過癌細胞 iRGD 就是用這個方法找到的，有興趣的可以參考 T Teesalu et al 的這篇：Mapping of Vascular ZIP Codes by Phage Display

關於噬菌體展示 phage display 可以參考之前這篇：Phage display 和小抗體製造

CX7C library 裡的九個氨基酸長的 peptides 會表現在 T7 phage 的表面，研究者們再把這些 T7 phage 靜脈注射到老鼠體內。T7 phage 進到老鼠體內後會到處遊走，其表面的 peptide 其在遊晃的時候便可找尋和它相結合的蛋白質。他們把 T4 library 分別打入正常老鼠(wildtype)和不同階段的 AD 基轉老鼠裡（三個月、五個月、七個月和九個月大的老鼠），然後再取其海馬迴(hippocampus)做比較，看有哪些 peptides 會大量出現在 AD 基轉老鼠的海馬迴裡，但卻沒出現在正常老鼠裡的，表示它的標靶蛋白是 AD 腦部裡的某個蛋白，可用來做為阿茲海默症的 biomarker，或許也可以用在治療上。比較了之後，他們找到惹 DAG (序列為：CDAGRKQKC，通常以前三個氨基酸為名)。

DAG 出現在所有階段的 AD 基轉老鼠腦內，包括皮質(cortex)和海馬迴(hippocampus)，表示早期的 AD 老鼠腦部就有可以作為 biomarker 的蛋白。接著，他們把 DAG 打入基轉 AD 老鼠裡後做了一連串的螢光染色，試圖找出 DAG 的標靶細胞和標靶蛋白，發現它出現在鄰近有 Aβ 的神經星狀膠質細胞(astrocytes)。另外，DAG 也出現在大腦皮質(cerebrocortex)的血管內皮細胞(biomarker: CD31)，而它標靶蛋白是血管內皮細胞上的 CTGF。這個蛋白質表現在人類和老鼠的腦中，功能是啟動發炎反應和組織修復，腦部受傷後 CTGF 的表現量會上升。他們研究了 CTGF 在腦部的表現，發現和正常老鼠相比，它同樣大量表現在 AD 基轉老鼠的大腦皮質和海馬迴，而且也是出現在 astrocytes，他們也做惹 binding 測試，確認 DAG 的標靶的確是 CTGF。

之後，他們檢測了三、四個月大、Aβ 尚未出現的年輕 AD 基轉老鼠腦部，發現 DAG 大量出現在大腦皮質和海馬迴，主要在其血管內皮細胞，表示 DAG 的標靶是 CTGF 而不是 Aβ。為了確認 DAG 不只作用在老鼠腦部細胞，他們用 AD 患者的幹細胞做 binding 測試，是用 DAG-conjugated Ag-nanoparticle (DAG-AgNP) 去染細胞組織，發現可以看到 DAG。用病患的腦部切片測試的話，DAG-AgNP 則出現在含有大量 Aβ 的海馬迴，用螢光染色的話也可以看到 CTGF 同樣出現在海馬迴，表示 DAG 的標靶蛋白是 CTGF。看到這裡可能會覺得證據不夠有力，不過當他們在 DAG-AgNP 之前先加了 anti-CTGF 的抗體後，DAG-AgNP 的訊號就消失了，表示抗體阻斷惹 DAG-CTGF 的結合。 這裡有一點是我想知道，但是文章裡沒提到的，CTGF 在很多神經性疾病中都被發現表現量升高，而在這篇裡顯示疾病初期就可偵測到大量的 CTGF，我的話會想看到在正常老鼠和 AD 基轉老鼠裡，DAG, CTGF 和 Aβ 在三到九個月大的時候，表現量變化的比較。

最後就是 AD 治療的瓶頸，如何把 DAG 送進腦部？他們把 DAG 和帶有氧化鐵 (iron oxide) 的 nanoparticle 結合後，靜脈注射進九個月大的 AD 基轉老鼠裡，發現它可以進入到老鼠的大腦皮質和海馬迴。文章裡提到，這點可以用來做影像檢測 AD，但是 DAG 如果接了染劑或顯影劑後還能進到腦部嗎？



References:

NNR / Potential Biomarker for Early Detection of Alzheimer's (Nov 2017)

AP Mann et al, Identification of a peptide recognizing cerebrovascular changes in mouse models of Alzheimer’s disease. Nature Communications (2017)
https://www.nature.com/articles/s41467-017-01096-0

Tero AH Järvinen, Chapter 12 - Design of Target-Seeking Antifibrotic Compounds. Methods in Enzymology (2012); doi: 10.1016/B978-0-12-391858-1.00013-7

T Teesalu et al, Chapter 2 - Mapping of Vascular ZIP Codes by Phage Display. Methods in Enzymology (2012)